張欣，王福成，韓先干，祁克宗，宋祥軍，董雨豪，蔣蔚*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；3. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)病理生物學(xué)與疫病防控安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036)

阪崎克羅諾桿菌(Cronobactersakazakii)是一種隸屬于腸桿菌科的革蘭陰性菌[1]，曾被稱(chēng)為黃色陰溝桿菌，后更名為阪崎克羅諾桿菌，并設(shè)立新屬克羅諾桿菌屬，該屬包括阪崎克羅諾桿菌(C.sakazakii)、丙二酸克羅諾桿菌(C.malonaticus)、蘇黎世克羅諾桿菌(C.turicensis)、廣泛克羅諾桿菌(C.universalis)、莫氏克羅諾桿菌(C.muytjensii)、康帝蒙提克羅諾桿菌(C.condimenti)和都柏林克羅諾桿菌(C.dublinensis)這7個(gè)種[2]。阪崎克羅諾桿菌作為一種重要的食源性致病菌，廣泛存在于植物、食品加工原料及環(huán)境中，被列為嬰幼兒配方奶粉A類(lèi)致病菌[3]。2002年，阪崎克羅諾桿菌被列為“某種嚴(yán)重危及某些人群生命并遺留終身嚴(yán)重后遺癥的病原體”[4]。由于該菌對(duì)高溫和滲透壓具有較強(qiáng)的抵抗能力，因此在奶粉的加工、放置、沖調(diào)等過(guò)程中可大量存活，容易感染嬰幼兒，特別是免疫力低下的人群，引起腦膜腦炎、梗死性結(jié)腸炎[5]，甚至引起成人的骨髓炎菌血癥和惡性腫瘤，幸存者留有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，嚴(yán)重者有致死可能[6]。正是由于阪崎克羅諾桿菌具有較強(qiáng)致病性，使得該菌成為全世界范圍的研究熱點(diǎn)。

目前阪崎克羅諾桿菌的檢測(cè)方法主要是傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法，但存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、試驗(yàn)步驟繁瑣等缺點(diǎn)，因此，建立便捷、準(zhǔn)確且靈敏度高的檢測(cè)方法尤為重要。目前常用的分子生物學(xué)檢測(cè)手段以PCR[7]和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[8]等為主，雖靈敏度高，但存在引物設(shè)計(jì)復(fù)雜，對(duì)試驗(yàn)操作技能要求較高，且需要昂貴的設(shè)備等問(wèn)題。雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附(double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay，DAS-ELISA)是基于免疫學(xué)分析技術(shù)建立的快速檢測(cè)方法[9]，將已知抗體包被于固相載體，待測(cè)抗原結(jié)合后，再加入檢測(cè)抗體，形成單抗原同時(shí)結(jié)合雙抗體的“夾心”結(jié)構(gòu)，從而特異性檢測(cè)抗原。該法無(wú)需昂貴復(fù)雜的設(shè)備，且具有快速便捷、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用在病毒和細(xì)菌大批量快速檢測(cè)中[10]。

本研究首先制備阪崎克羅諾桿菌效價(jià)高、特異性強(qiáng)的單克隆抗體，在此基礎(chǔ)上建立雙抗夾心ELISA的檢測(cè)方法，以期滿(mǎn)足阪崎克羅諾桿菌免疫學(xué)檢測(cè)的不同需求。

1 材料與方法

1.1 菌株和試劑

阪崎克羅諾桿菌CICC21552、CICC21561、CICC21550，廣泛克羅諾桿菌CICC21570，莫氏克羅諾桿CICC23943，蘇黎士克羅諾桿菌CICC24178，丙二酸克羅諾桿菌CICC21551，都柏林克羅諾桿菌CICC21564，單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)CICC21662購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC9027和金黃色葡萄球菌ATCC6538購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)。阪崎克羅諾桿菌CMCC1.6765購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心。大腸桿菌(Escherichiacoli)O157：H7，副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)SH112和鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium)SL14028由本實(shí)驗(yàn)室保存。

SP2/0缺陷型骨髓瘤細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；4～6周齡昆明小鼠和BALB/c小鼠購(gòu)自上海杰思捷生物有限公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗購(gòu)買(mǎi)自Abcam公司；抗體亞型鑒定試劑盒購(gòu)買(mǎi)自Southern Biotech公司。

1.2 阪崎克羅諾桿菌抗體的制備

1.2.1 免疫及血清效價(jià)的測(cè)定

阪崎克羅諾桿菌標(biāo)準(zhǔn)株在37 ℃震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，PBS梯度稀釋?zhuān)桨逵?jì)數(shù)法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。等量混合4株阪崎克羅諾桿菌標(biāo)準(zhǔn)株，用終濃度為0.3%的甲醛滅活，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整濃度為1.0×1010CFU/mL。首次免疫選用等量弗氏完全佐劑進(jìn)行完全乳化，足墊注射BALB/c小鼠。間隔2周后進(jìn)行再次免疫，此時(shí)細(xì)菌用等量不完全佐劑進(jìn)行乳化，皮下多點(diǎn)注射。四免后間隔1周，將小鼠斷尾采血檢測(cè)效價(jià)。選擇血清效價(jià)在1∶32 000以上的小鼠，取脾細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)行細(xì)胞融合，融合前3 d，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整菌液濃度為5×109CFU/mL，對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔加強(qiáng)免疫。將該阪崎克羅諾桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株按照上述同樣的免疫程序免疫新西蘭白兔，第4次免疫后，耳源靜脈采血并收集血清，利用間接ELISA檢測(cè)方法測(cè)定效價(jià)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照(健康家兔血清)。測(cè)定免疫兔血清OD450值(P)和陰性對(duì)照OD450值(N)，P/N≥2.1判定為陽(yáng)性。

1.2.2 細(xì)胞融合及單克隆抗體腹水的制備、效價(jià)和單抗亞型測(cè)定

無(wú)菌分離小鼠脾臟并收集脾淋巴細(xì)胞，與骨髓瘤SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合及陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞篩選，并經(jīng)亞克隆純化細(xì)胞株，擴(kuò)大培養(yǎng)后經(jīng)小鼠體內(nèi)誘生單抗腹水獲得抗阪崎克羅諾桿菌單克隆抗體。

阪崎克羅諾桿菌CICC21552滅活后PBS洗3次，經(jīng)碳酸鹽緩沖液重懸，調(diào)整菌液濃度至1.0×1010CFU/mL作為抗原包被96孔酶標(biāo)板，通過(guò)間接ELISA方法測(cè)定腹水效價(jià)，P/N≥2.1判定為陽(yáng)性。根據(jù)抗體亞型鑒定試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，測(cè)定單抗的亞型。

1.3 雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法的建立

抗阪崎克羅諾桿菌兔多抗作為包被抗體(100 μL/孔包被酶標(biāo)板)，4 ℃過(guò)夜包被，PBST清洗；每孔加入1%明膠200 μL，37 ℃封閉2 h，PBST清洗；加入檢測(cè)抗原(阪崎克羅諾桿菌菌液)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照(非阪崎克羅諾桿菌菌液)，37 ℃溫育2 h，PBST清洗；加入稀釋后的阪崎克羅諾桿菌單克隆抗體，每孔100 μL，37 ℃溫育2 h，PBST清洗；加入HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗，37 ℃溫育1 h，PBST清洗；加入TMB底物顯色液進(jìn)行顯色，2 mol/L濃硫酸終止反應(yīng)后使用酶標(biāo)儀測(cè)OD450吸光值，P/N≥2.1可判定為陽(yáng)性。

1.4 雙抗夾心ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化

棋盤(pán)稀釋法確定阪崎克羅諾桿菌抗體最佳包被的稀釋度，阪琦克羅諾桿菌兔多抗作為捕獲抗體，包被濃度按照1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000的梯度進(jìn)行稀釋。按照上述試驗(yàn)方法進(jìn)行清洗及封閉，后續(xù)加入檢測(cè)抗原(阪崎克羅諾桿菌菌液濃度為1×107CFU/mL)，阪琦克羅諾桿菌單克隆抗體5B9株作為檢測(cè)抗體，檢測(cè)濃度按照1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000的梯度進(jìn)行稀釋?zhuān)瑫r(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，其他步驟參照1.3。選擇測(cè)定的P/N值最大時(shí)，對(duì)應(yīng)的捕獲抗體和檢測(cè)抗體的稀釋度為最佳使用濃度。

1.5 陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)的確定

使用以上建立的雙抗夾心ELISA 的檢測(cè)方法，取8份陰性樣品用PBS稀釋后，經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450吸光值，并計(jì)算OD450的平均值(X)以及標(biāo)準(zhǔn)方差(SD)，最終得到的陰陽(yáng)性臨界值(X+3SD)。當(dāng)樣本OD450值≥X+3SD時(shí)，判定為陽(yáng)性；當(dāng)樣本OD450值

1.6 雙抗夾心ELISA的特異性和靈敏度測(cè)定

分別用金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門(mén)菌、副溶血弧菌、銅綠假單胞菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和大腸桿菌O157：H7作為檢測(cè)抗原，調(diào)整各菌液的濃度為1×107CFU/mL。測(cè)定建立的雙抗夾心ELISA方法的特異性，并設(shè)置陰性和空白對(duì)照(無(wú)菌水)。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，按1.3中的步驟進(jìn)行檢測(cè)。

用阪崎克羅諾桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌CICC21552作為檢測(cè)抗原進(jìn)行梯度稀釋(1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102和1×101CFU/mL)，測(cè)定雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法的敏感性。顯色結(jié)束用酶標(biāo)儀讀取OD450值。當(dāng)P/N≥2.1時(shí)，可認(rèn)為是該方法的最低檢測(cè)限。

1.7 雙抗夾心ELISA的重復(fù)性試驗(yàn)

使用批內(nèi)差異和批間差異對(duì)建立的阪崎克羅諾桿菌雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行重復(fù)性評(píng)價(jià)。板內(nèi)變異：取不同濃度的阪崎克羅諾桿菌CICC21552進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度在同一塊酶標(biāo)板上作4個(gè)重復(fù)，通過(guò)對(duì)OD450值進(jìn)行分析，計(jì)算板內(nèi)變異系數(shù)。分別在不用時(shí)間段包被酶標(biāo)板，每板做4個(gè)重復(fù)，共包被5次，對(duì)得到的OD450值進(jìn)行分析，計(jì)算板間變異系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 阪崎克羅諾桿菌單克隆抗體制備

2.1.1 雜交瘤細(xì)胞株的融合篩選及克隆

分別收集多次免疫后7 d的小鼠血清，測(cè)其效價(jià)。4免后選擇血清效價(jià)達(dá)到1∶32 000以上的小鼠，收集脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，在HAT的篩選作用下，融合成功的雜交瘤細(xì)胞能夠正常生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞團(tuán)生長(zhǎng)至一定數(shù)量時(shí)，抽取細(xì)胞上清液進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，篩選測(cè)得OD450值在2.0左右的克隆為陽(yáng)性克隆株，并連續(xù)進(jìn)行4次亞克隆篩選，最終篩選出4株能穩(wěn)定分泌高滴度抗體的陽(yáng)性克隆株，命名為3A6、5B9、AC9和EF12。

2.1.2 單克隆抗體 ELISA效價(jià)測(cè)定

采用間接 ELISA方法依次檢測(cè) 4 株單克隆抗體效價(jià)。4株細(xì)胞株的效價(jià)分別為1∶128 000、1∶256 000、1∶32 000和1∶256 000，參照上述血清效價(jià)測(cè)定方法測(cè)定兔血清效價(jià)，結(jié)果顯示抗體效價(jià)隨著免疫次數(shù)的增加明顯升高，效價(jià)達(dá)到1∶128 000(表1)。

表1 雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清液抗體效價(jià)(OD450值)

2.1.3 單克隆抗體的亞型測(cè)定

結(jié)果顯示，4種抗體的輕鏈類(lèi)型皆為Kappa型，單抗細(xì)胞株3A6、5B9和2B6重鏈均為IgG1，細(xì)胞株EF12重鏈為IgG2a(表2)。

表2 單克隆抗體的亞型鑒定(OD450值)

2.2 雙抗夾心ELISA方法的建立

通過(guò)棋盤(pán)法對(duì)捕獲抗體和檢測(cè)抗體稀釋比例進(jìn)行確定，選擇阪崎克羅諾桿菌兔多抗作為捕獲抗體，阪崎克羅諾桿菌單克隆抗體5B9株作為檢測(cè)抗體，HRP標(biāo)記羊抗鼠作為酶標(biāo)二抗。結(jié)果顯示(圖1)，當(dāng)阪崎克羅諾桿菌兔多抗的稀釋倍數(shù)為1∶4 000倍，且阪崎克羅諾桿菌單克隆抗體5B9株稀釋倍數(shù)為1∶1 000倍時(shí)的P/N值最大，且陰性值為0.091 8，符合陰性值較小的條件。因此，選擇捕獲抗體最佳的稀釋比例為1∶4 000，檢測(cè)抗體的最佳稀釋比例為1∶1 000。

圖1 捕獲抗體和檢測(cè)抗體最佳工作濃度的優(yōu)化

2.3 雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法陰陽(yáng)臨界值的確定

由表3可見(jiàn)，采用優(yōu)化以后的阪崎克羅諾桿菌雙抗夾心ELISA方法，檢測(cè)得到的8份陰性抗原的OD450平均值(X)為0.113 7，求得SD為0.015 3，按照公式最終求得的臨界值為0.159 6，當(dāng)樣本OD450值≥0.159 6，同時(shí)滿(mǎn)足P/N≥2.1時(shí)，判定為陽(yáng)性；否則，判定為陰性。

表3 雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法陰性樣品的OD450值

2.4 雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法的特異性

用上述建立的雙抗夾心ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞株上清液抗體和腹水抗體，結(jié)果表明，抗阪崎克羅諾桿菌單克隆抗體僅能與試驗(yàn)中克羅諾桿菌屬的細(xì)菌(蘇黎士克羅諾桿菌CICC24178、丙二酸克羅諾桿菌CICC21551、莫氏克羅諾桿菌CICC23943、廣泛克羅諾桿菌CICC21570、都柏林克羅諾桿菌CICC21564)發(fā)生反應(yīng)，而不能和其他6種常見(jiàn)的食源性細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門(mén)菌、副溶血弧菌、銅綠假單胞菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和大腸桿菌 O157：H7)發(fā)生交叉反應(yīng)(圖2)。

圖2 雙抗體夾心ELISA的特異性

2.5 雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法的靈敏度

雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法的敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明(表4)，該方法最低檢測(cè)限可以達(dá)到1×106CFU/mL(P/N值大于2.1)，建立的雙抗夾心ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在1×106～1×108CFU/mL 檢測(cè)范圍內(nèi)具有線(xiàn)性關(guān)系(R2=0.950 7)(圖3)。

圖3 雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限

表4 雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法敏感性確定

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

2.6.1 板內(nèi)變異系數(shù)

板內(nèi)變異系數(shù)結(jié)果顯示，板內(nèi)變異系數(shù)最小為4.57%，最大為12.62%，最大值不超過(guò)15%，因此具有良好的重復(fù)性，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 板內(nèi)變異系數(shù)的確定

2.6.2 板間變異系數(shù)

板間變異系數(shù)結(jié)果顯示，板間變異系數(shù)最小為4.78%，最大為11.14%，最大值不超過(guò)15%，因此具有良好的板間重復(fù)性，見(jiàn)表6。

表6 板間變異系數(shù)的確定

3 討論

阪崎克羅諾桿菌免疫學(xué)檢測(cè)方法主要有膠體金試紙條[11]、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫磁珠[12]等，這些檢測(cè)方法的適用性與所制備抗體的性能密切相關(guān)。因此，獲得高親和性和特異性的單克隆抗體對(duì)免疫檢測(cè)方法的建立尤為重要。

國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)及進(jìn)出口乳品檢驗(yàn)檢疫條例中明確規(guī)定，嬰兒乳制產(chǎn)品中不得檢出阪崎克羅諾桿菌[13]?？肆_諾桿菌屬包含阪崎克羅諾桿菌等7個(gè)種，且均具有致病性。本研究最終篩選出的單克隆抗體對(duì)克羅諾桿菌屬6個(gè)菌種均具有陽(yáng)性反應(yīng)，且對(duì)其他的食源性致病菌均沒(méi)有交叉反應(yīng)，特異性良好，為建立針對(duì)阪崎克羅諾桿菌的免疫學(xué)檢測(cè)方法打下良好基礎(chǔ)。

基于單抗的免疫檢測(cè)方法，如免疫膠體金層析法、ELISA、間接免疫熒光檢測(cè)方法等，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)等相關(guān)臨床診斷[14-16]。該免疫學(xué)檢測(cè)方法可以進(jìn)行定性或定量檢測(cè)，具有高效，專(zhuān)一性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已成功用于很多重要致病菌的快速檢測(cè)，如肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)[17]，沙門(mén)菌(Salmonella)[18]和嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)[19]等。與Song等[20]和丁銘[21]建立的阪崎克羅諾桿菌免疫檢測(cè)試紙條法相比，本研究建立的雙抗夾心ELISA方法的檢測(cè)限可達(dá)1.0×106CFU/mL，提高了近10倍，具有更高的靈敏性。此外，本研究建立的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法具有良好的特異性，能快速檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌屬6個(gè)重要的致病性菌種，且不和其他常見(jiàn)的食源性病原菌發(fā)生交叉反應(yīng)，為阪崎克羅諾桿菌的快速檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

綜上，本研究建立的阪崎克羅諾桿菌雙抗夾心ELISA方法，具有特異性強(qiáng)、檢測(cè)結(jié)果直觀(guān)、試驗(yàn)操作便捷等優(yōu)點(diǎn)，且檢測(cè)成本較低，可在基層檢測(cè)中使用。該方法的建立為阪崎克羅諾桿菌的免疫學(xué)檢測(cè)提供有力工具，具有極大的應(yīng)用前景。