賴文韜，余茂林，姜中其

(浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

大腸桿菌(Escherichiacoli)是一種常見的奶牛乳房炎病原體，可導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量減少、乳品質(zhì)下降以及提高淘汰率、死亡率。該菌主要的毒力因子脂多糖(LPS)可以引發(fā)內(nèi)毒素休克和免疫反應(yīng)，促進炎癥因子的表達并影響抗菌藥物的功效[1]。此外，大腸桿菌通過形成生物被膜(BBF)加強了對宿主免疫系統(tǒng)和抗菌藥物的耐受性[2]。因此，研究新的治療辦法十分必要。

木糖醇是一種天然的五碳糖醇，具有許多優(yōu)良的特性，包括能夠替代蔗糖作為天然的甜味劑以及防止齲齒等[3]。在畜牧業(yè)中，木糖醇可用于治療奶牛酮病[4-5]，促進免疫應(yīng)激狀態(tài)下肉雞生長[6-7]等。有研究顯示，木糖醇能夠抑制許多病原菌的生長和附著，如大腸桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌和沙門菌等[8]，不僅能干預(yù)生物被膜的形成，而且也能破壞已經(jīng)成熟的生物被膜[9]?？咕?AMPs)是一種小分子多肽類生物活性物質(zhì)，是宿主先天性免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分。抗菌肽帶正電荷，能夠與LPS靜電結(jié)合并破壞細胞膜的完整性。研究表明，某些抗菌肽具有抗生物被膜的特性，能夠破壞生物被膜并防止其形成?？咕膸д姾桑軌蚺c脂多糖靜電結(jié)合并破壞細胞膜的完整性[10]。通過比較一系列具有抗BBF活性的AMPs，篩選出抗菌肽1037(KRFRIRVRV)，研究表明，其抗BBF活性最強，在低濃度(1/2 MIC)下，能使BBF形成減少78%[11]。

本試驗分析木糖醇聯(lián)用抗菌肽1037對大腸桿菌生物被膜最小抑菌濃度(MBIC)和最小殺菌濃度(MBEC)的影響，并進一步探究2種藥物聯(lián)合應(yīng)用對大腸桿菌生物被膜的作用。研究結(jié)果可為臨床治療大腸桿菌引起的奶牛乳房炎及耐藥性的控制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

木糖醇(USP grade，批號：XB0997)，生工生物工程(上海)股份有限公司；抗菌肽1037(氨基酸序列為：KRFRIRVRV，通過標準固相方法合成，反相高效液相層析檢測純度均為99%以上)，吉爾生化生物科技有限公司；血瓊脂平板、剛果紅、結(jié)晶紫，生工生物工程(上海)股份有限公司；Luria-Bertani(LB)肉湯培養(yǎng)基、Nutrient Broth(NB)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、腸桿菌科細菌生化試驗管，杭州濱河微生物試劑有限公司；乙醇、戊二醛、鋨酸，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

卡爾加里生物被膜發(fā)生裝置，光景生物科技(蘇州)有限公司；聚氯乙烯(PVC)薄片，迎佳橡膠絕緣材料廠；ZEISS Gemini SEM 300場發(fā)射掃描電子顯微鏡，卡爾蔡司(上海)管理有限公司；Hitachi HCP-2型臨界點干燥儀，日本日立公司。

1.3 菌株分離鑒定

采集杭州地區(qū)近江、富倫、正興等6個規(guī)模較大的奶牛場奶樣共200份，劃線接種于血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，再挑取單菌落至麥康凱平板，37 ℃培養(yǎng)24 h；挑取麥康凱平板上的單菌落革蘭染色后鏡檢，同時進行生化試驗。之后采用PCR法鑒定大腸桿菌，根據(jù)文獻報道的PCR引物[12]，引物序列為F：5′-ATCAACCGAGATTCCCCCAGT-3′，R：5′-TCACTATCGGTCAGTCAGGAG-3′，擴增目標條帶232 bp，引物由生工生物工程有限公司(上海)股份有限公司合成。

1.4 藥液配制

取抗菌肽溶于無菌去離子水，配制成4 098 μg/mL的儲備液；取木糖醇溶于LB肉湯，配制成5%的儲備液，121 ℃高溫高壓滅菌后冷卻備用。

1.5 菌懸液制備

將大腸桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，調(diào)整濃度為0.5個麥氏濁度，作為生物被膜待接種菌懸液備用。

1.6 生物被膜形成能力的測定

1.6.1 剛果紅(CRA)定性檢測

將菌懸液劃線接種于剛果紅瓊脂平板37 ℃培養(yǎng)24 h，置室溫72 h，觀察菌落的顏色和形態(tài)。粗糙、干燥、水晶樣的黑色菌落判定為被膜陽性菌株；紅色光滑型菌落為生物被膜陰性菌株。

1.6.2 結(jié)晶紫(SQAA)半定量檢測

將菌懸液加入卡爾加里生物被膜發(fā)生裝置平板的孔中，以LB肉湯為陰性對照，37 ℃培養(yǎng)48 h；將平板中液體移除，無菌生理鹽水充分漂洗除去浮游菌，室溫干燥后用95%乙醇固定5 min；再用1%結(jié)晶紫染色5 min；用滅菌生理鹽水漂洗除去剩余的染液；再用35%乙醇脫色30 min，釋放釘柱板上生物被膜中的結(jié)晶紫；測定570 nm波長處的吸光值。重復(fù)3次，OD值取3組平均值。OD570 nm≥0.1的為生物被膜陽性菌株，OD570 nm<0.1的為生物被膜陰性菌株。

1.7 MBIC的測定

選擇CRA與SQAA檢測中均呈現(xiàn)生物被膜陽性的大腸桿菌臨床分離株ZX-45，參考虞惠貞[9]的方法，進行MBIC、MBEC的測定以及藥物干預(yù)生物被膜試驗。

2個月規(guī)培結(jié)束后,對PBL組及SBME-PBL組學(xué)員進行理論知識與實踐成績考核,實踐考核主要包括病例分析與神經(jīng)系統(tǒng)檢查結(jié)果的評估。并由學(xué)員填寫問卷調(diào)查表,問卷內(nèi)容包括是否有助于提高自學(xué)能力、學(xué)習(xí)興趣、臨床思維能力、知識的系統(tǒng)性掌握、臨床實踐的適應(yīng)操作能力、基礎(chǔ)知識的掌握、團隊協(xié)作能力等。各項調(diào)查回答為同意或不同意,兩組問卷結(jié)果以百分比形式呈現(xiàn)。

①取生物被膜待接種菌液，200 μL/孔加入MBEC發(fā)生裝置板的96孔里，共加入2排，蓋上釘柱蓋，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)生物被膜；②棄去培養(yǎng)液，用無菌生理鹽水小心沖洗釘柱蓋的釘子，除去浮游菌；③另取1塊新的MBEC發(fā)生裝置板，第1排每孔加入100 μL無菌LB培養(yǎng)基，取100 μL抗菌肽加入第1孔，混合均勻后，連續(xù)2倍倍比稀釋至第12孔，使每孔抗菌肽濃度為1～2 048 μg/mL；第2排孔加入100 μL無菌5%木糖醇-LB培養(yǎng)基，取100 μL抗菌肽同法稀釋，使每孔抗菌肽濃度為1～2 048 μg/mL；④將沖洗好的釘柱蓋蓋到加有藥品的MBEC發(fā)生裝置板上，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h；⑤肉眼觀察MBEC發(fā)生裝置板，培養(yǎng)液澄清無菌生長的孔最低稀釋度藥物濃度為MBIC。

1.8 MBEC的測定

從MBEC板上表現(xiàn)澄清未長菌的孔里，每孔吸取100 μL培養(yǎng)液涂于NB瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，平板菌落數(shù)小于5的最低稀釋度作為MBEC。

1.9 木糖醇和抗菌肽對成熟大腸桿菌干預(yù)的掃描電鏡觀察

1.9.1 生物被膜的培養(yǎng)

①取12孔細胞培養(yǎng)板，放入PVC；②取3 mL大腸桿菌菌懸液加入4孔，另外1孔加入3 mL無菌LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h；③另取1塊新的12孔細胞培養(yǎng)板，分別向?qū)?yīng)孔里加入3 mL無菌液體LB培養(yǎng)基，3 mL 5%木糖醇-LB培養(yǎng)基，3 mL抗菌肽-LB培養(yǎng)基(濃度為MBIC)，3 mL抗菌肽-5%木糖醇LB培養(yǎng)基(濃度為MBIC)；④將步驟②中培養(yǎng)的PVC薄片用無菌鑷子取出，生理鹽水沖洗正反面，然后正面朝上，放入步驟③中加有新培養(yǎng)基的12孔細胞培養(yǎng)板里，將步驟②中加無菌液體培養(yǎng)基作對照培養(yǎng)的PVC板放入步驟③的無菌液體培養(yǎng)基中，37 ℃，培養(yǎng)24 h。

1.9.2 掃描電鏡觀察的前處理

取1塊新的96孔板，每孔加入3 mL 2.5%戊二醛；取出PVC薄片，正面朝上，放入戊二醛里，4 ℃，過夜固定；按掃描電鏡要求進行處理后，在Hitachi HCP-2型臨界點干燥儀中進行干燥、鍍膜，最后在ZEISS Gemini SEM 300場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離鑒定

從200份乳房炎奶樣中共分離出303株細菌，經(jīng)麥康凱培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)、革蘭染色、生化試驗以及PCR，鑒定出大腸桿菌98株。麥康凱培養(yǎng)基上分離出的菌落邊緣整體成圓形、粉紅色(圖1)；革蘭染色鏡檢呈兩端鈍圓、散在或成對存在、紅色的革蘭陰性直短桿菌(圖2)；生化試驗結(jié)果見表1，除尿素、苯丙氨酸、枸櫞酸鹽及硫化氫呈陰性外，其余均呈陽性，符合大腸桿菌生化特性；PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳見圖3，陽性對照和所有臨床分離株均擴增出232 bp的目標條帶，而陰性對照未見任何條帶。

表1 分離菌株生化特性鑒定結(jié)果

圖1 分離菌落形態(tài)(麥康凱瓊脂平板)

圖2 革蘭染色鏡檢形態(tài)(400×)

M.DNA標準DL1000；1. 陰性對照；2. 陽性對照；3～6. 分離菌株。

2.2 大腸桿菌生物被膜形成能力的測定

大腸桿菌生物被膜形成能力測定結(jié)果如圖4所示，根據(jù)剛果紅平板觀察(圖5)，98株臨床分離株中，生物被膜陽性菌株有57株，生物被膜陰性菌株有41株。根據(jù)OD570 nm測定結(jié)果，生物被膜陽性菌株有67株，生物被膜陰性菌株有31株。

圖4 大腸桿菌生物被膜形成能力

A.生物被膜陽性菌株；B.生物被膜陰性菌株。

2.3 木糖醇和抗菌肽對成熟大腸桿菌生物被膜的MBIC和MBEC

抗菌肽1037對大腸桿菌生物被膜單獨作用的MBIC和MBEC相對較高，但是結(jié)合5%木糖醇以后，其MBIC和MBEC都明顯降低。

2.4 木糖醇和抗菌肽對成熟大腸桿菌生物被膜干預(yù)的掃描電鏡觀察

通過圖6的觀察可知，空白對照組中的大腸桿菌數(shù)量較多，且表面覆蓋了黏稠的膜狀物，提示其形成了明顯的生物被膜。在5%木糖醇處理組中，在低倍鏡下可見大腸桿菌數(shù)量有輕微減少，高倍鏡下見菌體表面的膜狀物較空白對照組稍薄，菌體間呈現(xiàn)出絲狀連接的特點。在抗菌肽處理組中，細菌數(shù)量較空白對照組和5%木糖醇處理組明顯減少，且菌體的短桿形態(tài)基本正常，表面沒有黏稠的生物被膜覆蓋，菌體間呈現(xiàn)出絲狀連接的特點，甚至可見部分被破壞的菌體。在5%木糖醇聯(lián)用抗菌肽處理組中，細菌數(shù)量較空白對照組和5%木糖醇處理組明顯減少，表面沒有黏稠的生物被膜覆蓋，絲狀連接較抗菌肽處理組明顯減少，菌體變形嚴重，呈現(xiàn)出短球狀、長桿狀、桿狀等不同形態(tài)，且可見裂解的菌體碎片。

圖6 大腸桿菌生物被膜掃描電鏡觀察

綜上可以得出以下結(jié)論：木糖醇和抗菌肽聯(lián)用能夠減少大腸桿菌的數(shù)量并破壞生物被膜的形成，其中抗菌肽能夠更有效地抑制大腸桿菌的數(shù)量，并且能夠破壞菌體表面的生物被膜。同時，聯(lián)用處理還可能導(dǎo)致大腸桿菌菌體的形態(tài)變化和菌體碎片的產(chǎn)生。

3 討論

大腸桿菌廣泛存在于奶牛的體表和環(huán)境中，是引起奶牛乳房炎的主要環(huán)境性致病菌。在早先的研究中，Yu等[13]收集了我國4個地區(qū)的750份來自乳房炎病例的牛源奶樣，大腸桿菌分離率為11.1%。廖智慧等[14]報道，衡水地區(qū)乳源大腸桿菌的分離率為33.3%，而本研究發(fā)現(xiàn)杭州地區(qū)的乳源大腸桿菌分離率高達49%，高于之前的報道。此外，我們還發(fā)現(xiàn)大腸桿菌在杭州地區(qū)的奶牛群體中的流行率為32.2%，高于陜西省西安、楊凌、寶雞和咸陽地區(qū)的流行率(15.8%)[15]，但低于河北規(guī)?；膛龅牧餍新?64.28%)[16]。李芬等[17]從患乳房炎的牛奶樣中分離的35株大腸桿菌發(fā)現(xiàn)，BBF陽性率為54.29%，本試驗測得臨床分離的大腸桿菌中有58.2%為BBF陽性菌株，與該報道結(jié)果接近。此次研究對大腸桿菌的流行情況以及BBF形成能力進行了更深入地了解。

近年來，細菌性奶牛乳房炎治療越來越困難，細菌耐藥性的產(chǎn)生是主要原因之一，而BBF形成又為細菌的生存提供了一層保障，為疾病的治療增加了難度?？咕氖撬拗飨忍煨悦庖叻烙到y(tǒng)產(chǎn)生的一類抵抗外界病原體感染的小分子多肽類生物活性物質(zhì)，具有一定的抗菌作用以及抗生物被膜作用[18-20]。天然抗菌肽通常是由12～60個氨基酸組成的小分子陽離子多肽[21]，F(xiàn)uente-Núez等[11]發(fā)現(xiàn)一系列具有抗BBF活性的抗菌肽，一級結(jié)構(gòu)中均有序列(FRIRVRV)，以此為基礎(chǔ)合成了僅由9個氨基酸組成的抗菌肽1037(KRFRIRVRV)，在保持其抗BBF活性的情況下，盡量減少了肽的大小，研究顯示，抗菌肽1037能顯著減少革蘭陰性(銅綠假單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌)和革蘭陽性(李斯特菌)細菌BBF形成。本研究表明，抗菌肽1037能明顯減少大腸桿菌BBF形成，體現(xiàn)出的抗BBF作用與以上結(jié)果相一致，抗菌肽1037與其他具有抗菌特性的藥物聯(lián)用有一定的開發(fā)前景。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)5%木糖醇聯(lián)用抗菌肽1037在降低大腸桿菌對抗菌肽1037耐藥性方面具有協(xié)同作用。與單獨使用抗菌肽1037相比，聯(lián)用后的抗菌效果明顯增強，菌體的絲狀連接更少，菌體嚴重變形甚至破裂，呈現(xiàn)出短球狀、長桿狀、桿狀等不同形態(tài)。虞惠貞[9]研究發(fā)現(xiàn)，5%木糖醇聯(lián)用環(huán)丙沙星和恩諾沙星后，同樣可以顯著降低抗菌藥物MBIC以及MBEC。有研究指出，木糖醇可以擴散到BBF內(nèi)部，積累形成一種有毒的非代謝糖醇磷酸，從而抑制細菌生長或者BBF中應(yīng)激蛋白的產(chǎn)生，表現(xiàn)出明顯的抗BBF活性[22-24]。由于抗菌肽作用方式與常規(guī)抗生素不同，其靶向細菌膜，產(chǎn)生膜不穩(wěn)定或形成穿膜孔，最終導(dǎo)致細胞破裂[25]。因此，在聯(lián)用抗生素時，抗菌肽1037有可能促進抗生素進入細菌細胞，增強其殺菌效果。如寧亞維等[26]研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽brevilaterin與檸檬酸可通過破環(huán)細胞膜的完整性與降解菌體DNA以發(fā)揮協(xié)同抑制大腸桿菌的作用。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌在杭州地區(qū)奶牛乳房炎病例中分離率和BBF陽性率較高，抗菌肽1037能夠明顯減少大腸桿菌對生物被膜的形成，而5%木糖醇能夠協(xié)同增強抗菌肽1037對細菌的殺菌作用并破壞已形成的生物被膜。聯(lián)用抗菌肽和木糖醇或其他抗生素，有望用于臨床上大腸桿菌引起的奶牛乳房炎治療及生物被膜的清除。此外，抗菌肽1037是否通過破壞細菌細胞膜為木糖醇進入細菌創(chuàng)造了條件，值得進一步深入研究。