李村富,浦秀麗,李春芳,蔣宏,何俊

(1.中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所 中國(guó)西南野生生物種質(zhì)資源庫(kù),云南 昆明 650201;2.云南省林業(yè)和草原科學(xué)院,云南 昆明 650201)

蘭科(Orchidaceae)是被子植物中的最大科之一,全世界記錄約有736屬28 000多種[1],部分物種具有重要的觀賞、藥用、食用、科研和文化等價(jià)值,備受人們關(guān)注[2-3]。近年來(lái)其野生植物資源遭到過(guò)度采集,在自然條件下種子萌發(fā)又依賴真菌等因素導(dǎo)致蘭科植物成為植物保育中的“旗艦”類群[4]。在最新頒布的《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》(2021年)收錄的1 101種野生植物中,蘭科植物占比近約1/3[5]。蘭科植物種子小如“粉塵”,大部分物種的果莢內(nèi)有數(shù)量驚人的種子,以種子庫(kù)的方式保存蘭科種質(zhì)資源具有占用空間小、花費(fèi)少、同時(shí)能保存大量種類和遺傳多樣性等優(yōu)勢(shì),是蘭科植物保護(hù)的理想途徑[6-8]。

種子生活力檢測(cè)是建設(shè)蘭科植物種子庫(kù)等遷地保護(hù)工作必不可少的環(huán)節(jié)[8]。目前,蘭科植物種子生活力檢測(cè)方法主要有四氮唑法(TTC)、熒光素雙醋酸酯染色法(FDA)、紫外分光光度計(jì)法(UVS)、埃文斯藍(lán)染色法(Evans blue,EB)、萌發(fā)測(cè)定法等[8-10]。其中,TTC法是最常用的種子生活力測(cè)試方法之一,因檢測(cè)快速常用于一些萌發(fā)耗時(shí)長(zhǎng)的物種種子生活力測(cè)定[8]。然而,某些蘭科物種具有深色或堅(jiān)硬種皮,甚至同一物種的不同居群存在生態(tài)型的分化等原因均可能導(dǎo)致TTC法檢測(cè)的結(jié)果出現(xiàn)差異,例如不同地理來(lái)源的美須蘭(原變種)(Calopogontuberosusvar.tuberosus)種子,北方居群的種皮較南方種群厚,滲透性更差,TTC法對(duì)南方居群提供了相對(duì)準(zhǔn)確的生活力評(píng)估[11-12]。和TTC法一樣,FDA法也屬于酶促種子生活力檢測(cè)方法,但由于一些酶活性在細(xì)胞死亡后也有可能持續(xù)存在,從而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性[8,13-14]。UVS是在電導(dǎo)率測(cè)定法的基礎(chǔ)上改進(jìn)的方法,實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單快捷,但需要與萌發(fā)率聯(lián)合分析,而不能直觀地給出檢測(cè)結(jié)果[15]。EB法是基于細(xì)胞膜的完整性,阻止細(xì)胞外的EB染色劑進(jìn)入細(xì)胞來(lái)判斷種子生活力,屬于非酶促種子生活力檢測(cè)法[8,16],相較于TTC法和FDA法,EB法不依賴酶活性,結(jié)果更加穩(wěn)定和可靠,卻需要豐富的操作經(jīng)驗(yàn)[8,17]。萌發(fā)測(cè)定法常常需要與其他測(cè)定方法聯(lián)用[9],往往耗時(shí)較長(zhǎng)。地生蘭種子非共生萌發(fā)時(shí)間比附生蘭更長(zhǎng)[12],檢測(cè)結(jié)果又極易受到非共生萌發(fā)操作時(shí)滅菌試劑種類和滅菌時(shí)間的影響。蘭科種子滅菌過(guò)程中滅菌試劑在清除種子表面污染的同時(shí)也會(huì)滲透種皮并對(duì)種胚造成傷害,從而降低種子生活力[8]。不同物種種皮滲透性不同,附生蘭種子往往比地生蘭種子更具滲透性[18],表現(xiàn)出種子滅菌耐受性的差異。篩選一種便捷、高效的蘭花植物種子生活力檢測(cè)和滅菌方法對(duì)其保存、生活力評(píng)估和物種保護(hù)都具有重要意義。

金耳石斛(Dendrobiumhookerianum)和長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭(Vandalongitepala)是主要分布于高黎貢山生物多樣性熱點(diǎn)地區(qū)的2種附生蘭。其中,金耳石斛被列為國(guó)家Ⅱ級(jí)保護(hù)野生植物(2021版)[5],瀕危等級(jí)為易危(Vulnerable,VU)[19];長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭為本文作者近年發(fā)現(xiàn)于云南省怒江傈僳族自治州高黎貢山地區(qū)的新紀(jì)錄種。石斛屬和萬(wàn)代蘭屬植物由于在花型、花色、唇瓣上的多樣性,具備重要園藝觀賞價(jià)值[20-21]。金耳石斛還具有較高的藥用價(jià)值,由于受到長(zhǎng)期掠奪式采挖,野生資源遭受嚴(yán)重破壞[22]。本研究通過(guò)采用TTC法和非共生萌發(fā)測(cè)定法相結(jié)合測(cè)定各自的種子生活力,比較2種方法的測(cè)定結(jié)果,以期篩選出一種便捷、高效的測(cè)定附生蘭種子生活力的通用方法,為蘭科植物的收集保存及可持續(xù)利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為金耳石斛和長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭,見(jiàn)圖1。

圖1 金耳石斛和長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭的開(kāi)花植株

金耳石斛(圖1a)為國(guó)家重要野生植物種質(zhì)資源庫(kù)聯(lián)盟成員于2020年在高黎貢山收集的同一居群剛要開(kāi)裂的蒴果,長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭(圖1b)為云南省林業(yè)和草原科學(xué)院蔣宏研究員于2019年從高黎貢山收集引種的同一居群植株,種植于云南省林業(yè)和草原科學(xué)院溫室,人工異花授粉獲得的蒴果。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分別取出2個(gè)種的多個(gè)蒴果中的種子,按種混勻后均勻平鋪到培養(yǎng)皿中的濾紙墊層上,置于盛有飽和氯化鋰(LiCl)溶液的干燥器中,在20℃條件下干燥4 d[7]。

1.2 方法

1.2.1 種子表面滅菌

前期進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選不同滅菌試劑的滅菌時(shí)間并設(shè)定梯度(金耳石斛:75%酒精滅菌處理2、4、6、8、10 min,0.1% HgCl2滅菌處理4、8、12、16、20 min,2% NaClO滅菌處理4、8、12、16、20 min,1% NaDCC滅菌處理10、20、30、40、60 min。長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭:75%酒精滅菌處理2、4、6、8、10 min,0.1%HgCl2滅菌處理30、60、90、120、150 s,2% NaClO滅菌處理30、60、90、120、150 s,1% NaDCC滅菌處理10、20、30、40、60 min)。種子滅菌處理期間,純化柱上下顛倒及輕微搖晃,使種子與滅菌溶液充分接觸,結(jié)束后,600～800 rpm離心1 min,去滅菌液,然后無(wú)菌水漂洗4～5次,再用1 mL移液槍取600 μL無(wú)菌水加入吸附柱中,反復(fù)吸打使之呈種子懸浮液,吸取400 μL種子懸浮液播種到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基上,接種15個(gè)培養(yǎng)皿,試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 種子生活力測(cè)定

1.2.2.1 非共生萌發(fā)測(cè)定種子生活力

用小藥匙分別取干燥后的金耳石斛和長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭適量種子裝入無(wú)菌DNA純化柱(經(jīng)121℃,滅菌20 min,規(guī)格:吸附柱1 mL,收集管2 mL)中,標(biāo)記代號(hào),加入600 μL無(wú)菌水,浸泡24 h。在超凈工作臺(tái)中,600～800 rpm離心1 min,去無(wú)菌水,分別加入700 μL 75% 酒精[23]、0.1% HgCl2(升汞)[24]、2% NaClO[12](次氯酸鈉,有效氯10%,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)和1% NaDCC[6](優(yōu)氯凈,上海麥克林生化科技股份有限公司),另設(shè)一組全程僅用無(wú)菌水處理的干燥后種子作為對(duì)照

1.2.2.2 TTC染色法測(cè)定種子生活力

將接種后純化柱中剩余的種子600～800 rpm離心1 min,去無(wú)菌水,加入800 μL 1% TTC溶液,在溫度30℃,黑暗條件下處理24 h[25],無(wú)菌水漂洗5次,加入600 μL無(wú)菌水制成種子懸浮液,取200 μL于載玻片上置于蔡司體視顯微鏡(SteREO Discovery.V8)下,隨機(jī)挑選3個(gè)視野,觀察種子染色情況,有生活力種胚被染成不同程度的紅色,無(wú)生活力種子種胚不著色,分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野的種子總數(shù)和有生活力種子總數(shù),并計(jì)算種子生活力[8]。

1.2.3 種子萌發(fā)培養(yǎng)

金耳石斛種子萌發(fā)培養(yǎng)基采用MS+0.5 mg/L NAA +20 g/L蔗糖+10% 椰子汁+8 g/瓊脂[10](1182KG001,600-1 300 g/cm2,BioFroxx,下同),長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭種子萌發(fā)培養(yǎng)基為1/2 MS+ 20 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂+1 g/L活性炭[26],pH值5.8～6.0。置于光照強(qiáng)度1 600～2 000 Lx,光照時(shí)間12 h/d,溫度23±2℃條件下培養(yǎng)。

1.3 數(shù)理統(tǒng)計(jì)

將培養(yǎng)7～10 d后的培養(yǎng)皿置于蔡司體視顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視眼,種子種胚吸脹膨大記為萌發(fā)[27-28],計(jì)算種子萌發(fā)率。污染材料也計(jì)入萌發(fā)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

數(shù)據(jù)處理所需公式:

污染率(%)=污染培養(yǎng)皿數(shù)/接種培養(yǎng)皿總數(shù)×100%

染色率(%)=著色種子數(shù)/統(tǒng)計(jì)種子總數(shù)×100%

萌發(fā)率(%)=萌發(fā)種子數(shù)/統(tǒng)計(jì)種子總數(shù)×100%

采用Excel 2021軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理,SPSS 27.0.1軟件對(duì)接種污染率、種子TTC染色率和萌發(fā)率作單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 非共生萌發(fā)測(cè)定種子生活力

2.1.1 75%酒精對(duì)種子萌發(fā)率的影響

以無(wú)菌水處理的對(duì)照組金耳石斛和長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭污染率分別為42.22%和40%,萌發(fā)率為97.34%和89.34%。種子經(jīng)75%酒精滅菌2、4、6、8、10 min后的萌發(fā)率見(jiàn)表1。滅菌2 min后,金耳石斛和長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭種子都達(dá)到較好的滅菌效果,隨著滅菌時(shí)間的增加,經(jīng)方差分析金耳石斛種子萌發(fā)率與對(duì)照相比沒(méi)有顯著性差異。長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭處理2 min后,種子萌發(fā)率為35.21%與對(duì)照相比極顯著下降,處理10 min時(shí),降到4%以下。滅菌試劑對(duì)長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭種胚造成了傷害,影響種子萌發(fā)率。

2.1.2 0.1% HgCl2對(duì)種子萌發(fā)率的影響

金耳石斛種子在0.1% HgCl2條件下滅菌0、4、8、12、16、20 min后的萌發(fā)率見(jiàn)表1。種子滅菌處理16 min內(nèi)與對(duì)照相比萌發(fā)率沒(méi)有顯著性差異,處理20 min后,種子萌發(fā)率有顯著下降,但種子萌發(fā)率仍然在90%以上。萌發(fā)試驗(yàn)中金耳石斛用0.1% HgCl2滅菌時(shí)間應(yīng)控制在16 min以內(nèi)。長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭在滅菌處理30～150 s后,種子最高萌發(fā)率只有1.66%,滅菌試劑可能對(duì)種胚造成了極大傷害,長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭不適合用0.1% HgCl2作為滅菌試劑。

2.1.3 2% NaClO對(duì)種子萌發(fā)率的影響

用2% NaClO對(duì)金耳石斛和長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭種子進(jìn)行滅菌,萌發(fā)率結(jié)果見(jiàn)表1。金耳石斛處理20 min后,萌發(fā)率為96.49%,經(jīng)方差分析與對(duì)照相比沒(méi)有顯著性差異,維持著較高的萌發(fā)率。長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭處理30 s時(shí),種子萌發(fā)率為80.26%,隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),種子萌發(fā)率極顯著下降,處理150 s后,降到3%以下。長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭處理30 s后存在4.45%左右的污染率,處理60 s后才有較好的滅菌效果,但與對(duì)照相比萌發(fā)率已極顯著下降。

2.1.4 1% NaDCC對(duì)種子萌發(fā)率的影響

由表1可知,金耳石斛和長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭處理10 min后污染率為0,且隨著滅菌時(shí)間的增加,金耳石斛各處理間種子萌發(fā)率也沒(méi)有顯著性差異,處理60 min后,種子萌發(fā)率為94.51%。長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭滅菌處理40 min時(shí)種子萌發(fā)率沒(méi)有顯著性差異,處理60 min后,與對(duì)照相比有顯著性下降,為80.30%。1% NaDCC對(duì)種子的萌發(fā)率影響較小,維持較高的萌發(fā)率。隨著滅菌時(shí)間延長(zhǎng),1% NaDCC滅菌試劑對(duì)長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭的種皮可能具有腐蝕作用,種皮顏色由原來(lái)的棕黃變?yōu)橥该?圖2)。1%NaDCC滅菌處理后兩種附生蘭種子都有較好的表面滅菌效果,且對(duì)種胚的傷害小,維持著較高的萌發(fā)率,也許可以作為種子在萌發(fā)法測(cè)定種子生活力時(shí)的通用滅菌試劑。

圖2 金耳石斛和長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭種子經(jīng)過(guò)1% NaDCC滅菌后TTC染色和萌發(fā)情況

2.2 TTC染色法測(cè)定種子生活力

由表1可知,由無(wú)菌水處理的對(duì)照組金耳石斛和長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭種子TTC染色率分別為96.49%和88.65%,萌發(fā)率為97.34%和89.34%,2種附生蘭萌發(fā)率均高于染色率,誤差較小為0.85%和0.69%。種子經(jīng)過(guò)不同滅菌處理后再進(jìn)行TTC染色,與相應(yīng)的萌發(fā)率比較,其穩(wěn)定性存在較大差異。75%酒精處理過(guò)程中,金耳石斛的染色率和萌發(fā)率誤差較小,在0.33%～2.74%之間,長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭誤差在3.67%～29.48%,種子染色率整體偏高;0.1% HgCl2處理中,金耳石斛的染色率和萌發(fā)率誤差小于1.6%,長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭染色率為0,染色率和萌發(fā)率誤差在1.66%以內(nèi);2% NaClO處理中,金耳石斛的染色率和萌發(fā)率誤差小于1.44%,長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭誤差在2.85%～28.58%,種子染色率整體偏低;1% NaDCC處理中,金耳石斛的染色率和萌發(fā)率誤差在0.92%～3.53%,長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭誤差從20.32%到60.18%,種子染色率整體偏低。金耳石斛種子滅菌處理后與對(duì)照相比TTC染色法測(cè)得的種子生活力均較穩(wěn)定,相應(yīng)的萌發(fā)率誤差在3.53%之內(nèi),變化幅度小,結(jié)果可靠,可用于金耳石斛種子生活力評(píng)估。長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭對(duì)照組染色率和萌發(fā)率之間誤差小較穩(wěn)定,滅菌處理后TTC染色法測(cè)得的種子生活力不穩(wěn)定,存在較大誤差,種子染色率整體偏低,表明滅菌試劑影響了長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭種子TTC染色的穩(wěn)定性。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

種子生活力的測(cè)定有多種方法,其中萌發(fā)試驗(yàn)是首要方法[12]。萌發(fā)率常常作為其他活力測(cè)定方法的參照標(biāo)準(zhǔn)[16,29]。蘭科植物種子萌發(fā)率測(cè)定包括共生和非共生萌發(fā)2種途徑,但在萌發(fā)前都需要對(duì)種子進(jìn)行滅菌。由于物種不同、果莢開(kāi)裂與否、以及種皮結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致種皮的滲透性不同,種子的滅菌處理方法各不相同[7,12,18]。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)金耳石斛和長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭種子進(jìn)行不同滅菌方法處理后播種,統(tǒng)計(jì)和比較了不同滅菌試劑處理對(duì)種子萌發(fā)率的影響。結(jié)果表明,金耳石斛種子經(jīng)過(guò)75%酒精、0.1% HgCl2、2% NaClO、1% NaDCC計(jì)4種滅菌處理后整體都維持著較高的萌發(fā)率,僅在0.1% HgCl2處理20 min后種子萌發(fā)率顯著下降,但仍然有94.68%,與同屬的兜唇石斛(Dendrobiumaphyllum)[27]、齒瓣石斛(D.devonianum)[30]和華石斛(D.sinense)[10]結(jié)果相似,分別在1% NaClO、5% NaClO處理10、15、30 min后,都維持著較高的生活力。多種石斛屬植物的種子在不同滅菌試劑及滅菌時(shí)間上整體顯示出較好的耐受性,可能是滅菌耐受型種子。而與之相反,長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭種子表現(xiàn)出不耐受性,75%酒精處理10 min后種子萌發(fā)率降到4%以下,0.1% HgCl2處理30 s后降到2%以下,在2% NaClO溶液處理150 s后降到3%以下,與附生蘭多穗蘭(Polystachyaconcreta)在0.3% NaClO滅菌5 min,種子萌發(fā)率降到了5%以下,0.5% NaClO滅菌3 min種子生活力喪失[31]的研究結(jié)果類似,對(duì)滅菌試劑比較敏感,可能是滅菌不耐受型種子。相較而言,金耳石斛的種子氣腔要大于長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭種子,由于種皮與種胚之間存在氣腔可能阻礙液體流入,長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭幾乎沒(méi)有氣腔,種皮緊貼種胚,溶液快速與種胚接觸[9,32],滅菌試劑可能對(duì)種胚造成傷害,從而影響種子的萌發(fā)率。

蘭科種子屬于粉塵類種子,大小(種子長(zhǎng)度)在0.05～6 mm之間[33-34],不宜用傳統(tǒng)的解剖染色分析法進(jìn)行活力檢測(cè)。利用TTC染色法檢測(cè)蘭科種子生活力,已成功的運(yùn)用到了附生蘭和一些地生蘭科植物[6,35-36],具有簡(jiǎn)單、快捷、易上手等優(yōu)點(diǎn)。在本試驗(yàn)中,種子經(jīng)過(guò)不同滅菌試劑處理后再進(jìn)行TTC染色,與相應(yīng)的萌發(fā)率比較,其穩(wěn)定性存在差異。金耳石斛染色率和萌發(fā)率之間穩(wěn)定性較好,誤差為0.16%～3.53%,變化幅度小;長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭存在較大誤差,在1% NaDCC處理后TTC染色率和萌發(fā)率之間最高達(dá)60.18%,說(shuō)明滅菌處理對(duì)TTC試劑的染色效果影響較明顯(圖2),這與Pradhan等[8]研究結(jié)果一致。長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭種子經(jīng)過(guò)75%酒精處理后,染色率高于萌發(fā)率,原因可能是TTC法屬于酶促檢測(cè)法,依賴于脫氫酶的活力,然而一些酶可能在細(xì)胞死亡后也持續(xù)存在于種子中,產(chǎn)生假陽(yáng)性的活力檢測(cè)結(jié)果[13-14,17],而在次氯酸鹽處理中,可能由于種皮結(jié)構(gòu)、滲透性等差異導(dǎo)致滅菌試劑的殘留干擾了TTC脫氫生成甲瓚[12],減少在種胚細(xì)胞內(nèi)的積累,染色率偏低。金耳石斛的種子為“石斛屬型”,種子呈稍長(zhǎng)鋸屑狀,種皮細(xì)胞的垂周壁豎直,覆蓋細(xì)胞間隙,整個(gè)種子表面密被疣狀至鱗片狀沉積物,可能有一定的疏水性。長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭的種子為“萬(wàn)代蘭屬型”,種子呈鋸屑狀,種皮細(xì)胞的垂周壁豎直堅(jiān)硬,細(xì)胞間隙凹陷,種子表面光滑,偶有疣狀凸起[34]。兩者種子形態(tài)相似,但種皮細(xì)胞間隙連接緊密程度以及是否具疣狀凸起等沉積物細(xì)微結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致了滅菌耐受性的差異。盡管TTC染色法已經(jīng)成功運(yùn)用到一些附生蘭生活力的測(cè)定[12],為進(jìn)一步確保染色率的準(zhǔn)確性,類似長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭等“萬(wàn)代蘭屬型”滅菌不耐受性種子的TTC染色最好在滅菌處理前進(jìn)行,而“石斛屬型”種子在滅菌前后皆可。

3.2 結(jié)論

綜上所述,金耳石斛和長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭種子分別經(jīng)過(guò)75%酒精、0.1% HgCl2、2% NaClO、1% NaDCC滅菌處理后進(jìn)行種子生活力檢測(cè),2種附生蘭種子由于在種子氣腔、種皮細(xì)胞間隙連接緊密程度以及是否具疣狀凸起等沉積物細(xì)微結(jié)構(gòu)上的不同,可能導(dǎo)致了對(duì)滅菌試劑耐受性存在差異,金耳石斛耐受性較好,屬于滅菌耐受型種子,長(zhǎng)瓣萬(wàn)代蘭屬于滅菌不耐受型種子。1% NaDCC對(duì)兩種附生蘭種子萌發(fā)率的影響最小,處理10～40 min后萌發(fā)率沒(méi)有顯著性差異,是本試驗(yàn)中2種附生蘭種子的最佳滅菌處理方法,可能可以作為未來(lái)大批量蘭科植物種子滅菌較為通用的滅菌試劑,但還需要在更多的不同生活型物種中進(jìn)行驗(yàn)證。