楊潤，任淑娣，陳中愛，劉麗靜，許家威，胡永金

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院（昆明 650201）

腐乳是我國一種具有悠長歷史的大豆蛋白發(fā)酵食品。其具有風(fēng)味獨特、營養(yǎng)豐富、易保存的特點[1-2]，在中國及東南亞地區(qū)深受人們喜愛[3]，常作為佐餐食品呈現(xiàn)于人們餐桌[4]，因其制作方法和質(zhì)地口感類似奶酪，在歐美，許多人把它稱作中國干酪[5]。腐乳中不僅包含了大豆自身的各種活性物質(zhì)，還經(jīng)過微生物發(fā)酵作用去除了大豆苦腥味、脹氣因子和抗?fàn)I養(yǎng)因子，生產(chǎn)出各種有香氣的有機酸、醇類、酯類和氨基酸[6]，以及硫胺素、尼克酸、鈣和磷等營養(yǎng)成分[7]，具有降血壓、降低血液中的膽固醇[8-10]、抗氧化[11]及保護人體神經(jīng)系統(tǒng)[12-13]等功能。另外，在腐乳加工過程中還會產(chǎn)生人體必需的VB12[14]。腐乳發(fā)酵過程涉及多種微生物，其主要制曲菌種為雅致放射毛霉、總狀毛霉、五通橋毛霉及高大毛霉[15]。毛霉能分泌多種酶，將大豆中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物水解成氨基酸和小分子，對品質(zhì)形成有重要貢獻，是主要的腐乳發(fā)酵菌種[16]。

傳統(tǒng)發(fā)酵腐乳生產(chǎn)是一種開放式的過程，未經(jīng)過加熱殺菌，因此存在被環(huán)境微生物（例如蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等）[17]和其他雜菌污染的風(fēng)險。另外，腐乳產(chǎn)品中還含有較多的蛋白質(zhì)及氨基酸，這些物質(zhì)容易使細菌產(chǎn)生耐藥性并對人體健康造成威脅。目前我國腐乳產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)主要是利用單一菌種發(fā)酵，但采用單一菌種或自然發(fā)酵，存在酶系不全、腐乳風(fēng)味單調(diào)等問題[18-19]?；谏鲜鲈?，此研究從風(fēng)味良好的自然發(fā)酵腐乳中篩選出蛋白酶活力較強的菌種進行混菌發(fā)酵并研制發(fā)酵劑，既能保留其固有風(fēng)味，又能使產(chǎn)品發(fā)酵更為穩(wěn)定，是一種傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品升級的有效途徑[20]，為廣大消費者消除食品安全問題的同時為該產(chǎn)業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)提供技術(shù)支持和品質(zhì)保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豆腐、豆腐干粉（新鮮豆腐烘干打碎，市售）；毛霉M-T、毛霉40899、M-7、M-H和M-R（實驗室分離）；干酪素、碳酸氫二鉀、碳酸二氫鉀、三氯乙酸、碳酸鈉（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

H2-16KR高速冷凍離心機（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）；SHA-BA恒溫振蕩器（常州澳華儀器有限公司）；LDZX-5OKBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安有限公司）；SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；BSC-250恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；HWS24恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；PHS-3CPH計（儀電科學(xué)儀器有限公司）；熱板IT-09A5磁力攪拌器（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；EX30光學(xué)顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司）。

1.3 測定方法

1.3.1 微生物的測定

菌落總數(shù)測定參照GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》[21]進行測定。

1.3.2 理化指標(biāo)的測定

水分含量測定參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》[22]直接干燥法進行測定；總酸測定參照GB 12456—2021《食品中總酸度測定》[23]pH計電位滴定法進行測定；氨基酸態(tài)氮含量測定參照GB 5009.235—2016《氨基酸態(tài)氮測定》[24]酸度計法進行測定。

1.4 蛋白酶活力的測定

蛋白酶活力的測定參考潘進權(quán)[25]的方法。

1.5 發(fā)酵劑制作工藝

配制培養(yǎng)料→滅菌→接種菌種→培養(yǎng)→干制→粉碎→檢驗→成品

培養(yǎng)料：25 g豆腐干粉和水混合，置于150 mL三角瓶中。

水分pH：用乳酸調(diào)節(jié)pH至指定值。

滅菌：121 ℃下滅菌20 min，趁熱搖散。

接種菌種：接入1×106CFU/g的菌懸液。

培養(yǎng)：于28 ℃培養(yǎng)72 h。

干制：培養(yǎng)完后于50 ℃烘制18 h。

檢驗：檢測發(fā)酵劑中霉菌的含量。

1.6 單因素試驗設(shè)計

試驗選擇水分添加量（90%，100%，110%，120%和130%）、水分pH（pH 2.5，3，3.5，4和4.5）、菌液添加量（2%，3%，4%，5%和6%）以及菌種比例（3∶1，2∶1，1∶1，1∶2和1∶3）按照工藝流程進行單因素試驗，以發(fā)酵劑的霉菌總數(shù)為指標(biāo)對工藝進行分析。

1.7 響應(yīng)面試驗設(shè)計

通過單因素試驗，選出影響腐乳發(fā)酵劑霉菌量最大的三個因素，基于此，采用Box-Behnken設(shè)計，并以霉菌數(shù)量作為反應(yīng)指標(biāo)，詳見表1。

表1 響應(yīng)面試驗參數(shù)的因素與編碼水平

1.8 發(fā)酵劑發(fā)酵特性檢測

針對響應(yīng)面優(yōu)化后得出的結(jié)果，進行腐乳發(fā)酵實驗，檢測發(fā)酵劑發(fā)酵腐乳的性能，對接種發(fā)酵劑后72 h內(nèi)（每隔12 h）蛋白酶活力、毛坯的總酸以及氨基酸態(tài)氮進行測定。

1.9 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計方法

運用IBM SPSS Statistics 19進行差異性顯著分析，并采用Origin Pro 2018軟件來繪制相關(guān)圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌種的選擇

在腐乳發(fā)酵過程中，童佳[26]認為蛋白酶是醬油風(fēng)味形成的關(guān)鍵酶，它將大豆中的蛋白質(zhì)降解為氨基酸、多肽[27]等，對風(fēng)味及滋味有重要作用。陳怡等[28]將蛋白酶活力作為選擇瀏陽豆豉發(fā)酵菌株的重要指標(biāo)。選擇蛋白酶活力高的菌株，對提高發(fā)酵豆制品風(fēng)味有重要意義。通過對實驗室現(xiàn)有的5株腐乳發(fā)酵用霉菌進行蛋白酶活力比較，結(jié)果如表2所示。M-T和M-40899在72 h內(nèi)蛋白酶活力最高，因此選定M-T和M-40899為發(fā)酵劑的菌株。通過對發(fā)酵劑水分添加量、pH、菌液接種量以及菌種的比例來優(yōu)化發(fā)酵劑的配方。

表2 菌種蛋白酶活力的比較 單位：μg/mL

表3 發(fā)酵劑條件響應(yīng)面設(shè)計結(jié)果

2.2 腐乳發(fā)酵劑影響因素研究

2.2.1 水分添加量對發(fā)酵劑霉菌數(shù)的影響

水分添加量對腐乳發(fā)酵劑霉菌數(shù)的影響見圖1。由圖1可知，隨著水分添加量的增加，霉菌數(shù)先增加后下降。由于水分含量的增長，腐乳濕度增大，霉菌的生長條件受到一定的影響，水分含量過大則會使其生長速度也受到限制，導(dǎo)致菌落計數(shù)隨水分的增加而逐漸減少[29]。水分添加量在110%時霉菌數(shù)最高，為8.26 lg CFU/g。這是由于霉菌的生長需要適宜的水分，而110%的添加量使得發(fā)酵劑初期的含水量在70%左右，滿足霉菌的生長需求，所以水分添加量選擇110%。

2.2.2 pH對發(fā)酵劑霉菌數(shù)的影響

pH的變化對腐乳發(fā)酵劑霉菌數(shù)的影響見圖2。由圖2可知，腐乳發(fā)酵劑霉菌數(shù)隨著水分pH的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在pH為3.5時霉菌生長最旺盛，數(shù)量達到最高，為8.31 lg CFU/g。微生物的繁衍需要適宜的pH范圍，而大多數(shù)在7.0左右，但霉菌的范圍比較廣，在酸性條件下也能生存，還能抑制其他雜菌的生長[30]，同時由于傳統(tǒng)腐乳發(fā)酵前期pH偏向于酸性，因此用乳酸把發(fā)酵劑所添加的水分pH分別調(diào)成2.5，3.0，3.5，4.0以及4.5，探究不同pH下霉菌的生長情況。

圖2 pH對發(fā)酵劑霉菌數(shù)的影響

2.2.3 菌種比例對發(fā)酵劑霉菌數(shù)的影響

菌種比例的變化對腐乳發(fā)酵劑霉菌數(shù)的影響見圖3。由圖3可知，M-T毛霉和40899霉菌的比例影響著發(fā)酵劑的霉菌數(shù)。當(dāng)霉菌40899添加量不變時，霉菌數(shù)隨著毛霉M-T數(shù)量的減少呈先增加后減少的趨勢；當(dāng)毛霉M-T添加量不變時，霉菌數(shù)隨著毛霉40899數(shù)量的增加而減少。當(dāng)菌種比例為2∶1時，霉菌數(shù)最高，為8.27 log CFU/g。不同的霉菌發(fā)酵腐乳都會造成產(chǎn)品的風(fēng)味和可接受度方面的差異[31]，且單一菌種發(fā)酵腐乳會因為酶系單一的原因?qū)е嘛L(fēng)味口感不佳，所以借助雙菌種來發(fā)酵腐乳能對腐乳風(fēng)味以及品質(zhì)有一個提升。

圖3 菌種比例對發(fā)酵劑霉菌數(shù)的影響

2.2.4 菌種添加量對發(fā)酵劑霉菌數(shù)的影響

菌種添加量的變化對腐乳發(fā)酵劑霉菌數(shù)的影響見圖4。由圖4可知，隨著菌液的添加量的增加，霉菌數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但總體變化不大，菌液添加量為4%時霉菌數(shù)最高，為8.26 log CFU/g。

圖4 菌液添加量對發(fā)酵劑霉菌數(shù)的影響

2.2.5 響應(yīng)面因素及水平的確定

由圖5可知，菌液添加量的變化對于發(fā)酵劑的霉菌數(shù)的影響小于水分添加量、pH和菌種比例，且發(fā)酵劑霉菌數(shù)隨菌液添加量的變化波動不大，因此以質(zhì)量的4%確定添加量。同時以水分添加量、pH和菌液比例三個因素的三個水平設(shè)計響應(yīng)面試驗。

圖5 單因素的組間標(biāo)準(zhǔn)差比較

2.3 發(fā)酵劑配方的響應(yīng)面優(yōu)化

利用Design-Erpert 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行擬合分析，以霉菌數(shù)為因變量，以水分添加量（A）、pH（B）和菌種比例（C）為自變量得到的回歸方程為霉菌總數(shù)=8.27+0.025A-0.05B-0.13C+0.025AB-5.0×103AC+0.06BC-0.071A2-0.081B2-0.11C2。

回歸方程分析結(jié)果見表4。

表4 發(fā)酵劑回歸模型方差分析表

由表4的方差分析數(shù)據(jù)可知，應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件得到的數(shù)據(jù)模型是極顯著的（P＜0.000 1＜0.01），而失擬項不顯著（P=0.084 8＞0.05），這說明此試驗得到的數(shù)據(jù)模型的回歸方程擬合度良好，試驗結(jié)果可靠。

2.4 響應(yīng)面結(jié)果分析

利用Design-Expert 8.0軟件繪制能反映影響發(fā)酵劑霉菌數(shù)的3個因素交互作用的三維響應(yīng)面圖，如圖6至圖8所示。菌種比例和pH對發(fā)酵劑霉菌數(shù)有顯著影響，而水分添加量和pH與水分添加量和菌種比例對于發(fā)酵劑的霉菌數(shù)的影響不顯著。每個因素各自的交互作用十分顯著，表明各因素作為試驗控制具有顯著意義，各個因素顯著程度依次為菌液比例＞pH＞水分添加量。利用Design-Expert 8.0軟件優(yōu)化分析，確定最佳提取工藝：水分添加量為111%，pH為3.22，菌液比例為0.69，預(yù)測值為8.34 lg（CFU/g）。通過驗證試驗，發(fā)酵劑成品霉菌數(shù)為8.35 lg（CFU/g）。

圖6 水分添加量與pH對霉菌總數(shù)影響的響應(yīng)面及等高線圖

圖7 水分添加量與菌種比例對霉菌總數(shù)影響的響應(yīng)面及等高線圖

圖8 pH與菌種比例對霉菌總數(shù)影響的響應(yīng)面及等高線圖

2.5 發(fā)酵劑發(fā)酵腐乳性能的探究

根據(jù)響應(yīng)面結(jié)果分析優(yōu)化之后發(fā)酵劑的配方按照發(fā)酵劑制作工藝步驟制備腐乳雙菌種發(fā)酵劑，并用得到的發(fā)酵劑發(fā)酵腐乳，發(fā)酵情況如圖9所示，同時測定發(fā)酵72 h內(nèi)蛋白酶活力、總酸以及氨基酸態(tài)氮的變化，以檢測發(fā)酵劑的發(fā)酵性能。

圖9 發(fā)酵劑發(fā)酵腐乳的毛霉生長情況

2.6 蛋白酶活力、總酸及氨基酸態(tài)氮隨時間的變化

通過測定腐乳發(fā)酵過程中的蛋白酶活力，可以反映腐乳的發(fā)酵狀態(tài)[32]。酶活力越旺盛，則腐乳的蛋白質(zhì)降解得就越快。如圖10所示，發(fā)酵劑培養(yǎng)的毛坯在72 h時蛋白酶活力能達到37.25 μg/g。

圖10 蛋白酶活力、總酸及氨基酸態(tài)氮隨時間的變化

腐乳在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生有機酸、游離脂肪酸、游離氨基酸等物質(zhì)，是腐乳酸度形成的主要因素[33]。由圖10可知，在腐乳發(fā)酵劑下，總酸在72 h發(fā)酵過程中處于上升狀態(tài)。在前發(fā)酵過程中，總酸的來源是乳酸菌代謝生產(chǎn)乳酸、醋酸、琥珀酸等有機酸[34]，對總酸的形成起著非常大的作用。與傳統(tǒng)腐乳前發(fā)酵時期的總酸含量對比，發(fā)酵劑發(fā)酵的腐乳總酸含量上升得稍快，是因為發(fā)酵劑含有兩種毛霉，復(fù)合發(fā)酵使得酶活力更高、所引起的大分子物質(zhì)降解更快、更多。

氨基酸態(tài)氮是腐乳發(fā)酵的判斷指標(biāo)。由圖10可知，發(fā)酵劑發(fā)酵腐乳的游離氨基酸態(tài)氮含量也上升明顯，蛋白質(zhì)在酶作用下不斷地降解產(chǎn)生氨基酸，導(dǎo)致氨基酸態(tài)氮含量小幅增長，含量由0 h的0.004 g/100 g上升到72 h的0.056 g/100 g。與牟定腐乳不同的是，市售腐乳初始蛋白酶活力略低，但是同時間段上升的幅度遠大于牟定腐乳，而游離氨基酸態(tài)氮又被譽為判斷腐乳成熟的指標(biāo)之一，因此可以說明發(fā)酵劑的發(fā)酵性能優(yōu)良。

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面優(yōu)化，得到腐乳發(fā)酵劑工藝優(yōu)化結(jié)果，即水分添加量為培養(yǎng)基質(zhì)的111%，pH為3.22，菌液比例為0.69。此時發(fā)酵劑的霉菌數(shù)為8.35 lg CFU/g。使用發(fā)酵劑發(fā)酵腐乳的總酸、氨基酸態(tài)氮以及蛋白酶活力變化分別從0 h的0.018 g/100 g，0.004 g/100 g和9.12 μg/mL上升到72 h時的0.142 g/100 g，0.056 g/100 g和37.25 μg/mL，與傳統(tǒng)自然發(fā)酵的腐乳同時期總酸和氨基酸含量變化增速更快，說明發(fā)酵劑發(fā)酵性能好。