黨仕卓 周 娟 湯學(xué)燊 劉 鑫 張亞紅， 袁 苗

（1寧夏大學(xué)葡萄酒與園藝學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2寧夏大學(xué)林草學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

葡萄（Vitisvinifera）栽培面積廣泛，經(jīng)濟(jì)效益高，是世界古老的果樹，也是寧夏乃至西北地區(qū)設(shè)施果樹的主栽樹種。葡萄花芽分化質(zhì)量是衡量葡萄質(zhì)量和產(chǎn)量的基礎(chǔ)［1］，葡萄花芽分化進(jìn)程復(fù)雜，需要外部環(huán)境和內(nèi)部因素的整合［2］，而光在此過程起關(guān)鍵作用。光是影響植物形態(tài)發(fā)生的重要信號(hào)，也是形態(tài)建成和花芽形成的關(guān)鍵因子［3-4］。研究表明，紅藍(lán)光組合能促進(jìn)花芽分化，提高花蕾質(zhì)量和數(shù)量［5］；在葡萄補(bǔ)光試驗(yàn)中紅藍(lán)4∶1（R4B1）是促進(jìn)紅地球葡萄花芽分化的最佳補(bǔ)光比例，能顯著提高葡萄產(chǎn)量及品質(zhì)［6-8］。光可通過控制激素平衡來調(diào)節(jié)植物營(yíng)養(yǎng)和生殖平衡，植物中光信號(hào)介導(dǎo)脫落酸（abscisic acid，ABA）和赤霉素（erythromycin，GA）代謝基因的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)烈抑制黑暗萌發(fā)，卻抑制油菜素內(nèi)酯（brassinolide，BR）途徑促進(jìn)光形態(tài)建成，BR、GA與光共同調(diào)控細(xì)胞伸長(zhǎng)和光形態(tài)建成［3，9-10］。

BR 是一種促生長(zhǎng)類固醇激素，在調(diào)節(jié)胚軸伸長(zhǎng)、光形態(tài)建成及花發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用［11-12］。研究表明，BR能促進(jìn)葡萄［13］、番茄（Solanumlycopersicum）［14］果實(shí)成熟并提高其產(chǎn)量；而油菜素唑（brassinazole，Brz）顯著延緩果實(shí)成熟［13］。BR 的生理作用和信號(hào)通路研究主要集中于擬南芥（ArabidopsisthalianaL.）、番茄和豌豆（PisumsativumL.）［15］。BES1是BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控下游BR 生物合成基因并被其他物種證實(shí)在調(diào)控植物花發(fā)育方面發(fā)揮重要作用。轉(zhuǎn)錄因子CmBES1促進(jìn)菊花（ChrysanthemummorifoliumRamat.）舌狀花花瓣融合發(fā)育［16］，地錢（Marchantia polymorpha）MpBES1調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和分化［17］。BR 信號(hào)和光信號(hào)相互作用調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育，光敏色素作用因子PIF4 （phytochrome interacting factor 4）與BES1互作調(diào)控細(xì)胞伸長(zhǎng)和植株生長(zhǎng)［18］。擬南芥中BR ENHANCED EXPRESSION 1（BEE1）是BES1和隱花色素2（CRY2）介導(dǎo)開花的整合子，BES1-BEE1-FLOWERING LOCUS T（FT）是調(diào)控光周期開花的一條新的信號(hào)通路［19］，表明光信號(hào)介導(dǎo)BR 信號(hào)途徑在調(diào)節(jié)植物花發(fā)育中起重要作用。

花芽分化不良在設(shè)施葡萄栽培過程中普遍存在，發(fā)光二極管（light emitting diode，LED）補(bǔ)光技術(shù)有助于葡萄花芽分化［20-21］。目前關(guān)于光調(diào)控花芽分化機(jī)制研究主要聚焦在表型、生理及組學(xué)研究中，但就光介導(dǎo)激素信號(hào)尤其是BR 信號(hào)調(diào)控紅地球葡萄花芽分化的分子機(jī)制尚不清晰。寧夏大學(xué)葡萄酒與園藝學(xué)院張亞紅課題組（本課題組）前期研究發(fā)現(xiàn)，BR在紅藍(lán)光組合補(bǔ)光促進(jìn)紅地球葡萄花芽分化中發(fā)揮重要作用。鑒于此，本研究分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)后獲得植物器官邊界關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子BES1家族基因VvBES1-1，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析及同源克隆；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）分析VvBES1-1組織表達(dá)與時(shí)空表達(dá)模式；在煙草中異源表達(dá)VvBES1-1明確其生物學(xué)功能，以期為后續(xù)開展紅藍(lán)光調(diào)控設(shè)施紅地球葡萄花芽分化的機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本試驗(yàn)以11 年生紅地球葡萄為供試材料，種植于寧夏大學(xué)試驗(yàn)基地賀蘭園藝產(chǎn)業(yè)園（38°20′N，106°16′E）15 號(hào)陰陽結(jié)合型日光溫室陰棚。本研究以課題組前期試驗(yàn)篩選獲的最佳復(fù)合光比例，紅光∶藍(lán)光=4∶1（R4B1）處理葡萄，以溫室自然光（CK）為對(duì)照，處理間以反光膜相隔。共24株葡萄，分2個(gè)小區(qū)，每小區(qū)12 株，每處理設(shè)補(bǔ)光燈10 盞，在每組試驗(yàn)行樹體上方30 cm 處安置補(bǔ)光燈補(bǔ)光，從葡萄萌芽期開始直至成熟期結(jié)束，每天8∶00—22∶00 進(jìn)行補(bǔ)光，補(bǔ)光的光照強(qiáng)度為200 μmol·m-2·s-1，進(jìn)行常規(guī)肥水管理。

參照劉鑫等［6］對(duì)葡萄花芽分化時(shí)期的劃分進(jìn)行采樣，隨機(jī)采集新生根、花序、卷須、莖、葉片以及健壯枝條的飽滿花芽。樣品采集后立即用液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱，用于RNA 提取及后續(xù)研究。為減少晝夜節(jié)律對(duì)基因表達(dá)差異帶來的干擾，將采樣時(shí)間固定于早上9點(diǎn)。

轉(zhuǎn)基因煙草（本氏煙草NicotianabenthamianaDomin）種植于22 ℃光照培養(yǎng)室（光照16 h/黑暗8 h）培養(yǎng)，相對(duì)濕度為75%～80%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA 提取及cDNA 合成 參考總RNA 提取試劑盒（Omega，美國(guó)）說明書提取紅地球葡萄不同組織，不同時(shí)期花芽的總RNA。用Nano Drop 微量紫外檢測(cè)儀（Thermo Scientific，美國(guó)）測(cè)定提取的RNA 樣品濃度，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 完整性。并以不同時(shí)期花芽RNA 混樣為模板，參照HisScriptR ⅢReverse Transcriptase 試劑盒（Vazyme，南京）獲得第一鏈cDNA。反轉(zhuǎn)錄后的cDNA保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 基因克隆與生物信息學(xué)分析 根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)用Primer 8.0 軟件對(duì)獲得基因的基因編碼序列（coding sequence，CDS）設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物VvBES1-1-F/VvBES1-1-R（表1）。以紅地球葡萄花芽的cDNA為模板擴(kuò)增目的片段，PCR 體系共25 μL：cDNA 2 μL，VvBES1-1-F/VvBES1-1-R 各1 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme，南京）12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，29 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后用DNA 凝膠回收試劑盒（TIANGEN，北京）回收目的片段。

表1 紅地球葡萄VvBES1-1克隆、亞細(xì)胞定位、自激活及過表達(dá)載體構(gòu)建引物Table 1 VvBES1-1 subcellular localization，autoactivation analysis and overexpression vector construction primers in Red Globe grape

使用ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam）在線分析VvBES1-1 理化性質(zhì)；利用ExPASy Prot Scale 分析VvBES1-1蛋白疏水性；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)用在線分析工具PSORT Ⅱ Prediction（http：//www.genscript.com/posort.html）和Plant-PLOC（https：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant）進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析；使用在線工具cNLS Mapper（https：//nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi）、Nuc Pred（https：//nucpred.bioinfo.se/cgi-bin/single.cgi）預(yù)測(cè)VvBES1-1核定位信號(hào)（nuclear localization signal sequence，NLS）序列；在NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載所需序列，利用MEGA 11 軟件的近鄰相接法（Neighbor-Joining，NJ） 構(gòu)建進(jìn)化樹分析 （Boot strap檢驗(yàn)重復(fù)值設(shè)置為1 000）；并用DNAMAN 9進(jìn)行多序列比對(duì)。

1.2.3 酵母載體構(gòu)建和自激活活性檢測(cè) 采用誘餌載體pGBKT7（BD），去掉目的基因序列的終止密碼子后，利用BamHI 和EcoRI 雙酶切BD 載體，隨后利用同源重組試劑盒將回收的PCR 產(chǎn)物與酶切后的線性載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌［Escherichiacoli（Mig.） Cast.&Chalm.］ DH5α 感受態(tài)細(xì)胞后涂布于加有硫酸卡那霉素（kanamycin，kana）抗性的固體溶菌肉湯（luria-bertani，LB）培養(yǎng)基，37 °C 倒置培養(yǎng)12 h。挑取陽性克隆送生工生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，將測(cè)序正確的誘餌載體質(zhì)粒含kan 抗性的固體LB 培養(yǎng)基上活化，根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒（TIANGEN，北京）。通過PEG/LiAc 法將其轉(zhuǎn)入釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）Y2H Gold 感受態(tài)細(xì)胞，涂于SD/-Trp 營(yíng)養(yǎng)缺陷型固體培養(yǎng)基后放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。3 d 后挑取單菌落并稀釋后點(diǎn)樣于含有5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-吡喃半乳糖苷（Xα-Gal） 和金擔(dān)子素（aureobasidin A，AbA）的SD/-Trp培養(yǎng)基上，放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，并觀察其生長(zhǎng)情況。

1.2.4VvBES1-1遺傳轉(zhuǎn)化煙草及陽性株系篩選鑒定構(gòu)建過表達(dá)載體（同1.2.3）后電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法［22］異源轉(zhuǎn)化本氏煙草：將5 周苗齡無菌煙草葉片用手術(shù)刀切成小塊接種于預(yù)培養(yǎng)基，預(yù)培養(yǎng)2～3 d 后置于OD600=0.2 的農(nóng)桿菌懸浮液侵染10～15 min。已侵染的葉片用無菌濾紙吸干殘留的菌液，接種于共培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)48～72 h。依次轉(zhuǎn)至篩選培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每隔14 d更換一次培養(yǎng)基?？蛰d體遺傳轉(zhuǎn)化煙草的步驟同上。

1.2.5 qRT-PCR 分析 將1.2.1 中提取的總RNA 濃度統(tǒng)一調(diào)整為0.5 μmol·L-1，每個(gè)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用1 μmol·L-1RNA。qRT-PCR 參考QuantiNova?SYBR?PCR 試劑盒（QIAGEN，德國(guó)）說明書；反應(yīng)在qTOWER 2.2 （Analytik Jena，德國(guó)）上按照說明書進(jìn)行，數(shù)據(jù)用2-△△CT法［23］進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。用SPSS 26 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并利用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行顯著性分析。所有試驗(yàn)均設(shè)3 次重復(fù)，選用VvActin作為內(nèi)參。

轉(zhuǎn)基因植株光照處理和激素處理所用材料為5 周齡轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草（光照培養(yǎng)箱中）光照處理分為R4B1、自然光及暗處理（遮光）；在0、2、4、6 h共4個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集試驗(yàn)樣品；激素處理以5 mmol·L-1BR 處理2 h，DMSO溶劑處理2 h作對(duì)照，采集試驗(yàn)樣品（同1.1）。利用總RNA提取試劑盒分別提取處理后煙草及野生型煙草總RNA 并反轉(zhuǎn)錄，通過qRT-PCR 檢測(cè)煙草中VvBES1-1的表達(dá)量，以煙草Actin作為內(nèi)參，方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 VvBES1-1基因克隆

參考本課題組前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，根據(jù)目的基因CDS 序列設(shè)計(jì)特異性引物（表1），以紅地球葡萄花芽反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增條帶大小與目的基因大小一致（圖1）。將目的片段擴(kuò)增產(chǎn)物回收后送上海生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果比對(duì)完全正確，VvBES1-1的CDS序列長(zhǎng)度為1 026 bp，分別編碼342個(gè)氨基酸。

圖1 紅地球葡萄VvBES1-1基因擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 Amplification product of VvBES1-1 gene of Red Globe grape

2.2 VvBES1-1生物信息學(xué)分析

采用ExPASy 分析VvBES1-1 蛋白分子量和理論等電點(diǎn)，VvBES1-1 分子量為3.629 628 kDa，理論等電點(diǎn)（pI）為8.53（表2），可見VvBES1-1 蛋白屬于堿性氨基酸（pI＞7），其次VvBES1-1 平均疏水性為-0.611。綜上，該蛋白為堿性親水性蛋白。

表2 紅地球葡萄VvBES1-1蛋白理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of VvBES1-1 protein in Red Globe grape

利用在線SOPMA 程序?qū)vBES1-1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明：VvBES1-1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括α 螺旋、延伸鏈、無規(guī)卷曲和β 轉(zhuǎn)角種類型（圖2-A），無規(guī)則卷曲和α 螺旋是VvBES1-1蛋白多肽鏈的主要結(jié)構(gòu)元件，比例分別為68.91%、18.48%，其次為延伸鏈8.21%、β轉(zhuǎn)角4.40%。

圖2 紅地球葡萄VvBES1-1蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 The secondary and tertiary structure of Red Globe grape VvBES1-1 protein

為進(jìn)一步了解VvBES1-1蛋白的結(jié)構(gòu)，利用SWISSMODEL 對(duì)VvBES1-1 蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的建模分析，結(jié)果如圖2-B 所示。VvBES1-1 蛋白的主要結(jié)構(gòu)是無規(guī)則卷曲和α螺旋，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。

利用MEGA11.0 軟件中的鄰接法，將紅地球葡萄VvBES1-1 序列與其他17 個(gè)物種的BES1 蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Boot strap 值為1 000 （圖3）。結(jié)果表明，VvBES1-1 與河岸葡萄［XP 034698454.1］氨基酸序列相似度為99.71%，同高粱BES1［XP 002454981.1］蛋白相似性最低，為60.29%。經(jīng)聚類分析后，發(fā)現(xiàn)可聚類為2個(gè)分支，第一分支包括開心果［XP 031269808.1］、棗［XP 015875603.1］、茶［XP 028056898.1］等；第二分支包括海棗［XP 008796066.1］、姜［XP 042398453.1］、高粱［XP 002454981.1］等。綜上，VvBES1-1與河岸葡萄親緣關(guān)系最近。

圖3 紅地球葡萄VvBES1-1與其他植物中BES1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of Red Globe grape VvBES1-1 and BES1 protein in other plants

多重序列比對(duì)結(jié)果顯示，5 種果樹的BES1 蛋白序列相似性較高，均包含一個(gè)完整的BES1_N 結(jié)構(gòu)域，表明VvBES1-1 是一個(gè)典型的BES1_N 型BES1 轉(zhuǎn)錄因子。功能域分析表明，VvBES1-1在雙子葉植物中均含有BES1_N 功能域，但序列存在不保守情況，表明該基因在不同物種中存在進(jìn)化差異（圖2-C、圖4）。

圖4 紅地球葡萄VvBES1-1與其他植物中BES1蛋白多序列比對(duì)結(jié)果和NLS序列預(yù)測(cè)Fig.4 Red Globe grape VvBES1-1 multi-sequence alignment and NLS sequence prediction results of BES1 protein in other plants

通過在線工具cNLS Mapper和Nuc Pred對(duì)VvBES1-1的NLS序列預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，VvBES1-1在高度保守的BES1_N結(jié)構(gòu)域序列中包含一段預(yù)測(cè)的NLS（圖4），其活性評(píng)分為5.7。Nuc Pred 在線工具預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該段NLS 活性得分為0.65。

2.3 VvBES1-1轉(zhuǎn)錄因子自激活活性分析

以酵母菌菌株Y2H Gold 為試驗(yàn)材料，將VvBES1/BD分別轉(zhuǎn)化至酵母菌體內(nèi)，并對(duì)其進(jìn)行自激活活性分析。結(jié)果表明，含VvBES1-1的菌株能在一缺培養(yǎng)基（SD/-Trp）上正常生長(zhǎng)，并且將單克隆菌株在SD/-Trp/AbA培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，菌株生長(zhǎng)也未受到抑制，能正常生長(zhǎng)。在SDO/A/X培養(yǎng)基上陽性對(duì)照（PGADT7-T+p53/BD）正常生長(zhǎng)并且變藍(lán)，而雙陰性對(duì)照（PGADT7-T+Lam/BD 和BD 空載體）單克隆菌株均不能正常生長(zhǎng)（圖5），證明VvBES1-1有自激活活性，表明該轉(zhuǎn)錄因子被激活后可能通過識(shí)別特異的核苷酸序列啟動(dòng)和調(diào)控下游靶基因的表達(dá)從而調(diào)節(jié)紅地球葡萄花芽分化進(jìn)程。

圖5 紅地球葡萄VvBES1-1自激活活性分析Fig.5 Detection of autoactivation activity of VvBES1-1 receptor binding bait protein in Red Globe grape

2.4 VvBES1-1時(shí)空表達(dá)分析

如圖6 所示，在R4B1 處理下VvBES1-1基因在紅地球葡萄花芽分化過程中表達(dá)量均低于對(duì)照組，圖6顯示紅地球葡萄花芽在6 月15 日處于始分化期，對(duì)照組花芽中VvBES1-1基因在6 月15 日前表達(dá)量逐漸增加，顯著高于R4B1，在此期間表明前期VvBES1-1基因表達(dá)量降低促進(jìn)花芽分化進(jìn)程。6月30日—7月15日，葡萄花芽始原基開始分化并決定能否形成花原基，在該階段VvBES1-1基因表達(dá)水顯著低于對(duì)照。觀察整個(gè)分化時(shí)期內(nèi)對(duì)照組VvBES1-1基因的表達(dá)趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)VvBES1-1在6 月15 日的表達(dá)量最高，進(jìn)一步說明VvBES1-1可能在花芽分化中起作用。7月15日—8月30 日花芽分化階段處于花序主軸發(fā)育和花序二級(jí)軸發(fā)育，R4B1 處理下VvBES1-1基因的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，并且維持在一個(gè)低表達(dá)水平狀態(tài)，表明VvBES1-1表達(dá)量低有利于花芽后期分化。VvBES1-1基因在R4B1 處理下較對(duì)照組均顯著下調(diào)表達(dá)，推測(cè)紅藍(lán)光下VvBES1-1基因在紅藍(lán)光介導(dǎo)紅地球葡萄的花芽分化的過程中表達(dá)量下調(diào)。

圖6 R4B1下紅地球葡萄VvBES1-1基因時(shí)空表達(dá)模式Fig.6 Spatiotemporal expression pattern of VvBES1-1 gene in Red Globe grape under light of R4B1

2.5 VvBES1-1組織特異性表達(dá)分析

為明確R4B1處理下VvBES1-1在紅地球葡萄不同組織器官中的表達(dá)情況，選取紅地球葡萄的根、莖、葉、花芽、花及卷須進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析。結(jié)果表明，VvBES1-1在各組織器官中均有表達(dá)（圖7）。在溫室自然光中VvBES1-1在葉片和花芽中的表達(dá)量較高，其中溫室自然光葉片中的表達(dá)量是R4B1處理葉片中的6倍，而根中的表達(dá)量最低；R4B1 處理下，VvBES1-1在莖和花芽中的表達(dá)量最高，花中的表達(dá)量最低。VvBES1-1基因在葉片和花芽中的表達(dá)量顯著下降，而R4B1 處理下BRs上調(diào)表達(dá)同成花率正相關(guān)，這說明R4B1處理下BR信號(hào)通路中VvBES1-1表達(dá)量下降。

圖7 R4B1下VvBES1-1基因在紅地球葡萄不同組織中的表達(dá)水平Fig.7 The expression level of VvBES1-1 gene in different tissues of Red Globe grapeunder light of R4B1

2.6 轉(zhuǎn)煙草陽性鑒定及表型分析

在本氏煙草中構(gòu)建過表達(dá)載體并利用農(nóng)桿菌通過葉盤法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，采用十六烷基三甲基溴化銨法（hexadecyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA后進(jìn)行陽性植株鑒定，鑒定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化的陽性植株能夠擴(kuò)增出與VvBES1-1大小一致的條帶，野生型煙草中則未鑒定出目的條帶（圖8-A），由此可以確定目的基因成功整合到煙草基因組中。對(duì)T3代表型觀察發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)VvBES1-1煙草相比野生型開花時(shí)間較晚且葉片數(shù)增加，節(jié)間縮短（圖8-B、C），這表明VvBES1-1過表達(dá)可能推遲煙草開花時(shí)間。根據(jù)陽性鑒定結(jié)果，隨機(jī)選擇其中2株開展后續(xù)功能研究驗(yàn)證。

圖8 轉(zhuǎn)VvBES1-1煙草陽性鑒定及表型Fig.8 Positive identification and phenotyping of trans- VvBES1-1 tobacco

2.7 光參與調(diào)控BR信號(hào)通路

為進(jìn)一步明確光是否參與調(diào)控BR 信號(hào)通路，研究了不同光處理下外源激素噴施前后VvBES1-1基因的表達(dá)水平。研究結(jié)果顯示，不同光處理下VvBES1-1在轉(zhuǎn)基因和野生型煙草中均有表達(dá)，由圖9-A可看出，自然光下煙草中VvBES1-1基因表達(dá)量最高，顯著高于其他材料，約為暗處理下煙草中的20 倍，R4B1 處理下轉(zhuǎn)基因煙草中VvBES1-1的表達(dá)量比野生型多，約為野生型煙草中基因表達(dá)量的3 倍。暗處理下轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草中VvBES1-1基因表達(dá)量較少，同其他兩處理相比未發(fā)生較大變化。圖9-B顯示在激素信號(hào)處理后，隨著濃度的變化，VvBES1-1的表達(dá)量發(fā)生明顯變化。在5 mmol·L-1處理后，紅藍(lán)光下轉(zhuǎn)基因煙草中VvBES1-1的表達(dá)量顯著上升，日光下野生型煙草處理組的表達(dá)水平趨勢(shì)同轉(zhuǎn)基因煙草中的一致均高于對(duì)照組。由此表明，光參與BR 信號(hào)通路，VvBES1-1基因可能在光調(diào)控轉(zhuǎn)基因煙草生長(zhǎng)發(fā)育過程中下調(diào)表達(dá)。

圖9 不同光處理下外源激素噴施前后VvBES1-1基因的表達(dá)水平Fig.9 The expression level of VVBES1-1 gene before and after exogenous hormone spraying under different light processing

2.8 VvBES1-1基因表達(dá)依賴光

前人在擬南芥中的研究表明，BES1蛋白積累模式依賴于光［9］，為驗(yàn)證葡萄中光是否能夠誘導(dǎo)VvBES1-1基因表達(dá)，本研究通過qRT-PCR 進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，與暗處理相比，R4B1 和自然光顯著誘導(dǎo)了VvBES1-1基因的表達(dá)，且在自然光下VvBES1-1的表達(dá)量更高（圖10）。自然光下，VvBES1-1基因表達(dá)水平呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)。轉(zhuǎn)基因煙草在不同光處理2 h 時(shí)，VvBES1-1表達(dá)量均低于0.5 達(dá)到最低，表達(dá)水平呈現(xiàn)自然光＞R4B1＞暗處理的模式；但在不同光處理4 h時(shí)，R4B1下轉(zhuǎn)基因煙草中VvBES1-1的表達(dá)量有所升高，并高于自然光處理；在處理6 h 后又恢復(fù)之前的表達(dá)模式。由此表明，暗處理下，VvBES1-1基因表達(dá)量較低且相對(duì)穩(wěn)定，而在光和R4B1 誘導(dǎo)下VvBES1-1基因表達(dá)量整體顯著升高，表達(dá)水平呈現(xiàn)先減后增的模式；并且R4B1處理4 h后VvBES1-1的表達(dá)量顯著高于自然光，但在其他時(shí)間段剛好相反，這表明葡萄花芽中光誘導(dǎo)VvBES1-1基因表達(dá)。

圖10 R4B1、自然光、黑暗處理不同時(shí)間后轉(zhuǎn)基因煙草中VvBES1-1基因的表達(dá)水平Fig.10 The expression level of VvBES1-1 gene in transgenic tobacco after R4B1，natural light and dark treatment for different time

3 討論

花芽形成同光質(zhì)具有相關(guān)性，光可以通過信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)激素水平來調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)。BR被譽(yù)為“第六激素”，BR 信號(hào)的關(guān)鍵成分調(diào)控多種植物生長(zhǎng)發(fā)育過程和脅迫響應(yīng)［24-27］。對(duì)豌豆、擬南芥、黃瓜和水稻中內(nèi)源BR 水平的研究發(fā)現(xiàn)，BR 在光形態(tài)建成中發(fā)揮積極作用［28-29］。BES1 及其家族成員經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在調(diào)控花器官邊界形成具有重要作用［16，19，24］，但BR 信號(hào)的這些關(guān)鍵成分參與光調(diào)控葡萄花芽分化的分子機(jī)制還不清楚。本研究從紅地球葡萄中克隆獲得BES1 轉(zhuǎn)錄因子VvBES1-1，該基因CDS 全長(zhǎng)為1 026 bp，編碼342 個(gè)氨基酸。

近年來對(duì)BR 信號(hào)的研究不斷深入，BR 信號(hào)的關(guān)鍵因子在其他植物中也得到了一定的研究。辣椒（CapsicumannuumL.）CaBES1［30］和荔枝（LitchichinensisSonn.）LcBES1［31］等都含有BES1_N結(jié)構(gòu)域。本研究結(jié)果顯示VvBES1-1 也含有家族保守的BES1_N 結(jié)構(gòu)域，是典型的BES1 家族蛋白，BES1_N 是該基因行使功能的主要基序。VvBES1-1與擬南芥中BES1家族基因結(jié)構(gòu)類似，暗示VvBES1-1基因功能可能跟擬南芥中的相似，上述研究結(jié)果同前人一致。擬南芥中對(duì)于BES1定位于細(xì)胞核還是細(xì)胞質(zhì)存在爭(zhēng)議，Jiang 等［32］提出BES1蛋白在BES1-S形式（含BES1_N結(jié)構(gòu)域且在該結(jié)構(gòu)域中存在NLS）之外還有一種新的形式BES1_L，并闡明此種形式在N 端多出一段肽段，多出的肽段具有NLS功能，它不僅能促進(jìn)自身的細(xì)胞核定位，還能促進(jìn)BES1-S 和BZR1 的細(xì)胞核定位。本研究結(jié)果顯示，VvBES1-1 在高度保守的BES1_N 結(jié)構(gòu)域存在的情況下，存在一段NLS 促使VvBES1-1 蛋白定位于細(xì)胞核中。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)該蛋白定位于細(xì)胞核的可能性較大，表明該基因可能在細(xì)胞核中調(diào)控BR 信號(hào)通路下游基因，但其在細(xì)胞中的具體位置需進(jìn)一步試驗(yàn)證明。葡萄為果樹，系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示VvBES1-1 和河岸葡萄在同一分支，同芒果、開心果、碧根果、棗等果樹的親緣關(guān)系較近，表明該基因在進(jìn)化過程中保守性較高。

同源基因間因物種不同而表現(xiàn)出不同的組織表達(dá)差異，此種差異可能與生理功能、區(qū)域化分布及物種特異性相關(guān)［33］。LcBES1在檢測(cè)的各荔枝組織和器官中均有表達(dá)，各組織中的表達(dá)量存在差異［31］；GhBES1基因家族成員表達(dá)量具有組織特異性［34］；苦蕎FtBES1在各器官中也具有組織特異性［35］。本研究中，VvBES1-1基因在葡萄不同組織中均有表達(dá)，并呈現(xiàn)明顯的組織表達(dá)特異性，與前人研究結(jié)果類似。Zhang等［4］發(fā)現(xiàn)光照條件下，擬南芥核因子C 亞基蛋白（NUCLEAR FACTOR-Y Subunit C，NF-YC）直接負(fù)調(diào)控BR 合成基因BR6ox2的表達(dá)，抑制BR 途徑調(diào)控下胚軸伸長(zhǎng)。本研究結(jié)果顯示，在R4B1 處理下VvBES1-1基因下調(diào)表達(dá)，受光信號(hào)調(diào)控顯著，與上述前人研究結(jié)果一致，說明在補(bǔ)光后葡萄中的VvBES1-1的表達(dá)可能受到抑制。

植物對(duì)光能的吸收是光合作用及生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)，光和BR 拮抗調(diào)控植物發(fā)育從黑暗條件下暗形態(tài)建成向光照條件下光形態(tài)建成的轉(zhuǎn)換，許多參與光信號(hào)和BR 信號(hào)的突變體具有相似表型，表明光和BR 之間聯(lián)系密切［4］。外源噴施BR 結(jié)果顯示，VvBES1-1響應(yīng)BR 信號(hào)；暗處理下轉(zhuǎn)基因煙草及野生型煙草VvBES1-1表達(dá)量較穩(wěn)定，R4B1 及自然光下VvBES1-1表達(dá)量極顯著，表明VvBES1-1響應(yīng)光信號(hào)。擬南芥中，BR 信號(hào)負(fù)調(diào)控光信號(hào)介導(dǎo)的植物下胚軸抑制作用［4，23］。本研究中對(duì)轉(zhuǎn)基因株系表型分析發(fā)現(xiàn)VvBES1-1過表達(dá)植株具有花期延遲、節(jié)間縮短、植株矮化等特征，同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行不同時(shí)間補(bǔ)光處理后發(fā)現(xiàn)，VvBES1-1基因在R4B1 處理下較對(duì)照組表達(dá)量顯著下降，推測(cè)BR 信號(hào)途徑中VvBES1-1基因可能在光信號(hào)介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草生長(zhǎng)發(fā)育過程中下調(diào)表達(dá)。綜上，VvBES1-1在光信號(hào)介導(dǎo)的紅地球葡萄花芽分化過程中可能發(fā)揮重要作用，本研究為深入分析BES1蛋白在紅地球葡萄花芽分化過程中的調(diào)控功能提供理論依據(jù)，并為VvBES1-1基因參與光介導(dǎo)BR 信號(hào)調(diào)控紅地球葡萄花芽分化機(jī)理的研究提供參考。

4 結(jié)論

本研究從紅地球葡萄中克隆獲得VvBES1-1基因，經(jīng)生物信息學(xué)分析可知，VvBES1-1 可能為BES1-S 型蛋白，同河岸葡萄聚為一類。該轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄激活活性和組織特異性，時(shí)空表達(dá)模式顯示VvBES1-1在花序二級(jí)軸發(fā)育期表達(dá)量達(dá)到最高，R4B1抑制該基因表達(dá)。在煙草中的異源轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)表明，VvBES1-1響應(yīng)BR 信號(hào)，VvBES1-1在光介導(dǎo)BR 信號(hào)調(diào)控花芽分化的過程中呈倒“V”形表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株具花期延遲、節(jié)間縮短等表型特征。綜上所述，VvBES1-1參與光介導(dǎo)BR信號(hào)調(diào)控紅地球葡萄花芽分化，但其表達(dá)量不是決定花芽分化與否的主要因素，后續(xù)還需檢測(cè)開花基因的表達(dá)量，并對(duì)其互作機(jī)制進(jìn)行深入研究。