衛(wèi)甜，楊倩，劉懷阿，朱錦磊，呂敏

（江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇揚(yáng)州 225007）

0 引言

水稻是全世界主糧作物之一，全球近50%的人口以此為食[1]。中國(guó)水稻種植面積居世界第2位[2]。由病原真菌Magnaportheoryzae引起的稻瘟病是水稻生產(chǎn)上一種毀滅性病害，每年可造成10%～30%的產(chǎn)量損失，直接經(jīng)濟(jì)損失更高達(dá)50億美元[3]。目前，主要依靠施用殺菌劑防治稻瘟病，過量使用殺菌劑會(huì)導(dǎo)致病原菌抗性增強(qiáng)、環(huán)境污染加重及稻米殘留等。芽孢桿菌具有對(duì)人畜安全、不污染環(huán)境、病原菌不易產(chǎn)生抗藥性、抗逆性強(qiáng)和促進(jìn)植物生長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，成為稻瘟病防治上的重要生防菌[4]。已有較多關(guān)于芽孢桿菌有效防治稻瘟病的研究報(bào)道。Taguchi 等[5]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌IK-1080 的培養(yǎng)濾液當(dāng)芽孢濃度在1×108CFU/mL 和5×108CFU/mL 時(shí)，葉瘟的發(fā)生率分別減輕13.8%和7.7%，產(chǎn)量損失減少52.2%和73.5%；張芬[6]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌T492對(duì)稻瘟病抑制率達(dá)62.6%；從海洋細(xì)菌中分離的枯草芽孢桿菌HW-14 對(duì)多個(gè)稻瘟病菌生理小種的抑菌圈直徑在18 mm以上[7]；沙月霞等[8]從水稻葉片表面分離獲得2 株枯草芽孢桿菌，其發(fā)酵液對(duì)葉瘟的田間防效為71.5%～85.1%，對(duì)穗瘟的田間防效則為63.5%～85.6%；官穎[9]發(fā)現(xiàn)的特基拉芽孢桿菌GYLH-1對(duì)防治稻瘟病具有顯著效果。

基于合理利用有益微生物資源，開發(fā)高效、安全的生防菌劑的目的，本研究選用實(shí)驗(yàn)室前期酶活、平板拮抗等初步篩選防治稻瘟病的表現(xiàn)最佳的2株高地芽孢桿菌[10]，在溫室及田間條件確定菌株的防病促生能力，得到防效高和促進(jìn)水稻生長(zhǎng)的生防菌株，以期為其田間高效應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

高地芽孢桿菌(Bacillusaltitudinis)JYW21、JYW26于2018 年在江蘇省揚(yáng)州市廣陵區(qū)灣頭水稻試驗(yàn)基地稻瘟病發(fā)生嚴(yán)重的田塊分離篩選得到。稻瘟病病原真菌由江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所植物保護(hù)研究室分離保存。

供試水稻品種為‘南粳9108’，用于2 株高地芽孢桿菌防治及促生效果測(cè)定。將水稻種子進(jìn)行表面消毒（70%無水乙醇表面消毒1～2 min，滅菌水潤(rùn)洗5次），催芽播種于裝滿基質(zhì)（營(yíng)養(yǎng)土:蛭石為1:1）的一次性塑料杯中，每杯12粒，置于溫度28℃、相對(duì)濕度70%、光周期為16 h/8 h的溫室中培養(yǎng)2周后進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)研究。

1.2 B.altitudinis發(fā)酵液及稻瘟病菌懸浮液的制備

1.2.1B.altitudinis發(fā)酵液制備B.altitudinisJYW21、JYW26在LB培養(yǎng)基平板上37℃活化培養(yǎng)16～24 h，挑選單菌落轉(zhuǎn)接到LB 試管液體培養(yǎng)液中培養(yǎng)16～18 h(28℃，200 r/min)。接著將培養(yǎng)好的種子液以1%的接種量轉(zhuǎn)入滅菌的LB三角瓶培養(yǎng)液中28℃200 r/min擴(kuò)大培養(yǎng)24 h，稀釋濃度為1×108～1×109CFU/mL備用。

1.2.2 稻瘟病菌懸浮液制備使用滅菌接種針將4℃斜面保存的稻瘟病真菌轉(zhuǎn)接到PDA 固體平板培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)5～7 d，接著轉(zhuǎn)接到玉米稻稈粉固體培養(yǎng)基上讓其繼續(xù)生長(zhǎng)至菌落長(zhǎng)滿培養(yǎng)基；用滅菌水輕輕洗去菌絲后放置黑光燈下3 d誘導(dǎo)產(chǎn)孢；最后加入適量滅菌清水將平板培養(yǎng)基上的稻瘟菌分生孢子沖洗下來；收集沖洗液并用兩層紗布過濾，通過顯微鏡觀察計(jì)數(shù)，調(diào)整菌液濃度為10 倍顯微鏡下每個(gè)視野有20～60 個(gè)孢子備用。

1.3 離體葉片法評(píng)價(jià)B.altitudinis對(duì)稻瘟病的生防效果

按照1.2的方法分別制備B.altitudinis發(fā)酵液及稻瘟病菌孢子懸浮液。剪取5 cm 長(zhǎng)健康水稻葉片分別放入2 株B.altitudinis發(fā)酵液中于搖床200 r/min 振蕩浸泡1 h，對(duì)照在無菌水中浸泡1 h；在9 cm培養(yǎng)皿底部鋪一張濾紙，再在濕潤(rùn)的濾紙上放置滅菌牙簽，在牙簽上放置浸泡后葉片，然后將其放在人工氣候箱培養(yǎng)72 h；用滅菌牙簽輕刺葉段表面，每個(gè)葉段刺傷5個(gè)點(diǎn)，用移液槍吸取10μL稻瘟病菌抱子懸浮液分別接種在刺傷的5 個(gè)點(diǎn)上，每個(gè)處理15 個(gè)葉段，重復(fù)3 次；所有處理在人工氣候箱培養(yǎng)7 d后調(diào)查接種點(diǎn)稻瘟病病斑數(shù)量，根據(jù)病斑擴(kuò)展面積計(jì)算病情指數(shù)[11-12]。

1.4 溫室評(píng)價(jià)B.altitudinis對(duì)稻瘟病的生防效果

參照1.2方法將稀釋好的B.altitudinis發(fā)酵液加入終濃度為0.01%吐溫-20 后均勻噴施植物。B.altitudinis處理水稻葉片5 d 后噴霧接種稻瘟病菌，確保所有葉片均勻布滿菌液。將水稻置于100%濕度的溫室中培養(yǎng)24 h。接種稻瘟病菌20 d后開始統(tǒng)計(jì)水稻病株數(shù)，病情指數(shù)和防效的計(jì)算如式(1)～(2)。

1.5 B.altitudinis對(duì)水稻種子萌發(fā)及秧苗生長(zhǎng)影響

參照何龍生[13]的試驗(yàn)方法，略有改動(dòng)。水稻種子經(jīng)表面消毒后，置于B.altitudinis發(fā)酵液中浸泡1 d，以清水浸泡為對(duì)照；將處理好的種子均勻放入鋪好2 層濾紙的培養(yǎng)皿中催芽，隨機(jī)數(shù)取100粒，4次重復(fù)；種子發(fā)芽過程中保持濾紙濕潤(rùn)即可；將培養(yǎng)皿置于28℃、16 h 光照/8 h 黑暗的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d 后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽種子數(shù)，計(jì)算發(fā)芽率，如式(3)。培養(yǎng)至15 d，測(cè)量并記錄所有種子秧苗長(zhǎng)及整株鮮重。

1.6 溫室評(píng)價(jià)B.altitudinis對(duì)水稻促生作用

參照1.2方法將稀釋好的B.altitudinis發(fā)酵液加入終濃度為0.01%吐溫-20后噴施水稻，以噴施清水作為對(duì)照。B.altitudinis噴施30 d后測(cè)量水稻株高、地上部分鮮重、根長(zhǎng)、根重及葉片葉綠素含量等指標(biāo)。葉片葉綠素含量測(cè)定使用植物葉綠素含量檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。

1.7 田間評(píng)價(jià)B.altitudinis對(duì)水稻防病促生效果

選取健康且長(zhǎng)勢(shì)一致的‘南粳9108’水稻種子放入1×108CFU/mLB.altitudinis的發(fā)酵培養(yǎng)液中浸種1 h后清水浸泡催芽。將露白種子播種于水稻育秧池中，20 d后調(diào)查水稻秧苗的株高和整株鮮重。將噴施JYW21、JYW26及清水對(duì)照的秧苗分別進(jìn)行移栽，每小區(qū)面積25 m2，設(shè)3 個(gè)重復(fù)。水稻插秧后35 d 第2 次噴霧B.altitudinis發(fā)酵液，60 d 左右調(diào)查葉瘟、株高及分蘗數(shù)，100 d左右調(diào)查穗瘟、稻曲病及紋枯病發(fā)生情況。收割時(shí)調(diào)查水稻穗長(zhǎng)、穗重和千粒重，計(jì)算B.altitudinis對(duì)水稻的促生效果。病情指數(shù)調(diào)查方法參照《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則》，調(diào)查方法為每小區(qū)內(nèi)對(duì)角線5 點(diǎn)取樣，每點(diǎn)查10叢稻，每叢稻查5片葉，共計(jì)50片葉。

1.8 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS和Excel 2013進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖，并通過最小極差法(LSD)比較不同處理下指標(biāo)差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 B.altitudinis對(duì)稻瘟病的生防效果

采用不同試驗(yàn)條件驗(yàn)證B.altitudinis的生防效果。離體葉片法B.altitudinisJYW21、JYW26 對(duì)葉瘟防效在96%以上，2 個(gè)處理之間無明顯顯著差異（表1）；溫室噴霧接種稻瘟病，B.altitudinisJYW26對(duì)稻瘟病的防效達(dá)到79.83% ，而B.altitudinisJYW21 高達(dá)82.39%；田間自然發(fā)病，B.altitudinisJYW21、JYW26 對(duì)葉瘟的防效可達(dá)55%以上，穗瘟則高達(dá)70%以上，2 個(gè)菌株之間無顯著差異。根據(jù)不同條件下2 株高地芽孢桿菌對(duì)稻瘟病的生防效果可知，B.altitudinisJYW21、JYW26 均可顯著降低稻瘟病發(fā)生。

表1 高地芽孢桿菌不同條件下對(duì)葉瘟的生防效果

2.2 B.altitudinis對(duì)水稻其他病害的田間防效

除調(diào)查稻瘟病，田間條件下調(diào)查了2 株高地芽孢桿菌對(duì)水稻其他主要病害（紋枯病、稻曲?。┑纳佬ЧY(jié)果如表2所示。B.altitudinisJYW26對(duì)紋枯病和稻曲病的田間防效分別為41.43%和66.89%；JYW21對(duì)紋枯病和稻曲病的防效分別為63.76%和36.49%。由此可見，B.altitudinisJYW26 對(duì)稻曲病的防效優(yōu)于紋枯病，而B.altitudinisJYW21 對(duì)紋枯病的防效優(yōu)于稻曲病。

表2 高地芽孢桿菌對(duì)水稻其他主要病害的生防效果

2.3 B.altitudinis對(duì)水稻促生作用

2.3.1 對(duì)水稻種子萌發(fā)及秧苗生長(zhǎng)的促進(jìn)通常用發(fā)芽率反映種子發(fā)芽能力，發(fā)芽率越高，增產(chǎn)潛力越大。由表3可以看出，2株高地芽孢桿菌處理后水稻種子發(fā)芽率均顯著高于清水對(duì)照(91.75%)，提升率大于6%，可顯著促進(jìn)水稻種子萌發(fā)。B.altitudinisJYW26 處理水稻苗高為12.02 cm，相比清水對(duì)照提升14.91%；鮮重為0.18 g，提升率為28.57%。B.altitudinisJYW21處理水稻苗高為11.81 cm，相比清水對(duì)照提升12.91%；鮮重為0.17 g，相比清水對(duì)照提升21.43%。由此說明，2株高地芽孢桿菌能顯著促進(jìn)水稻種子萌發(fā)及秧苗生長(zhǎng)。

表3 高地芽孢桿菌對(duì)水稻種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)影響

2.3.2 溫室條件下對(duì)水稻植株生長(zhǎng)的促進(jìn)溫室促生試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，B.altitudinisJYW21 和JYW26 處理后分別促進(jìn)水稻株高增加24.67%和18.67%、鮮重增加64.04%和61.79%、根重增加24.71%和25.88%、根長(zhǎng)增加30.96%和27.94%（表4）。B.altitudinisJYW21 和JYW26 在促進(jìn)水稻株高、鮮重、根長(zhǎng)及根重方面均不存在顯著差異。

表4 溫室條件下高地芽孢桿菌對(duì)水稻植株生長(zhǎng)影響

2.3.3 對(duì)水稻葉片葉綠素含量的促進(jìn)如圖1所示，2株高地芽孢桿菌顯著增加了水稻葉片中葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量，B.altitudinisJYW21提高水稻葉片葉綠素含量作用更顯著，推測(cè)這可能是高地芽孢桿菌促進(jìn)水稻生長(zhǎng)的原因之一。

圖1 高地芽孢桿菌對(duì)水稻葉片葉綠素含量影響

2.3.4 田間條件下對(duì)水稻生長(zhǎng)的促進(jìn)田間條件下，B.altitudinis處理水稻種子20 d 后測(cè)量秧苗高及鮮重。由表5 可知，相對(duì)清水對(duì)照，B.altitudinisJYW21 對(duì)水稻秧苗期苗高及鮮重不存在顯著差異，促生作用不明顯，而B.altitudinisJYW26可提升秧苗高23.96%、鮮重63.64%。到水稻抽穗前期，由表6 可知，B.altitudinisJYW21與JYW26對(duì)促進(jìn)水稻株高差異不顯著，但可顯著增加其分蘗數(shù)（分別為20.59%、15.27%）；在促產(chǎn)效果方面（表7），B.altitudinisJYW21、JYW26 能顯著增加水稻千粒重（分別為4.77%、1.25%），兩者對(duì)增加穗長(zhǎng)均無顯著差異。B.altitudinisJYW21 可顯著增加19.55%穗重，在促產(chǎn)方面JYW21田間表現(xiàn)更為突出。

表5 田間條件下高地芽孢桿菌對(duì)水稻秧苗生長(zhǎng)影響

表6 田間條件下高地芽孢桿菌對(duì)水稻植株生長(zhǎng)影響

表7 田間條件下高地芽孢桿菌對(duì)水稻產(chǎn)量影響

3 結(jié)論

高地芽孢桿菌對(duì)葉瘟防效可達(dá)55%以上，對(duì)穗瘟防效則高達(dá)70%以上，對(duì)水稻紋枯病、稻曲病同樣具有較高防效，對(duì)水稻生長(zhǎng)及產(chǎn)量具有顯著促進(jìn)作用。表明篩選到的高地芽孢桿菌可能存在廣譜抗病作用，是一類有潛力的生防細(xì)菌；在水稻綠色生產(chǎn)過程中，高地芽孢桿菌同樣具有良好的推廣應(yīng)用價(jià)值。

4 討論

有關(guān)高地芽孢桿菌用于植物生物防治的研究較少。目前報(bào)道了從辣椒根際土壤中篩選到B.altitudinis181-7 及ST15 能有效抑制水稻細(xì)菌性條斑生長(zhǎng)[14-15]；張秀雨等[16]發(fā)現(xiàn)B.altitudinisD30202對(duì)十字花科雜草自生油菜的除草活性最為顯著，同時(shí)對(duì)青稞、小麥表現(xiàn)出較高的安全性，可開發(fā)為禾本科作物田十字花科雜草的生物除草劑；靳西彪[17]從海洋中分離到的一株B.altitudinisZJ186，其發(fā)酵液對(duì)稻瘟病防效可達(dá)83.33%。本研究選用2 株高地芽孢桿菌，通過溫室及田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)稻瘟病有較高的生防效果，對(duì)葉瘟防效可達(dá)55%以上，穗瘟則高達(dá)70%以上，對(duì)水稻其他主要病害同樣具有較高防效，由此推測(cè)2 株高地芽孢桿菌可能存在廣譜抗病作用，是一類有潛力的生防細(xì)菌。前人研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌防治植物病害的機(jī)理主要包括產(chǎn)生脂肽類抗生素和拮抗蛋白2 類拮抗因子、對(duì)病原菌產(chǎn)生拮抗及誘導(dǎo)抗病性等[18]。本研究中涉及的2 株B.altitudinis對(duì)稻瘟病的防治機(jī)理有待進(jìn)一步研究明確。

2 株B.altitudinis除可防治稻瘟病外，對(duì)水稻也具有顯著促生作用。近年研究表明，微生物菌劑可直接提高植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收從而調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)；還可利用其產(chǎn)生的抗菌活性成分或通過生態(tài)位和營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)等方式控制病原生物的生長(zhǎng)繁殖從而間接促進(jìn)植物增產(chǎn)[19-21]。楊華等[22]從水稻根圍微生物中篩選到6 株在固氮或溶解有機(jī)和無機(jī)磷、鉀或產(chǎn)鐵載體和IAA綜合水平較高的菌株，種子萌發(fā)率可提高25%～43%，根長(zhǎng)增加18%～42%；劉澤平等[23]分析土壤中有效鉀、有效磷的積累，發(fā)現(xiàn)B.megateriumLZP03、B.huizhouensisLZP05 和B.subtilisLZP06 促生能力較強(qiáng)，具有較強(qiáng)的開發(fā)利用潛力；B.altitudinisY1 可產(chǎn)生生長(zhǎng)素和分解有機(jī)及無機(jī)磷，提高大豆株高和根長(zhǎng)[24]。本研究中涉及的B.altitudinisJYW21及JYW26田間試驗(yàn)促進(jìn)水稻株高差異不顯著，但可顯著提升其分蘗數(shù)、千粒重。B.altitudinisJYW21 可顯著增加19.74%穗重，在促產(chǎn)方面JYW21表現(xiàn)更為突出。猜測(cè)B.altitudinisJYW21浸種處理對(duì)秧苗苗長(zhǎng)及鮮重前期作用均不明顯，可能是B.altitudinisJYW21 種子處理效果不如JYW26；在后期噴霧處理分蘗數(shù)及產(chǎn)量均顯著高于JYW26，分析原因可能是產(chǎn)生了生長(zhǎng)素、脫落酸、細(xì)胞分裂素等植物激素影響水稻組織中抗病相關(guān)防御酶、生長(zhǎng)代謝相關(guān)蛋白等的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)植物生長(zhǎng)和增強(qiáng)抗逆能力，最終提高水稻植株抗病促生能力[25-27]。2 株高地芽孢桿菌可增加水稻葉片葉綠素的含量，這可能也是該菌促進(jìn)水稻生長(zhǎng)的原因之一[28]。