劉 莉

（寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腫瘤研究所，寧夏 銀川，750001）

皮膚鱗狀細(xì)胞癌簡(jiǎn)稱皮膚鱗癌，屬于惡性腫瘤，在國(guó)內(nèi)外均較為常見。該疾病來(lái)源于皮膚的鱗狀上皮組織，屬于非黑色素瘤皮膚癌[1-2]。近些年，由于環(huán)境污染與人口老齡化的原因，皮膚癌的發(fā)病率也隨之升高，有研究顯示，在我國(guó)皮膚惡性腫瘤中，皮膚鱗狀細(xì)胞癌的比例占到80.0%，且發(fā)病率仍在上升，對(duì)人類生命安全造成嚴(yán)重的威脅[3]。皮膚鱗癌的病因至今仍未明確，可能與紫外照射損傷、人乳頭瘤病毒、免疫抑制、砷角化病、放射性皮炎、黏膜白斑、瘢痕和白化病等有關(guān)[4-5]。皮膚鱗癌的發(fā)生僅次于基底細(xì)胞癌，占非黑色素瘤皮膚癌的20%。與基底細(xì)胞癌不同，皮膚鱗癌具有高度的侵襲能力，因此容易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[6]。早期的皮膚鱗癌可以通過(guò)手術(shù)切除，但是對(duì)發(fā)生轉(zhuǎn)移的皮膚鱗癌患者的長(zhǎng)期預(yù)后效果很差，1年的生存率為50%，5年的生存率僅有5%，而對(duì)于復(fù)發(fā)的患者，5年的生存率也不到10%[7]。核因子KappaB（NF-κB）存在于人體內(nèi)，屬于重要的轉(zhuǎn)錄因子，在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用，NF-κBp65是常見的NF-κB類型[8]。近年來(lái)研究證明，在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中，NF-KBp65蛋白呈現(xiàn)出低表達(dá)狀態(tài)，而且當(dāng)病情加重時(shí)，其表達(dá)水平也隨之降低[9]。Toll樣受體4（Toll-like recepTor 4，TLR4）不僅可以識(shí)別胞外抗原，對(duì)胞內(nèi)損傷相關(guān)因子也起到應(yīng)答作用，進(jìn)而促使細(xì)胞分泌炎性因子和干擾素[10]。本研究具體探討與分析了TLR4/NF-κB p65高表達(dá)對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，以明確TLR4/NF-κB p65的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

研究時(shí)間為2020年2月—2023年2月，自武漢普諾賽生命科技有限公司購(gòu)買人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞株，細(xì)胞培養(yǎng)于含10.0%胎牛血清（生產(chǎn)企業(yè)：杭州四季青生物公司）、100 U/ml青霉素（生產(chǎn)企業(yè)：上海生物工程有限公司）、0.1 mg/ml鏈霉素（生產(chǎn)企業(yè)：上海生物工程有限公司）的DMEM低糖液體培養(yǎng)液（生產(chǎn)企業(yè)：美國(guó)InviTrogene公司）中，超表達(dá)載體-pc3.0-TLR4NF-κB p65與空載體pc3.0由本實(shí)驗(yàn)室保存，LipofecTamine 2 000購(gòu)自美國(guó)InviTrogene公司。Transwell小室、MTT試劑盒、AnnexinV-FITC試劑盒都購(gòu)自碧云天公司，抗Caspase-9蛋白、抗Myc蛋白購(gòu)自美國(guó)InviTrogene公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

A431細(xì)胞在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞?？瞻捉M不進(jìn)行轉(zhuǎn)染，加入等量的DMEM培養(yǎng)基；對(duì)照組的轉(zhuǎn)染物質(zhì)為pc3.0空載體，實(shí)驗(yàn)組的轉(zhuǎn)染物質(zhì)為pc3.0-TLR4NF-κB p65載體。

1.3 TLR4/NF-κB p65 RNA表達(dá)檢測(cè)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h、48 h，收獲細(xì)胞，并提取總RNA（方法為：Trizol法），使用qRT-PCR方法檢測(cè)mTLR4/NF-κB p65的表達(dá)水平，配制20μL體系，行定量PCR檢測(cè)，每個(gè)反應(yīng)3個(gè)復(fù)孔。PCR條件：95 ℃3 min，35個(gè)循環(huán)：95 ℃12 s，56 ℃ 50 s。

1.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)染后24 h、48 h的細(xì)胞，行胰酶消化，隨后取細(xì)胞，使用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以1×103/孔接種細(xì)胞到96孔板中，將其放入37 ℃孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后加入MTT溶液10μl/孔，再將其放入37 ℃孵箱，培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)為1 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm測(cè)定OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖活性。

1.5 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移指數(shù)

轉(zhuǎn)染24 h、48 h后，將細(xì)胞進(jìn)行鋪板，位置：Transwell小室里的上層、下層加入DMEM+10.0%胎牛血清培養(yǎng)基600 μl，把Transwell小室放進(jìn)24孔板里，培養(yǎng)24 h后取出，多聚甲醛固定并用結(jié)晶紫染色，選擇5個(gè)隨機(jī)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞侵襲指數(shù)與細(xì)胞轉(zhuǎn)移指數(shù)。

1.6 Western blot法檢測(cè)Caspase-9、Myc蛋白表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染24 h、48 h后，收集細(xì)胞并加入細(xì)胞裂解液，充分裂解后以12 000 r/min離心，定量蛋白濃度后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，采用5.0%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉。加入抗Caspase-9蛋白、抗Myc蛋白，稀釋濃度分別為1:500與1:1 000，洗膜后加入二抗，室溫孵育1 h，洗膜后用化學(xué)發(fā)光劑顯色，使用凝膠成像儀，觀察目的蛋白條帶表達(dá)情況，以β-acTin作為內(nèi)參蛋白，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

上述實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次，取平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

選擇SPSS 22.0軟件對(duì)本研究所有的計(jì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，描述計(jì)量數(shù)據(jù)為（），兩組間比較行t檢驗(yàn)，多組間比較行方差分析。P＜0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TLR4/NF-κB p65 RNA表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染24 h、48 h后，實(shí)驗(yàn)組的TLR4、NF-κB p65 RNA表達(dá)水平均較對(duì)照組與空白組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），空白組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 三組轉(zhuǎn)染不同時(shí)間點(diǎn)后的TLR4/NF-κB p65 RNA表達(dá)水平比較 （）

表1 三組轉(zhuǎn)染不同時(shí)間點(diǎn)后的TLR4/NF-κB p65 RNA表達(dá)水平比較 （）

注：與對(duì)照組相比，①P＜0.05。

組別例數(shù)轉(zhuǎn)染24 h TLR4NF-κB p65 轉(zhuǎn)染48 h TLR4NF-κB p65實(shí)驗(yàn)組3 21.44±1.44① 20.45±1.11① 24.33±1.47① 22.33±1.68①對(duì)照組31.32±0.311.61±0.121.34±0.231.64±0.12空白組31.36±0.221.67±0.141.37±0.021.65±0.18 F 546.429838.367715.181447.375 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2 細(xì)胞增殖指數(shù)

轉(zhuǎn)染24 h、48 h后，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖指數(shù)顯著低于空白組與對(duì)照組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），對(duì)照組與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 三組轉(zhuǎn)染不同時(shí)間點(diǎn)后的細(xì)胞增殖指數(shù)比較 （，%）

表2 三組轉(zhuǎn)染不同時(shí)間點(diǎn)后的細(xì)胞增殖指數(shù)比較 （，%）

注：與對(duì)照組相比，①P＜0.05。

組別例數(shù)24 h48 h實(shí)驗(yàn)組3 45.87±3.14① 56.69±4.21①對(duì)照組3 78.20±13.2989.20±4.39空白組378.44±2.8789.60±3.57 F 18.624 24.932 P＜0.001＜0.001

2.3 細(xì)胞侵襲指數(shù)與細(xì)胞轉(zhuǎn)移指數(shù)

轉(zhuǎn)染24 h、48 h后，在細(xì)胞侵襲指數(shù)與細(xì)胞轉(zhuǎn)移指數(shù)方面，實(shí)驗(yàn)組均較空白組、對(duì)照組低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），對(duì)照組與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 三組轉(zhuǎn)染不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞侵襲指數(shù)與細(xì)胞轉(zhuǎn)移指數(shù)比較 （，%）

表3 三組轉(zhuǎn)染不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞侵襲指數(shù)與細(xì)胞轉(zhuǎn)移指數(shù)比較 （，%）

注：與對(duì)照組相比，①P＜0.05。

細(xì)胞轉(zhuǎn)移指數(shù)實(shí)驗(yàn)組3 23.82±4.14① 26.82±3.85① 23.67±1.58① 26.82±2.74①對(duì)照組345.24±6.4468.24±6.4451.44±2.1871.55±3.17空白組345.78±4.6368.78±5.6351.87±2.5771.92±1.48 F 18.647 24.638 23.576 12.853 P＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001組別例數(shù)轉(zhuǎn)染24 h細(xì)胞侵襲指數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)移指數(shù)轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞侵襲指數(shù)

2.4 Caspase-9/Myc蛋白表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染24 h、48 h后，實(shí)驗(yàn)組的Caspase-9/Myc蛋白相對(duì)表達(dá)水平與空白組、對(duì)照組相比顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），空白組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 三組轉(zhuǎn)染不同時(shí)間點(diǎn)后的Caspase-9/Myc蛋白表達(dá)水平比較 （）

表4 三組轉(zhuǎn)染不同時(shí)間點(diǎn)后的Caspase-9/Myc蛋白表達(dá)水平比較 （）

注：與對(duì)照組相比，①P＜0.05。

組別例數(shù)轉(zhuǎn)染24 h Caspase-9Myc 轉(zhuǎn)染48 h Caspase-9Myc實(shí)驗(yàn)組326.17±1.43①28.40±1.26①26.69±1.57①28.73±2.17①對(duì)照組3 15.47±2.38 14.20±1.44 15.99±1.49 17.84±1.43空白組3 15.20±1.56 14.07±1.31 15.94±2.17 17.74±1.32 F 34.739113.534 36.735 42.263 P 0.001＜0.001＜0.001＜0.001

3 討論

當(dāng)前皮膚鱗狀細(xì)胞癌對(duì)人們健康的威脅日益嚴(yán)重，雖然當(dāng)前醫(yī)療技術(shù)顯著提高，但患者的5年病死率一直居高不下[11]。至今為止，該疾病的發(fā)病機(jī)制仍不明確，涉及的病因包括炎性反應(yīng)因子、外傷、人乳頭瘤狀病毒感染、長(zhǎng)期暴露于不良環(huán)境、免疫抑制狀態(tài)等[12]。當(dāng)前皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生具有逐漸上升的趨勢(shì)，尤其是在老年人中的發(fā)病率逐年增高，嚴(yán)重威脅著人類的健康[12]。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h、48 h后，實(shí)驗(yàn)組的TLR4、NF-κB p65 RNA表達(dá)水平較對(duì)照組、空白組高（P＜0.05），空白組與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖指數(shù)顯著低于空白組與對(duì)照組（P＜0.05），對(duì)照組與空白組比較無(wú)明顯差異（P＞0.05），表明TLR4/NF-κB p65高表達(dá)能抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖。從機(jī)制上分析，Toll樣受體在固有免疫及獲得免疫過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，是哺乳類動(dòng)物細(xì)胞表面的跨膜受體[13]。TLR4是Toll樣受體的主要成員之一，可以識(shí)別各種與損傷有關(guān)的分子模式（damage-associaTedmolecularpaTTern，DAMPs）、病原有關(guān)分子模型（pathogen-associated molecular paTTern，PAMP），可激活下游NF-κB p65的表達(dá)，引起多種炎性反應(yīng)介質(zhì)的釋放，從而介導(dǎo)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)與炎性反應(yīng)。TLR4/NF-κB p65高表達(dá)可調(diào)節(jié)腫瘤浸潤(rùn)免疫作用，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖[14-15]。

皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展是多步驟、多因素共同作用的結(jié)果，在非黑色素瘤皮膚癌中，該疾病的發(fā)病率處于第二位，病死率一直比較高。當(dāng)前研究顯示，TLR4介導(dǎo)炎性反應(yīng)信號(hào)通路的持續(xù)激活，還可調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖活性，TLR4信號(hào)通路的活化可抑制多種惡性腫瘤的異常增殖[16]。TLR4在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的高表達(dá)可促進(jìn)炎性反應(yīng)，抑制腫瘤惡化[17]。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h、48 h后，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞侵襲指數(shù)與細(xì)胞轉(zhuǎn)移指數(shù)都明顯低于空白組與對(duì)照組（P＜0.05），對(duì)照組與空白組對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明TLR4/NF-κB p65高表達(dá)能抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移。從機(jī)制上分析，TLR4是Toll樣受體家族亞型中最重要的成員，不僅廣泛表達(dá)于免疫原性細(xì)胞，也表達(dá)于多種軀體惡性腫瘤與腦腫瘤細(xì)胞中，與多種腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)。TLR4在發(fā)揮抗腫瘤作用時(shí)，可通過(guò)T細(xì)胞的方式，TLR4在誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答時(shí)，可通過(guò)Myd88依賴性途徑間接誘導(dǎo)，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤抵抗作用[18]。TLR4還可通過(guò)活化多種信號(hào)途經(jīng)激活Fas介導(dǎo)的途徑，可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，也可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[19]。

皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展與多種信號(hào)通路失調(diào)有關(guān)，在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中有多個(gè)蛋白表達(dá)水平發(fā)生異常。特別是在腫瘤的發(fā)生與蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)等相關(guān)程序的啟動(dòng)與激活密切相關(guān)，因而參與細(xì)胞凋亡過(guò)程。細(xì)胞凋亡等相關(guān)級(jí)聯(lián)反應(yīng)主要是由Caspase蛋白家族介導(dǎo)執(zhí)行，其中Caspase-9、Myc作為凋亡啟動(dòng)因子，非常重要，對(duì)其表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)后，其結(jié)果可作為細(xì)胞凋亡發(fā)生情況的間接反映。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h、48 h后，實(shí)驗(yàn)組的Caspase-9/Myc蛋白相對(duì)表達(dá)水平與空白組、對(duì)照組相比顯著增高（P＜0.05），空白組與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明TLR4/NF-κB p65高表達(dá)能促進(jìn)皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的Caspase-9/Myc蛋白表達(dá)水平，從而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。上調(diào)TLR4的表達(dá)可將c-Myc和K-Ras相關(guān)通路激活，將促進(jìn)Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[20]。不過(guò)本研究也有一定的不足，實(shí)驗(yàn)分組比較少，尤其是沒有進(jìn)行劑量分析，也沒有進(jìn)行相應(yīng)的臨床與動(dòng)物模型分析，將在之后的研究中進(jìn)行深入分析。

綜上所述，TLR4/NF-κB p65高表達(dá)能抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、侵襲，也可促進(jìn)Caspase-9/Myc蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。