唐智群,鮑喆煊,聶敏

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔黏膜病科,廣東省口腔組織修復(fù)與重建工程技術(shù)研究中心,廣州市口腔再生醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州510182;2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周病科,廣東省口腔組織修復(fù)與重建工程技術(shù)研究中心,廣州市口腔再生醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州510182)

口腔黏膜下纖維化(OSF)又稱(chēng)口腔黏膜下纖維性變,是一種常見(jiàn)的慢性進(jìn)行性口腔黏膜疾病,臨床上常表現(xiàn)為進(jìn)食刺激性食物疼痛、進(jìn)行性張口受限、吞咽困難[1],典型的病理變化為黏膜固有層及黏膜下層膠原纖維堆積、變性,因其具有癌變傾向,在1987年被世界衛(wèi)生組織列為癌前狀態(tài)[2]。OSF病因復(fù)雜,發(fā)病機(jī)制尚不明確,目前認(rèn)為,咀嚼檳榔是OSF的高危因素。在我國(guó)湖南、海南、臺(tái)灣等有咀嚼檳榔習(xí)慣的地區(qū),OSF的發(fā)病率可達(dá)0.9%～17.6%[3-4],癌變率可達(dá)1.2%～4.32%[3,5]。隨著檳榔產(chǎn)業(yè)的擴(kuò)大及咀嚼檳榔習(xí)慣的流行,OSF及癌變的患者數(shù)量在逐年增加且有全國(guó)蔓延的趨勢(shì),已逐漸成為嚴(yán)重危害公共健康的社會(huì)問(wèn)題。目前OSF的治療主要使用糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物,但是長(zhǎng)期使用此類(lèi)藥物會(huì)出現(xiàn)全身不良反應(yīng)。中醫(yī)學(xué)歷史悠久,且中醫(yī)藥具有患者依從性好、副作用少、作用靶點(diǎn)多的特點(diǎn),近年來(lái)各種具有活血化瘀功效的中藥已逐漸被應(yīng)用于OSF的臨床治療中[6]。

紅花-牛膝有活血散瘀、通經(jīng)止痛的功效,藥理研究發(fā)現(xiàn)兩者具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗炎、抗氧化、擴(kuò)張血管改善微循環(huán)障礙等作用。含有紅花-牛膝的活血化瘀方劑已被廣泛應(yīng)用于OSF的臨床治療中,但由于其成分靶點(diǎn)眾多,很難確定其具體機(jī)制,因此對(duì)紅花-牛膝的潛在作用機(jī)制進(jìn)行研究,有助于更好地處理紅花-牛膝臨床常用劑量、配伍及量效之間的關(guān)系。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)紅花-牛膝的有效成分及紅花-牛膝與OSF的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析,以期為臨床上應(yīng)用紅花-牛膝治療OSF提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 收集紅花-牛膝活性成分及其靶點(diǎn)以類(lèi)藥性(DL)>0.18、口服生物利用度(OB>30%)為篩選條件[7],在TCMSP平臺(tái)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索“紅花”“牛膝”的活性成分。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)SwissTargetPrediction (http://www.swisstargetprediction.ch)[8]獲得這些活性成分的潛在作用靶點(diǎn)。合并相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)去重后,得到紅花-牛膝的活性成分的相關(guān)靶基因。

1.2 收集OSF疾病相關(guān)靶點(diǎn)以“oral submucous fibrosis”為檢索詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org)和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.disgenet.org)[9]中得到OSF的靶點(diǎn)并去重。

1.3 繪制“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)取紅花-牛膝活性成分的靶點(diǎn)和OSF靶點(diǎn)的交集,利用Cytoscape 3.9.1繪制“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,主要活性成分通過(guò)度值(degree)篩選[9]。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建紅花-牛膝的活性成分和OSF的交集靶點(diǎn)在STRING平臺(tái)(https://string-db.org)繪制PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖,核心蛋白通過(guò)度值進(jìn)行篩選。

1.5 分子對(duì)接將“1.3”項(xiàng)下得到的度值排名前5的活性成分與“1.4”項(xiàng)下得到的PPI網(wǎng)絡(luò)中度值前6的核心蛋白進(jìn)行分子對(duì)接分析?；钚苑肿拥慕Y(jié)構(gòu)從PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)獲取[10],而核心蛋白的結(jié)構(gòu)從Protein Data Bank(PDB)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取,利用AutoDock Vina進(jìn)行分子對(duì)接分析。結(jié)合能<-5.0 kcal·mol-1表示結(jié)合力良好[11]。對(duì)接結(jié)果應(yīng)用PyMOL繪制結(jié)合模式圖進(jìn)行展示。

1.6 GO和KEGG富集分析在DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov)[12]中對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析[9],用R語(yǔ)言繪圖。在Cytoscape中進(jìn)行“藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-疾病-信號(hào)通路”圖的繪制[9]。

2 結(jié)果

2.1 紅花-牛膝靶點(diǎn)收集到紅花的活性成分16個(gè)、牛膝的活性成分15個(gè),其中有6個(gè)為共有活性成分(見(jiàn)表1)。25個(gè)活性成分共2 745個(gè)相關(guān)基因,去重后最終共收集到靶點(diǎn)基因631個(gè)。

表1 紅花-牛膝主要活性成分信息

2.2 OSF靶點(diǎn)整合GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)得到669個(gè)OSF靶點(diǎn)基因,DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)106個(gè),去重后為703個(gè)OSF靶點(diǎn)基因。疾病與活性成分交集靶點(diǎn)為77個(gè)。

2.3 “中藥活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)對(duì)“2.2”項(xiàng)下得到的77個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的繪制(見(jiàn)圖1)。其中度值前15的活性成分見(jiàn)表2。其中木犀草素(luteolin)、γ-谷甾醇(poriferast-5-en-3beta-ol)、黃芩苷(baicalin)、黃連素(berberine)、黃連堿(coptisine)等活性成分度值較大。

▲牛膝為NX、紅花為HH;■為靶點(diǎn)基因;○內(nèi)為活性成分

表2 “活性成分-靶點(diǎn)”中度值前 15 的活性成分

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析將“2.2”項(xiàng)下得到的77個(gè)交集靶點(diǎn)繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖2),得到77個(gè)節(jié)點(diǎn),446條邊,平均度值11.6,其中為腫瘤壞死因子(TNF)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、酪氨酸激酶受體2(ERBB2)、低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)度值較大(見(jiàn)表3),說(shuō)明與其他蛋白互作力強(qiáng)。

圖2 藥物與疾病蛋白-蛋白互作圖

表3 度值前 15 的蛋白

2.5 分子對(duì)接分析將“2.3”項(xiàng)下度值最高的5個(gè)活性成分與“2.4”項(xiàng)下得到的度值最高的6個(gè)核心蛋白進(jìn)行分子對(duì)接,結(jié)合能均≤-5 kcal·mol-1(見(jiàn)表4)。輸出三維分子對(duì)接圖(見(jiàn)圖3)。

圖3 成分-靶點(diǎn)對(duì)接相互作用模式圖

表4 主要活性分子與核心蛋白分子對(duì)接結(jié)合能(kcal·mol-1)

2.6 GO和KEGG富集分析77個(gè)靶基因進(jìn)行GO富集分析后得到299個(gè)生物過(guò)程(BP)條目,包括negative regulation of apoptotic process、positive regulation of gene expression、protein phosphorylation、positive regulation of MAPK cascade、response to hypoxia、extracellular matrix disassembly等過(guò)程;49條細(xì)胞成分(CC)條目,包括plasma membrane、integral component of plasma membrane、extracellular space、mitochondrion等成分;66條分子功能(MF)條目,包括ATP binding、identical protein binding、zinc ion binding、protein kinase activity和enzyme binding等功能。對(duì)排名前10的3種聚類(lèi)分析條目進(jìn)行繪圖(見(jiàn)圖4)。

圖4 交集靶點(diǎn)GO富集分析

使用DAVID對(duì)77個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析,得到117條相關(guān)通路(見(jiàn)圖5)。以P<0.05篩選出110條信號(hào)通路,排除與OSF無(wú)明顯相關(guān)性的通路后,P值最小的前11條通路主要為:癌癥信號(hào)通路(pathways in cancer、proteoglycans in cancer、central carbon metabolism in cancer)、鈣離子信號(hào)通路(calcium)、松弛素信號(hào)通路(relaxin)、炎癥信號(hào)通路(IL-17、C-type lectin receptor、MAPK)、缺氧誘導(dǎo)因子1信號(hào)通路(HIF-1)、細(xì)胞凋亡信號(hào)通路(PI3K-Akt、FoxO)等(見(jiàn)表5)。

圖5 交集靶點(diǎn)KEGG富集分析

表5 關(guān)鍵信號(hào)通路與核心靶點(diǎn)

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為口腔黏膜局部的毒邪郁積、氣機(jī)不暢、血運(yùn)受阻、氣血失和導(dǎo)致了OSF的發(fā)生,治療以理氣活血、化瘀軟堅(jiān)為主要原則,使用具有活血化瘀作用的中藥可通過(guò)促進(jìn)病變部位血管生成及增加血液流量來(lái)治療OSF[13]。紅花具有活血散瘀、通經(jīng)止痛的功效[14],牛膝具有逐瘀通經(jīng)、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、利尿通淋、引血下行的功效[15],兩者是各類(lèi)活血方劑中的重要組成部分,活血化瘀解毒湯、自擬解纖飲就包含了紅花,而清代王清任的血府逐瘀湯里更是包含了紅花、牛膝等多種活血化瘀的中藥[13,16]。

本研究中,我們發(fā)現(xiàn)紅花-牛膝與 OSF 交集靶基因77個(gè),紅花-牛膝共有16種有效成分協(xié)同作用于OSF的疾病靶點(diǎn),主要為木犀草素、黃芩苷、黃連素和黃連堿,有效成分作用于OSF的核心靶點(diǎn)為T(mén)NF、EGFR、MMP9、MAPK3、ERBB2、HIF-1α,且主要活性成分與核心蛋白具有良好的結(jié)合能力?，F(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為木犀草素、黃芩苷均屬于黃酮類(lèi)化合物,而黃連素、黃連堿都屬于異喹啉類(lèi)生物堿,四者都具有調(diào)節(jié)酶活性、抗血小板聚集、參與細(xì)胞凋亡和干細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等藥理活性,能發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗腫瘤、改善微循環(huán)等多種作用[17-19]。這些結(jié)果說(shuō)明紅花-牛膝可能通過(guò)其抗炎、抗氧化、抗腫瘤以及改善微循環(huán)障礙等作用來(lái)治療OSF。

進(jìn)一步通過(guò)GO和KEGG富集分析,紅花-牛膝治療 OSF以細(xì)胞凋亡負(fù)調(diào)控、缺氧反應(yīng)及MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)正調(diào)控生物過(guò)程為主,主要通過(guò)癌癥、鈣離子、炎癥及細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路起作用。其中與癌癥和炎癥相關(guān)的信號(hào)通路條數(shù)最多,富集的核心蛋白基因最多,提示在紅花-牛膝的抗炎和抗腫瘤作用在治療OSF中具有重要意義。

C-type lectin receptor信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路以及MAPK信號(hào)通路中的JNK 和 p38-MAPK路徑是3條經(jīng)典的炎癥信號(hào)通路,在多種炎癥反應(yīng)及自身免疫性疾病的病理過(guò)程中都起著關(guān)鍵作用,且三者存在著相互調(diào)控的關(guān)系。C-type lectin receptor的活化可促進(jìn)IL-17的表達(dá)[20],而IL-17家族可通過(guò)其相應(yīng)受體發(fā)出信號(hào),激活下游的 MAPK信號(hào)通路,誘導(dǎo)抗菌肽、細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá),激活體內(nèi)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[21]。OSF的病理過(guò)程與炎癥反應(yīng)密切相關(guān),研究認(rèn)為檳榔堿等刺激因素可通過(guò)引發(fā)口腔組織表達(dá)TNF-α等促炎因子,抑制MMP的表達(dá)并促進(jìn)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)的表達(dá),打破細(xì)胞外基質(zhì)蛋白生成與降解的平衡,進(jìn)而導(dǎo)致膠原纖維異常沉積[22]。此外,細(xì)胞炎癥反應(yīng)還可刺激細(xì)胞持續(xù)表達(dá)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)和β成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(β-FGF),促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致膠原纖維的生成增加[2]。Kundu等[23]學(xué)者對(duì)OSF患者的口腔黏膜軟組織進(jìn)行了測(cè)序分析,他們發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照組相比,OSF患者中MAPK和IL-17 信號(hào)通路都出現(xiàn)異?；罨?。而木犀草素、黃芩苷、黃連素和黃連堿均具有顯著的抗炎作用。木犀草素可以通過(guò)抑制人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中的NF-κB和MAPK信號(hào)通路,降低IL-1β、IL-6、TNF-α、可溶性細(xì)胞間黏附分子-1和單核細(xì)胞趨化蛋白-1等炎癥介質(zhì)的表達(dá)[24];還能通過(guò)降低人乳腺上皮細(xì)胞中的IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP-2和MMP-9的表達(dá),上調(diào)TIMP-1和TIMP-2的水平來(lái)抵抗金黃色葡萄球菌引發(fā)的炎癥反應(yīng)[25]。黃芩苷能通過(guò)抑制JAK2-STAT3信號(hào)通路,調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞的平衡,降低TNF-α、IL-6、IL-17和IL-1β的表達(dá),減輕關(guān)節(jié)腔中的炎癥反應(yīng)[26]。黃連素能通過(guò)顯抑制大鼠體內(nèi)JNK1的磷酸化,降低 TNF-α和IL-6的表達(dá)[27],還能通過(guò)降低TNF-α、TGF-β1的表達(dá)和增加MMP-2的水平來(lái)促進(jìn)膠原蛋白的降解,從而減輕肝臟的纖維化[28]。黃連堿也能通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路降低動(dòng)脈粥樣硬化小鼠血清中IL-6、 IL-1β、 TNF-α水平,并下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中血管細(xì)胞黏附分子-1、IL-6和 IL-1β的表達(dá)[29]。結(jié)合本研究結(jié)果,我們推測(cè)紅花-牛膝可能通過(guò)調(diào)控C-type lectin receptor、IL-17以及MAPK信號(hào)通路發(fā)揮著OSF治療過(guò)程中的抗炎作用。

Pathways in cancer、proteoglycans in cancer和central carbon metabolism in cancer是3條調(diào)控腫瘤微環(huán)境的信號(hào)通路,參與了腫瘤的生長(zhǎng)和遷移。OSF是一種具有癌變傾向的疾病,檳榔堿等刺激因素誘導(dǎo)的持續(xù)性炎癥、膠原沉積、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子分泌可能導(dǎo)致OSF向惡性腫瘤轉(zhuǎn)化。已有研究顯示在晚期OSF和口腔鱗狀細(xì)胞癌中存在著共同的生物標(biāo)記物,如TGF-β1、 HIF-1α、MMP、TIMP和血清免疫球蛋白G等[30-32]。木犀草素可以通過(guò)調(diào)控AKT/mTOR 信號(hào)通路下調(diào)MMP9的表達(dá),從而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[33]。黃芩苷能通過(guò)抑制HIF-1α和芳香烴受體的表達(dá)減弱TGF-β1誘發(fā)的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的異常增殖[34]。黃連素能通過(guò)下調(diào)EGFR 和 ERBB2的表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲[35]。而黃連堿能通過(guò)調(diào)節(jié)JNK信號(hào)通路介導(dǎo)人類(lèi)肝癌細(xì)胞的凋亡[36]。木犀草素、黃芩苷、黃連素和黃連堿的抗腫瘤作用可能在紅花-牛膝治療OSF的過(guò)程中具有重要作用。

綜上所述,紅花-牛膝可能以木犀草素、黃芩苷、黃連素和黃連堿等主要活性成分,通過(guò)C-type lectin receptor、IL-17、MAPK和癌癥相關(guān)等信號(hào)通路作用于TNF、EGFR、MMP9、MAPK3、ERBB2、HIF-1α等靶點(diǎn)來(lái)治療OSF。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法分析了紅花-牛膝治療OSF的潛在作用機(jī)制,為進(jìn)一步探究紅花-牛膝治療OSF提供理論線索與依據(jù)。但本研究尚未對(duì)預(yù)測(cè)的關(guān)鍵靶點(diǎn)以及通路進(jìn)行驗(yàn)證,未來(lái)將通過(guò)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證分析,以期能夠促進(jìn)藥物的研發(fā)以及改良。