金一寶,佟月,陳佳佳,王麓,殷果

(1.深圳市藥品檢驗(yàn)研究院,國家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量研究與評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,深圳市藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 深圳 518057;2.沈陽藥科大學(xué),遼寧 沈陽 110016;3.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東 廣州 510006)

山藥(Chinese yam)為薯蕷科植物薯蕷(DioscoreaoppositaThunb.)的干燥根莖[1]。山藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,將其列為上品,云“署豫,味甘,溫。主傷中,補(bǔ)虛嬴,除寒熱邪氣,補(bǔ)中,益氣力,長肌肉?！盵2]在宋代以前山藥多采用野生品,產(chǎn)地較分散,山西、河南、山東、江蘇、湖北等地均有分布,其中評價出“產(chǎn)佳”或“產(chǎn)良”的產(chǎn)地,各種本草說法不一[3]。直至明清的《救荒本草》中首次指出山藥“懷孟間產(chǎn)者入藥最佳”,且入藥以栽培品為主[4]。山藥有很高藥用價值,包括淀粉、黏液多糖、蛋白質(zhì)和氨基酸、微量元素、甾體皂苷、多酚等多種活性成分。其中山藥多糖具有調(diào)節(jié)脾胃功能、抗衰老、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等作用[5-6]。

近年來,山藥的市場需求不斷增長,市場上亦混入了山藥偽品,使藥用市場流通的山藥質(zhì)量魚龍混雜。薯蕷科中薯蕷屬大約包含600種,種類豐富。歷版《中國藥典》均記載中藥山藥的基原植物為薯蕷。但實(shí)際上除薯蕷外,市場上存在多種不同基原的山藥,如:淮山藥(參薯,DioscoreaalataL.)、廣山藥(褐苞薯蕷,DioscoreapersimilisPrain et Burkill.)、野山藥(日本薯蕷,DioscoreajaponicaThunb.)等,上述3種作為山藥地方習(xí)用品,分別被浙江、廣西、湖南、廣東等地收錄在地方中藥材標(biāo)準(zhǔn)中。此外,中藥山藥的常見偽品木薯(ManihotesculentaCrantz.)、番薯(IpomoeabatatasLam.)等也在市場上廣泛流通[7-8],導(dǎo)致了山藥市場混亂?！吨袊幍洹?020年版(一部)、《美國草藥集》、《英國藥典》2023 Ⅳ、《歐洲藥典》11.0、《日本藥局方》ⅩⅧ針對其鑒別分別采用顯微鑒別和薄層鑒別法[1,9-12]。

本研究采用紫外分光光度計法測定不同來源的山藥及其偽品的總多糖、總皂苷、總黃酮和總酚等化學(xué)成分的含量并進(jìn)行主成分分析,以此來鑒定和篩選優(yōu)良的山藥資源,為山藥種植資源開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 樣品收集43批樣品,其中包括28批中藥山藥(DioscoreaoppositaThunb.)和15批偽品。其中偽品包括同屬的參薯(DioscoreaalataL.)、褐苞薯蕷(DioscoreapersimilisPrain et Burkill.)和日本薯蕷(DioscoreajaponicaThunb.),及不同屬的木薯(ManihotesculentaCrantz)和番薯[Ipomoeabatatas(L.) Lamarck.]。所有樣品均經(jīng)中國食品藥品檢定研究院原中藥標(biāo)本館館長張繼主任藥師鑒定。樣品來源信息見表1。其中原藥材參考《中國藥典》2020年版(一部)[1],原藥材去皮切片后置于60 ℃恒溫干燥箱內(nèi)烘干,粉碎,過五號篩,置于密封袋中,25 ℃條件下密封保存,備用。

表1 43批中藥山藥及偽品樣品信息表

1.2 儀器與試劑UV-2450型紫外-可見分光光度計(日本島津公司);TC-15套式恒溫器(海寧市新華醫(yī)療器械廠);SB26-12DT型超聲儀(寧波新芝生物科技股份有限公司);DL-5-B低速大容量離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);TW20水浴鍋(優(yōu)萊博技術(shù)北京有限公司);Milli-Q Academic純水器(美國密理博公司);MS-204S分析天平(瑞士梅特勒-托利多集團(tuán))。

無水葡萄糖(批號:110833-201908,中國食品藥品檢定研究院);薯蕷皂苷元(批號:111539-200001,中國食品藥品檢定研究院);蘆丁(批號:20121022,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);沒食子酸(批號:K1216026,美國Sigma-Aldich公司) 。硫酸、鹽酸、高氯酸、乙醇、石油醚(沸程60～90 ℃)、正丁醇、冰醋酸(分析純,廣州化學(xué)試劑廠);硝酸鋁、亞硝酸鈉、福林酚、碳酸鈉、氫氧化鈉、苯酚、甲醇、香草醛(分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

2 方法

2.1 山藥多糖含量的測定

2.1.1 葡萄糖對照品溶液的制備取無水葡萄糖對照品適量,精密稱定,加水制成0.1 mg·mL-1的葡萄糖對照品溶液。精密量取葡萄糖對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,置具塞試管中,加水補(bǔ)至2.0 mL,按測定方法操作用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.2 供試品溶液的制備取中藥山藥樣品粉末約0.1 g,精密稱定,置圓底燒瓶中,加80%乙醇100 mL,加熱回流1 h,趁熱過濾,濾渣與濾器用熱80%乙醇溶液30 mL,分次洗滌,濾渣連同濾紙置燒瓶中,加水150 mL,加熱回流2 h,趁熱過濾,用少量熱水洗滌濾器,合并濾液與洗液,放冷,移至250 mL量瓶中,加水至刻度,搖勻,備用。

2.1.3 測定方法精密量取一定量供試品溶液,因樣品存在較大差異,選擇0.5 mL或0.2 mL,使其測得吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi),置具塞試管中,加水補(bǔ)至2.0 mL,精密加入5%苯酚溶液1.0 mL,搖勻,迅速加入硫酸5.0 mL,搖勻,置40 ℃水浴中保溫30 min,取出,置冰水浴中5 min,以水為空白溶液同法操作為空白樣品,照紫外-可見分光光度法,在488 nm的波長處測定吸光度,計算總多糖的含量[12]。

2.2 山藥總皂苷含量的測定

2.2.1 薯蕷皂苷元對照品溶液的制備精密稱取薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg,置于50 mL量瓶中,甲醇溶解并稀釋定容,搖勻,配制成濃度0.2 mg·mL-1的薯蕷皂苷元對照品溶液。精密量取薯蕷皂苷元對照品溶液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL于10 mL具塞試管中按測定方法操作用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.2 供試品溶液的制備精密稱取樣品粉末2.0 g置于具塞錐形瓶,加入70%乙醇20 mL,超聲提取60 min,提取2次,上層清液合并后過濾蒸干,殘渣以2 mL蒸餾水溶解,轉(zhuǎn)移至60 mL分液漏斗,加入石油醚萃取2次,每次10 mL,收集水層,合并水溶液加入水飽和正丁醇萃取3次,每次5 mL,收集正丁醇層于干燥蒸發(fā)皿中,揮干溶劑,殘渣加入甲醇溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶,搖勻,以甲醇定容。

2.2.3 測定方法精密量取供試品溶液1.0 mL,置10 mL具塞試管中,加塞,于90 ℃水浴揮干溶劑,精密加入新鮮配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL,高氯酸0.8 mL,加塞,于60 ℃恒溫水浴中反應(yīng)顯色15 min后置冷水浴至室溫,精密加入冰醋酸5.0 mL,搖勻,靜置15 min。以甲醇為空白溶液同法操作為空白樣品,波長465 nm下測定吸光度,計算總皂苷的含量。

2.3 山藥總黃酮含量的測定

2.3.1 對照品溶液的制備精密稱取蘆丁對照品10.0 mg,70%乙醇超聲溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶定容備用。精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,置于10 mL量瓶中按測定方法操作用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2 供試品溶液的制備精密稱取山藥粉末2.0 g,置于具塞錐形瓶中,加入70%乙醇溶液20 mL,超聲提取30 min,5 000 r·min-1離心取上清,蒸干,用70%乙醇復(fù)溶并定容至2.0 mL量瓶中。

2.3.3 測定方法精密量取一定量供試品溶液(0.5 mL或0.2 mL),分別置10 mL量瓶中,依次加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL,搖勻,靜置6 min,再加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL,搖勻,靜置6 min,最后加入4%氫氧化鈉試液2 mL,50%乙醇定容,靜置15 min。以70%乙醇為空白溶液同法操作為空白樣品,波長502 nm下測定吸光度,計算總黃酮的含量[13]。

2.4 山藥總酚含量的測定

2.4.1 沒食子酸對照品溶液的制備精密稱定沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg,置于100 mL量瓶中加50%乙醇定容。精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL,分別置10 mL量瓶中按測定方法操作用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.2 供試品溶液的制備精密稱取山藥粉末0.5 g,置于具塞錐形瓶中,精密加入20 mL 50%乙醇,超聲30 min,放冷,離心,精密量取1 mL上清液置10 mL量瓶中。

2.4.3 測定方法精密吸取一定量待測樣品提取液、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液,分別置10 mL量瓶中,依次加水3 mL,搖勻,再加入福林酚試液B 0.5 mL,搖勻,0.5～8 min內(nèi)加入20%碳酸鈉溶液1.5 mL,加水至刻度,搖勻,在75 ℃水浴中放置10 min。以50%乙醇為空白溶液同法操作為空白樣品,波長760 nm下測定吸光度,計算總多酚的含量[13]。

2.5 方法學(xué)考察以各不同濃度的對照品溶液按測定方法,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別取葡萄糖對照品溶液、薯蕷皂苷元對照品溶液、蘆丁對照品溶液和沒食子酸對照品溶液1 mL各6份,按各自測定方法進(jìn)行精密度驗(yàn)證,計算其RSD。取S1號樣品6份,分別按照各自“供試品溶液的制備”,在上述試驗(yàn)條件下進(jìn)樣分析,以樣品中各成分含量的RSD來評價其重復(fù)性。取已知含量的S1號樣品,各成分平行6份分別加入與樣品中各待測成分的量相當(dāng)?shù)膶φ掌?按“供試溶液制備”進(jìn)樣測定,計算其回收率。以及取S1號樣品的供試品溶液,0、2、4、6、8、10、12和24 h進(jìn)樣測定,以各成分含量的RSD考察其穩(wěn)定性在室溫放置的穩(wěn)定性等,以確保方法的可靠。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析采用Ezinfo軟件根據(jù)上述4種量值進(jìn)行多元統(tǒng)計,以主成分分析(PCA)對變量進(jìn)行降維并將其聚類,繪制主成分分類圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證以各不同濃度的對照品溶液按測定方法,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程見表2,在各成分所示范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。4類成分精密度RSD在0.10%～0.71%之間,精密度良好。重復(fù)性結(jié)果見表2,4類成分含量的RSD在1.0%～1.3%之間,重復(fù)性良好?；厥章式Y(jié)果見表2。4類成分的回收率在96.8%～99.0% 之間,RSD在0.9%～1.3%之間,表明方法回收率良好。穩(wěn)定性結(jié)果見表2,4類成分的RSD在0.7%～1.8%之間,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 4類成分含量測定方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果(n=6)

3.2 樣品測定將28批中藥山藥(Dioscoreaopposita)和15批偽品(木薯Manihotesculenta、參薯Dioscoreaalata、褐苞薯蕷Dioscoreapersimilis、番薯Ipomoeabatatas、日本薯蕷Dioscoreajaponica),采用紫外-可見分光光度計測定吸光度,外標(biāo)法計算其總多糖、總皂苷、總黃酮和總多酚的含量,結(jié)果見表3。

表3 43批樣品中4種成分的測定結(jié)果(n=3,mg·g-1)

由表3可知,山藥中含有豐富的多糖類成分,占比約為山藥重量的20%(見圖1A)。在所測定的4類成分中,占比超90%(見圖1B)。山藥及其為品種均含有4類活性成分,且總多糖含量最高。其中山藥中平均含量達(dá)226.9 mg·g-1,其次為總皂苷(5.476 mg·g-1)和總黃酮(4.870 mg·g-1),總多酚(0.269 7 mg·g-1)平均含量最低。參薯中的總多糖含量略低(190.4 mg·g-1),總皂苷(3.591 mg·g-1)、總黃酮(5.240 mg·g-1)和總多酚(0.293 7 mg·g-1);日本薯蕷中的總多糖含量最低(137.6 mg·g-1),總皂苷(5.748 mg·g-1)、總黃酮(4.378 mg·g-1)和總多酚(0.351 6 mg·g-1),參薯和日本薯蕷與山藥較為相似。而褐苞薯蕷的總多糖含量較高(412.6 mg·g-1)、總皂苷(5.748 mg·g-1)、總黃酮(15.11 mg·g-1)、總多酚(0.541 2 mg·g-1)均顯著高于山藥。其他科的偽品木薯總多糖含量最高(563.1 mg·g-1),總皂苷(5.358 mg·g-1)和總黃酮(4.986 mg·g-1)與山藥相近,總多酚(0.166 5 mg·g-1)顯著低于山藥。另一偽品番薯總多糖含量較高(400.7 mg·g-1)、總皂苷(6.651 mg·g-1)、總黃酮(7.509 mg·g-1)、總多酚(0.584 7 mg·g-1)均顯著高于山藥。

A.4類成分含量;B.4類成分占比;C.山藥及其偽品中總多糖含量;D.山藥及其偽品中總皂苷含量;E.山藥及其偽品中總黃酮含量;F.山藥及其偽品中總多酚含量

3.3 山藥及其偽品主成分分析采用主成分分析(PCA)的方法,基于4類成分對山藥及其各類偽品進(jìn)行比較。圖2A 顯示,山藥與其偽品參薯、日本薯蕷、褐苞薯蕷、木薯、番薯的分類并不是非常明顯,主要是因?yàn)楫a(chǎn)地為江蘇的山藥樣品顯示出了異常(圖2A靠近“PC1”的那個樣品)。由于江蘇并非山藥的主產(chǎn)區(qū)且僅有一個樣品,不具備代表性,因此將其剔除,剔除后山藥及其偽品各組之間明顯分離(見圖2B)。將所有偽品作為一組,山藥作為另一組進(jìn)行偏最小二乘分析(PLS-DA)的比較,同樣可以發(fā)現(xiàn)山藥和偽品之間的顯著分離(見圖2C),表明這兩組的某些活性成分有顯著差異。通過S-Plot和變量重要性圖(見圖2D～E),可知總多酚的含量對分類的貢獻(xiàn)最大。因此,總多酚的含量可以作為區(qū)分山藥及其偽品的一個重要指標(biāo)。

A.山藥及其偽品主成分分析;B.除江蘇產(chǎn)地外,主成分分析;C.偏最小二乘分析;D.S-plot;E.變量重要性圖

3.4 不同產(chǎn)地的山藥主成分分析圖2中,江蘇產(chǎn)區(qū)的山藥與其他地區(qū)的山藥存在顯著不同,提示需要考慮不同產(chǎn)地的山藥成分是否存在差異。首先對山藥的4種活性成分的含量進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)除江蘇產(chǎn)地山藥樣品總多糖含量極高,其余3種成分的含量差異不顯著(見圖3A～B)。以4類成分的含量為變量對所有山藥進(jìn)行了主成分分析,結(jié)果顯示,江蘇產(chǎn)地的山藥明顯有別于主產(chǎn)區(qū)河南、河北、山東及非主產(chǎn)區(qū)山西、遼寧、陜西的山藥(見圖3C),也就是只有江蘇的山藥樣品不同于其他產(chǎn)地的山藥。當(dāng)剔除江蘇山藥后,再次進(jìn)行主成分分析,各產(chǎn)地的山藥不能形成分類(見圖3D),說明由于各產(chǎn)地山藥的這4類活性成分中差異不大,推測其原因可能是由于山藥已實(shí)現(xiàn)種植栽培、經(jīng)品種優(yōu)選后,藥材品質(zhì)已趨于統(tǒng)一。

A.4類成分含量;B.4類成分占比;C.各產(chǎn)地主成分分析;D.除江蘇產(chǎn)地外,其他產(chǎn)地主成分分析

4 討論

研究結(jié)果顯示,基于4類活性成分的含量可實(shí)現(xiàn)山藥及其偽品各組之間的區(qū)分,并進(jìn)一步得知總多酚的含量對分類的貢獻(xiàn)最大。同時江蘇產(chǎn)地的山藥也因總多糖含量異常高而區(qū)別于其他產(chǎn)地的山藥。多酚類成分在抗氧化、清除自由基、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制環(huán)氧化物酶、保護(hù)心腦血管、預(yù)防糖尿病等方面具有很強(qiáng)的作用已成為天然抗氧劑[14-15]。由于山藥中的總多糖成分的含量占比極高,其主要成分為淀粉等多糖類成分,其中的抗性淀粉是其功能活性成分之一[16]。山藥中活性皂苷類成分已被用作合成治療冠心病的甾體激素和皂苷類藥物的重要工業(yè)原料[17-18],而黃酮類化合物具有去除體內(nèi)的氧自由基,同樣作為天然的強(qiáng)抗氧化劑[19]。因此,提示總多酚、總多糖等活性成分含量是否可以作為山藥質(zhì)量研究的一個關(guān)鍵指標(biāo)?！吨袊幍洹?020年版(一部)[1]收載的山藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定了性狀、顯微鑒別、薄層鑒別(對照藥材)、檢查(水分、總灰分、二氧化硫殘留量)、浸出物等項(xiàng)目,無含量測定項(xiàng)。此外,《美國草藥集》、《英國藥典》2023Ⅳ、《歐洲藥典》11.0和《日本藥局方》ⅩⅧ[9-12]同樣未設(shè)立含量測定項(xiàng)。本試驗(yàn)建立了紫外分光光度法測定中藥山藥4類活性成分的含量測定方法,通過對活性成分總多糖及總皂苷、總黃酮和總多酚的提取條件的優(yōu)化,考察了提取溫度、時間、溶劑等,優(yōu)化其顯色條件及檢測波長,建立的方法準(zhǔn)確、可靠。通過山藥中4類活性成分含量的分析,為以反映臨床療效的活性成分為控制指標(biāo)的中藥山藥質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

本試驗(yàn)建立了紫外分光光度法測定中藥山藥4類活性成分的含量測定方法,比較了中藥山藥及其偽品中總多糖、總皂苷、總黃酮和總多酚成分含量的差異并通過主成分分析(PCA)可實(shí)現(xiàn)山藥正偽品的分類。同時對不同產(chǎn)地來源的山藥進(jìn)行比較,通過主成分分析發(fā)現(xiàn)各主產(chǎn)區(qū)之間成分含量相近,無顯著品質(zhì)差異。本研究為基于功效物質(zhì)基礎(chǔ)的山藥質(zhì)量控制以及山藥種植資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。