鐘 元 朱天宇 戴 成 馬朝芝

耐亞磷酸鹽除草劑轉(zhuǎn)基因油菜的創(chuàng)建和抗性評價

鐘 元 朱天宇 戴 成 馬朝芝*

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良全國重點實驗室 / 國家油菜工程技術(shù)研究中心 / 洪山實驗室, 湖北武漢 430070

在油菜的生產(chǎn)過程中, 大量伴生的雜草嚴重影響了其產(chǎn)量和品質(zhì)。由于近年來田間抗除草劑雜草數(shù)量的增加, 除草劑的選擇正在迅速減少, 這影響了未來農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。植物可以通過正磷酸鹽(Pi)轉(zhuǎn)運蛋白吸收亞磷酸鹽(Phi), 但Phi不能被代謝為作物的磷肥料, 導(dǎo)致植物生長受到抑制。此前, 從羅爾斯通菌屬(sp. strain 4506)中分離出了(phosphite dehydrogenase)基因, 其139位的酪氨酸突變?yōu)楣劝滨０?Y139Q)的突變蛋白ptxDQ催化Phi轉(zhuǎn)化為Pi的活性顯著提高。為了評價ptxD/Phi系統(tǒng)對甘藍型油菜雜草的防治效果, 本研究獲得了帶有密碼子優(yōu)化的(Y139Q,ptxD)基因的轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜。在以Phi為單一磷元素的條件下,ptxD轉(zhuǎn)基因油菜可以正常生長, 體內(nèi)Pi含量顯著提高, 且Pi饑餓響應(yīng)基因(和等)的表達水平被顯著抑制, 說明ptxD在油菜體內(nèi)可以促使Phi轉(zhuǎn)化為Pi。此外,ptxD轉(zhuǎn)基因油菜具有比野生型油菜和單子葉雜草(狗尾草)更強的生長競爭優(yōu)勢。綜上所述,ptxD/Phi是一種有效的油菜磷利用和雜草控制系統(tǒng), 既可以抑制雜草的生長, 又可以為作物提供充足的Pi營養(yǎng), 從而提高了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)性。

甘藍型油菜; 除草劑; 亞磷酸鹽;

油菜是十字花科蕓薹屬植物, 主要有油用、菜用和觀賞等用途[1]。在油菜整個生長周期中, 田間常會有大量的雜草伴生, 對油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生影響, 雜草會與油菜爭奪肥、光、水和生存空間等, 造成油菜減產(chǎn)10%～15%, 嚴重的甚至?xí)p產(chǎn)50%以上[2]。為了保障和穩(wěn)定油菜安全生產(chǎn), 必須提高對草害的防治效率。目前, 化學(xué)防治是農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化進程中應(yīng)用最為廣泛的雜草防治方法。相較于人工除草、輪作、生物防治、淺耕滅草等傳統(tǒng)技術(shù), 化學(xué)除草效果顯著、人工成本低且不改變土層結(jié)構(gòu)。然而農(nóng)藥的大量使用不僅會破壞土壤中的生物多樣性, 還會危害人體健康[3]?，F(xiàn)階段, 除草劑被廣泛用于控制雜草。乙胺磺隆、苯唑啉乙基和喹唑磷乙基(苯磺隆、草甘膦、草銨膦)都是油菜地常用的除草劑[4-6]。然而化學(xué)除草劑長期過量使用, 會導(dǎo)致農(nóng)田中抗除草劑雜草數(shù)量急劇增加。因此, 迫切需要開發(fā)能夠有效治理雜草的新工具, 特別是非除草工具, 以有效地管理雜草。

磷(P)是一種必需的常量營養(yǎng)素, 它通過被吸收成重要的細胞成分而起著至關(guān)重要的作用, 是所有生物體所必需的[7-9]。磷酸鹽主要有2種形式, 正磷酸鹽(Pi)和亞磷酸鹽(Phi)[10-12]。Phi是Pi的一種簡化形式, 其中一個氧原子被氫原子取代[13], 它被廣泛用于控制卵菌病原菌引起的植物真菌病害[14-16]。雖然植物可以通過Pi轉(zhuǎn)運體吸收Phi, 但Phi不能被代謝為作物的磷肥[17-19]。亞磷酸酯脫氫酶()基因來源于細菌(如WM88), 它編碼一種催化Phi氧化成Pi的酶[18,20]。轉(zhuǎn)基因株系使植物將Phi作為磷的唯一來源進行發(fā)育[21-23],/Phi系統(tǒng)作為雜草控制的非除草劑工具, 已成功應(yīng)用于許多作物中, 如水稻、玉米和棉花等[19,23-24]。此外,/Phi系統(tǒng)在不使用抗生素/除草劑抗性基因的轉(zhuǎn)基因植物中具有很大的潛力[25-26]。

從sp. 4506(PtxDR4506)中分離到基因[27], 通過定向進化獲得了第139位酪氨酸突變?yōu)楣劝滨０返膒txD突變蛋白(Y139Q, ptxDQ), 其催化Phi轉(zhuǎn)化為Pi的效率比PtxDR4506提高了5.8倍[27]。在此基礎(chǔ)上, 我們優(yōu)化了ptxD的密碼子, 構(gòu)建了轉(zhuǎn)化油菜的雙元載體pCambia1300-ptxD, 將載體轉(zhuǎn)化到油菜, 獲得了ptxD轉(zhuǎn)基因油菜株系。轉(zhuǎn)基因株系可以在只有Phi存在的情況下正常生長, 且在提供Phi的條件下可抑制Pi饑餓誘導(dǎo)的基因的表達水平, 表明ptxD轉(zhuǎn)基因油菜可以將Phi轉(zhuǎn)化為Pi, 從而提供其生長所需的Pi。此外, 當P以Phi的形式供給時,ptxD轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜在人工基質(zhì)中的競爭優(yōu)勢超過了狗尾草()這類單子葉雜草。以上結(jié)果表明,ptxD/Phi技術(shù)是一種較好的油菜雜草抑制系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和生長條件

以甘藍型油菜‘Westar’為材料進行植株轉(zhuǎn)化。所有野生型(Westar、B409和Damor)和轉(zhuǎn)基因植株均在20～23℃、光照強度為100 μmol m–2s–1、相對濕度為60%的溫室中生長(光照/暗時間16 h/8 h)。

1.2 載體構(gòu)建

本研究以pcb11-P139Q為模板(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院吳高兵老師惠贈), 用ptxD基因特異性引物進行片段PCR擴增, 跑膠確認目的基因ptxD擴增產(chǎn)物。再與線性化后的載體進行重組, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α, 挑取單克隆進行PCR檢測, 陽性菌株送公司經(jīng)測序確認, 提取質(zhì)粒并保存于–20℃, 得到植物表達載體-ptxD。進一步用電轉(zhuǎn)法將新構(gòu)建的植物表達載體p1300-ptxD轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌, 28℃培養(yǎng)36～48 h后挑選單菌落, 用引物ptxD-F、ptxD- R進行陽性鑒定。相關(guān)引物見表1。

1.3 甘藍型油菜轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)生與篩選

在獲得-ptxD載體后, 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因株系。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍型油菜的轉(zhuǎn)化過程參考實驗室先前的研究方法[28]:將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌后侵染油菜受體材料Westar的下胚軸, 經(jīng)過組織培養(yǎng)的繼代轉(zhuǎn)化方式獲得陽性苗。用Hygromycin B (120 μg mL–1)、Phi (1 mmol L–1)或Phi + Pi (1.5 mmol L–1+ 0.5 mmol L–1)篩選陽性愈傷組織和轉(zhuǎn)基因植株。其中M2是愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基, M3、M4分別是芽分化與根誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。利用ptxD基因特異性引物對T0代轉(zhuǎn)基因系進行PCR擴增。相關(guān)引物見表1。

1.4 RNA提取和qRT-PCR分析

葉片組織收集自ptxD的轉(zhuǎn)基因系和有或無Phi處理的野生型油菜。利用RNA Prep Pure Plant Kit (Cat. No. LS1040, Promega, 美國)試劑盒提取植物組織RNA, 利用Transcript RT kit (Cat. No. AE311, TransGen Biotech, 中國)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA, 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋100倍作為模板。為內(nèi)參基因。qRT-PCR反應(yīng)體系為2×SYBR Green Master Mix 5 μL, 包含上下游引物各0.4 μL、cDNA模板4.2 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序為95℃ 5 min; 95℃ 30 s, 59℃ 1 min, 72℃ 10 min, 30個循環(huán)。每個處理3個生物學(xué)重復(fù), 依照2–ΔΔCt方法分析基因相對表達量。相關(guān)引物見表1。

1.5 油菜磷元素含量的測定

將ptxD的T1代轉(zhuǎn)基因系和甘藍型油菜‘Westar’在Hoagland培養(yǎng)基中萌發(fā)1周, 然后使用無P、Pi (KH2PO4)和不同Phi (KH2PO3)濃度的營養(yǎng)液中再萌發(fā)2周。將0.2～0.3 g完全干燥的樣品磨成粉末, 加入30 mL去離子水轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中。然后加入2滴2,6二硝基苯酚指示劑, 用6 mol L–1NaOH調(diào)節(jié)pH至黃色, 加入10 mL鉬酸釩銨溶液混合均勻,最后用水定容。采用分光光度計(UV2100, UNICO, 中國)在440 nm波長處測定無機Pi的濃度。以適當濃度的KH2PO4作為標準。根據(jù)公式計算磷含量: P (μg g–1葉鮮重) = C × (V/W)。式中: C為提取液的磷含量(μg mL–1); V為提取液的體積(mL); W為樣品鮮重(g)。

1.6 轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜的生長

以無磷MS培養(yǎng)基(不含KH2PO4, 貨號PM1011- P)為基礎(chǔ), 添加不同濃度的KH2PO3(1 mmol L–1、2 mmol L–1、4 mmol L–1和8 mmol L–1)和1 mmol L–1的KH2PO4, 將油菜種子播種到這些培養(yǎng)基上, 生長7 d后, 觀察其生長表現(xiàn)。

營養(yǎng)液水培: 將生長7 d左右的幼苗用海綿固定在穴盤上面, 使用無P、1 mmol L–1Pi和4 mmol L–1Phi的營養(yǎng)液水培, 在溫室(16 h光照, 8 h黑暗)繼續(xù)培養(yǎng)。

營養(yǎng)液土培: 將T1子代培養(yǎng)在沙子︰蛭石=1︰1的塑料托盤中, 并用含無P、1 mmol L–1Pi、4 mmol L–1Phi和8 mmol L–1Phi的營養(yǎng)液澆灌, 在溫室進行培養(yǎng)。

在播種后2周測量其鮮重、株高和根長, 用SPAD-502儀測定葉片葉綠素含量。每次加入的所有分析至少重復(fù)3次。在一個重復(fù)中, 每組數(shù)量為15～20株。

1.7 雜草的競爭試驗

為了檢驗ptxD/Phi系統(tǒng)對雜草(狗尾草)的防治效果, 將T1子代、野生型Westar油菜和雜草播種在塑料托盤中, 用沙子︰蛭石=1︰1, 用含有8 mmol L–1Phi或1 mmol L–1Pi的營養(yǎng)液作為P源澆灌3周。在競爭試驗中, 在試驗結(jié)束當天, 對每個處理的代表性托盤進行拍照, 并確定植物的生長參數(shù)。所有參數(shù)采用SPSS Statistics Base (version 22)軟件進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析和檢驗評估顯著差異。

表1 本研究中使用的引物

2 結(jié)果與分析

2.1 創(chuàng)建ptxDQ轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜

由于缺乏Phi分解代謝酶, 植物的生長發(fā)育會受到Phi的抑制[29-30]。本研究首先考察了甘藍型油菜Westar對Phi處理是否敏感。以無磷MS培養(yǎng)基(不含KH2PO4)為基礎(chǔ), 添加不同濃度的KH2PO3(1 mmol L–1、2 mmol L–1、4 mmol L–1和8 mmol L–1)和1 mmol L–1的KH2PO4, 將Westar種子播種到這些培養(yǎng)基上, 生長7 d后, 觀察其生長表現(xiàn)。與無P條件下生長的Westar植株相比, 在1 mmol L–1Pi條件下的幼苗生長良好, 下胚軸長度約為無P條件下長度的1.4倍(圖1-a, b)。在Phi條件下, 甘藍型油菜Westar的根長和鮮重受到抑制, 且與Phi的濃度呈正相關(guān)關(guān)系, 當Phi濃度為8 mmol L–1時, 其鮮重和根長分別下降了約49%和65% (圖1-c, d), 說明甘藍型油菜Westar對Phi處理敏感。為了分析Phi是否對不同生態(tài)型油菜都具有抑制作用, 本研究分析了3種油菜品系Westar、Damor和B409在水培條件下對Phi的敏感度。將在正常條件下萌發(fā)7 d的油菜幼苗轉(zhuǎn)移到含有4 mmol L–1Phi或1 mmol L–1Pi的Hoagland培養(yǎng)液中(附圖1-a), 生長2周后發(fā)現(xiàn), 與Pi處理相比, 在Phi處理下的Westar、Damor和B409生長都受到了嚴重的抑制(附圖1-b), 其中根長下降了25%左右(附圖1-c), 鮮重下降了62.5%左右(附圖1-d), 表明Phi對不同的油菜品系都有抑制作用。

在此之前, 從sp. 4506菌株中克隆了基因(PtxD), 蛋白序列分析結(jié)果表明, PtxDR4506與假單胞桿菌來源的PtxD蛋白(PtxDWM88)同源性為54 % (附圖2)。在PtxD基礎(chǔ)上, 通過定向進化獲得了第139位酪氨酸突變?yōu)楣劝滨０返膒txD突變蛋白(Y139Q, ptxDQ), 其催化Phi轉(zhuǎn)化為Pi的效率比PtxDR4506提高了5.8倍[27]。為檢測ptxDQ在油菜中是否具有生物學(xué)功能, 我們將ptxD的基因序列進行密碼子優(yōu)化, 進一步擴增ptxD基因片段, 構(gòu)建到pCambia1300載體中, 獲得載體p1300- ptxDQ(圖1-e)。其中35S啟動子驅(qū)動ptxD基因表達(圖1-e), 此外該載體還包含一個潮霉素抗性基因的位點(HygR) (圖1-e)。

/Phi系統(tǒng)在多個植物中已經(jīng)證明可以用于轉(zhuǎn)基因植株的篩選[17,19,22-23,25-26]。為了驗證/Phi系統(tǒng)是否可以用于轉(zhuǎn)基因油菜的篩選, 本研究將p1300-ptxD載體轉(zhuǎn)化至油菜受體Westar中, 分別以HygB (120 μg mL–1)、Phi (1 mmol L–1)和Phi + Pi (1.5 mmol L–1+0.5 mmol L–1)為篩選劑篩選陽性愈傷。在HygB為篩選劑的條件下, 油菜愈傷可以正常膨大并分化出芽(圖1-f)。在以Phi為單一磷元素的條件下, 油菜愈傷雖然可以分化, 但是在芽分化培養(yǎng)基上(M3), 愈傷不能正常膨大, 且沒有分化出芽(附圖3-a), 說明在Phi為單一磷元素的篩選條件下, 不能獲得油菜轉(zhuǎn)基因株系。在Phi + Pi (1.5 mmol L–1+ 0.5 mmol L–1)篩選條件下, 愈傷組織和芽均生長良好(圖1-f, g)。其中, 81.47%～90.32 %的外植體在Phi + Pi篩選條件下轉(zhuǎn)化為愈傷, 29.23%～49.07%的外植體在HygB條件下轉(zhuǎn)化為愈傷(表2)。0.64%～1.73%外植體在Phi + Pi篩選條件下分化出正常生長的植株; 3.22%～4.17%外植體在HygB篩選條件下分化出正常生長的植株(表2)。最終獲得了油菜轉(zhuǎn)化再生苗共41株, 其中基于Pi+Phi篩選得到了11株, 基于HygB篩選得到了30株(表2)。

為了進一步驗證篩選所獲得的植株是陽性轉(zhuǎn)基因株系, 本研究設(shè)計了特異性擴增ptxD基因片段的引物。PCR結(jié)果顯示, 通過HygB篩選所獲得的30株再生苗均擴增出1009 bp大小的特異性條帶(附圖3-b), 而通過Pi+Phi篩選得到的11株再生苗未擴增出目的條帶(附圖3-b)。說明, 目前的組培篩選條件(Phi + Pi: 1.5 mmol L–1+ 0.5 mmol L–1)不適用于油菜轉(zhuǎn)基因株系的篩選。進一步通過RT-PCR鑒定ptxD基因在轉(zhuǎn)基因株系中的表達水平。與野生型對照(Westar)相比, 6個轉(zhuǎn)基因株系(L1、L4、L5、L10、L22和L24)均檢測到ptxD基因的表達(圖1-h)。進一步通過qRT-PCR驗證上述6個轉(zhuǎn)基因株系中ptxD基因的表達水平。結(jié)果顯示,ptxD基因在5個轉(zhuǎn)基因株系(L1、L4、L5、L10和L22)中的表達水平均顯著高于野生型對照(Westar) (圖1-i), 其中L5和L10的表達量最高。此外, 我們檢測了ptxD基因在L10株系各個組織中的表達水平, RT-PCR結(jié)果顯示L10植株的根、莖、葉樣品均擴增出216 bp的目的條帶(附圖3-c), 說明ptxD基因在L10轉(zhuǎn)基因油菜植株的根、莖、葉中都有表達。最終選擇表達量較高的2個轉(zhuǎn)基因油菜株系L5和L10進行后續(xù)研究。

圖1 含有密碼子優(yōu)化ptxDQ的轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜的產(chǎn)生

(a) 甘藍型油菜Westar在Pi和不同Phi濃度處理7 d后的生長情況。標尺為2 cm。(b) 生長7 d后下胚軸長度的統(tǒng)計情況。(c) 生長7 d后根長的統(tǒng)計情況。(d) 生長7 d后鮮重的統(tǒng)計情況。(e) 植物轉(zhuǎn)化載體p1300-ptxD示意圖。(f)和(g)以120 μg mL–1Hygromycin B和0.5 mmol L–1Pi +1.5 mmol L–1Phi為篩選劑進行轉(zhuǎn)化。標尺為2 cm。(h) 油菜再生苗RNA水平的PCR鑒定。(i) 油菜再生苗ptxD基因相對表達量分析。數(shù)字編號為不同的油菜再生苗單株, M為marker,為油菜內(nèi)參基因。使用檢驗進行顯著性檢驗, *、**、***分別表示在0.05、0.01、0.001概率水平差異顯著。

(a): the growth ofWestar treated with Pi and Phi at different concentrations for 7 days. Scale bar: 2 cm. (b): statistics of hypocotyl length after 7 days of growth. (c): statistics on root length after 7 days of growth. (d): Statistics on fresh weight after 7 days of growth. (e): Schematic diagram of the plant transformation vectorp1300-ptxD. (f) and (g): 120 μg mL–1hygromycin B and 0.5 mmol L–1Pi + 1.5 mmol L–1Phi were used as the screening agents for transformation. Scale bar: 2 cm. (h): PCR identification of RNA levels inseedlings. (i): the relative expression level ofptxDgene inregenerated seedlings. The numbers are differentregenerated seedling monocots, M is marker, andisinternal gene. The significance is analyzed by t-test. *, **, and *** mean significant difference at the 0.05, 0.01, and 0.001 probability levels, respectively.

表2 同一載體(pCMBIA1300-PtxDQ)不同篩選劑的轉(zhuǎn)化情況統(tǒng)計

2.2 ptxDQ轉(zhuǎn)基因油菜可以利用亞磷酸鹽作為磷的唯一來源

為了研究ptxD過表達的甘藍型油菜是否可以利用亞磷酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿猁}來供油菜的生長發(fā)育, 本研究將對照(Westar)和T1代轉(zhuǎn)基因植株(L5和L10)分別培養(yǎng)在塑料托盤中, 其中沙子和蛭石的比例為1︰1。分別用含無磷(No P)、4 mmol L–1Phi和1 mmol L–1Pi的Hogland營養(yǎng)液處理。播種14 d后, 在無磷和1 mmol L–1Pi條件下, 對照(Westar)和ptxD過表達株系的生長差異不明顯(圖2-a); 在Phi處理下, 對照(Westar)長勢較弱, 而ptxD過表達株系(L5和L10)長勢相對正常(圖2-a)。播種后56 d時, 與1 mmol L–1Pi處理條件相比, 對照(Westar)在不含P和Phi處理下的生長受到非常強的抑制(圖2-b);ptxD過表達株系(L5和L10)在不含磷和1 mmol L–1Pi處理條件下和對照無顯著差異, 而在外施4 mmol L–1Phi的條件下,ptxD過表達株系可以正常生長(圖2-b)。此外, 對照材料和ptxD過表達株系在Pi處理下在第68天左右開花, 而在Phi處理下,ptxD過表達株系在第76天開花, 對照材料Westar第89天時才開花(圖2-c)。

SPAD-502儀測定葉片葉綠素含量結(jié)果顯示, 不含P和Pi處理下的對照材料Westar和T1代ptxD過表達株系的SPAD值沒有顯著差異(圖2-d); 但外施Phi后, 轉(zhuǎn)基因植株L5和L10的葉綠素水平高于野生型植株Westar (圖2-d)。進一步測定了對照株系Westar和ptxD過表達株系在不同處理條件下植物體內(nèi)的Pi含量, 結(jié)果表明, 對照材料Westar在無P和Pi處理條件下, Pi含量分別為0.25 mg g–1DW和0.90 mg g–1DW,ptxD過表達株系L5和L10在無P和Pi處理條件下, Pi含量也分別在0.25 mg g–1DW和0.95 mg g–1DW, 兩者之間并無顯著差異(圖2-e)。在Phi處理條件下, 對照(Westar)體內(nèi)Pi含量為0.25 mg g–1DW, 而ptxD轉(zhuǎn)基因植株的Pi水平為2.0～2.2 mg g–1DW, 顯著高于對照植株(圖2-e)。表明ptxD轉(zhuǎn)基因株系可以有效地將Phi轉(zhuǎn)變?yōu)镻i, 從而提高轉(zhuǎn)基因油菜的生物量和葉綠素相對含量。

已有研究結(jié)果表明, 擬南芥磷轉(zhuǎn)運蛋白(、和)和磷響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子()編碼基因在植物缺P或低P條件下會顯著上調(diào)[31-33]。本研究進一步檢測對照株系(Westar)和T1代ptxD過表達株系(L5和L10)在無P、含有Phi或Pi培養(yǎng)2周后, 磷饑餓誘導(dǎo)基因的表達水平。在對照(Westar)材料中,、、和基因的表達水平在無P和Phi處理下與Pi處理相比顯著提高(圖3), 說明油菜、、和同源基因也受到低磷的誘導(dǎo)。在ptxD過表達株系中,等基因的表達水平在無P的條件下被顯著誘導(dǎo); 而Phi處理后,等基因的表達水平與Pi處理后的表達水平無顯著差異(圖3)。進一步說明ptxD可以將Phi轉(zhuǎn)變?yōu)镻i, 抑制低磷響應(yīng)基因的表達水平。

2.3 ptxDQ油菜在Phi處理下比雜草競爭力強

為了檢測Phi作為除草劑的可行性, 我們將對照材料(Westar)、T1代ptxD過表達株系(L5和L10)和單子葉雜草(狗尾草)分別培養(yǎng)在塑料托盤中, 分別用含無磷(No P)、8 mmol L–1Phi和1 mmol L–1Pi的Hogland營養(yǎng)液處理。添加Pi后, 狗尾草、野生型植株Westar和兩個轉(zhuǎn)基因品系L5和L10生長旺盛(圖4-a, b)。與Pi處理相比, 在Phi處理下野生型植株Westar和狗尾草的生長受到了顯著的抑制, 而ptxD轉(zhuǎn)基因株系L5和L10無顯著的差異(圖4-a, b)。經(jīng)Phi處理后, 狗尾草的鮮重顯著降低, 約為Pi處理條件下的54% (圖4-c);ptxD轉(zhuǎn)基因植株幼苗的鮮重也降低, 約為Pi處理條件下的26%, 與降低了84%的Westar相比, 顯著高于野生型植株Westar和狗尾草(圖4-d)。Phi處理過的ptxD轉(zhuǎn)基因植株的株高和根長度也沒有受到抑制, 它們比Phi處理過的野生型植株Westar更長(圖4-d), 這表明Phi具有作為苗期前除草劑殺死或抑制田間雜草的潛力。有意思的是, T1代ptxD過表達株系中有部分植株在外施Phi條件下, 植株生長顯著被抑制(圖4-e), 進一步利用ptxD基因特異性引物檢測部分株系(圖4-e中紅框標記)的基因組中是否插入了ptxD基因片段, 通過PCR結(jié)果顯示, 生長受抑制的株系均不能擴增ptxD基因特異性條帶(圖4-e), 推測T1代ptxD過表達株系中出現(xiàn)了分離。我們后續(xù)會擴大群體, 通過Southern blot等其他方法來檢測其拷貝數(shù)和計算分離比。

圖2 沙培水培法研究Phi對野生型和ptxDQ轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜植株生長的影響

(a)～(c)野生型植株和2個ptxD轉(zhuǎn)基因系(L5和L10, T1代)在沙培養(yǎng)(沙 : 蛭石=1:1)中分別生長14 d (a)、56 d (b)和76 d (c), 分別用無P、Pi或Phi營養(yǎng)液處理。(a)～(c)中比例尺分別為3 cm、7 cm、7 cm。(d) 柱狀圖為不含P、Pi或Phi營養(yǎng)液灌溉2周后野生型植株和2個ptxD轉(zhuǎn)基因品系的SPAD值。(e)柱狀圖為不加P、Pi或Phi營養(yǎng)液灌溉2周后野生型植株和2個ptxD轉(zhuǎn)基因品系的Pi含量。使用檢驗進行顯著性檢驗: 當≤ 0.05時, 如果用不同的小寫字母標注, 則條形圖代表的值存在顯著差異。

(a)–(c): the image shows the Westar plants and twoptxDtransgenic lines (L5 and L10, T1generation) grown in sand culture (sand : vermiculite = 1:1) for 14-day (a), 56-day (b) and 76-day (c) by irrigating no P, Pi, or Phi nutrient solutions. In (a)–(c), the scale bar was 3, 7, and 7 cm, respectively. (d): bar graph shows the SPAD values of Westar and twoptxDtransgenic lines irrigated by no P, Pi, or Phi nutrient solutions for two weeks. (e): bar graph shows the Pi contents of Westar and twoptxDtransgenic lines irrigated by no P, Pi, or Phi nutrient solutions for two weeks. Different lowercase letter indicates significant difference at≤ 0.05 by-test.

(a)的相對表達量; (b)的相對表達量; (c)的相對表達量; (d)的相對表達量。使用檢驗進行顯著性檢驗: 當≤ 0.05時, 如果用不同的小寫字母標記, 則條形圖代表的值存在顯著差異。

(a): the relative expression level of; (b): the relative expression level of; (c): the relative expression levels of; (d): the relative expression of. Different lowercase letter indicates significant difference at≤ 0.05 by-test.

(圖4)

(a)和(b) Westar、狗尾草和轉(zhuǎn)基因植株在Pi和Phi處理3周后的生長發(fā)育情況, Pi濃度為1 mmol L-1, Phi濃度為8 mmol L-1。(a) 標尺為5 cm; (b) 標尺為2 cm。(c) 柱狀圖為(a)所示43株狗尾草的鮮重。使用檢驗進行顯著性檢驗: ***,< 0.0001。(d) Westar和轉(zhuǎn)基因植株在Pi和Phi處理3周后的鮮重、株高、根長的情況。(e) T1代轉(zhuǎn)基因株系中的ptxD特異性條帶的PCR分析。1～5, 表示L10的不同轉(zhuǎn)基因植株。使用檢驗進行顯著性檢驗: 當≤ 0.05時, 如果用不同的小寫字母標記, 則條形圖代表的值存在顯著差異。

(a) and (b): growth and development of Westar, Setaria, and transgenic plants after 3 weeks of Pi and Phi treatment, Pi concentration was 1 mmol L-1, Phi concentration was 8 mmol L-1, (a) Scale bar: 5 cm; (b) Scale bar: 2 cm. (c): bar graph shows fresh weight ofrepresenting in (a).The significance is analyzed by-test: ***:< 0.0001.(d): fresh weight, plant height, and root length of Westar and transgenic plants after 3 weeks of Pi and Phi treatment. (e):ptxDspecific band in T1transgenic lines by PCR.1-5, indicated different transgenic plants of L10. Different lowercase letter indicates significant difference at≤ 0.05 by-test.

3 討論

油菜田間常伴生著大量的雜草, 嚴重影響了油菜的生產(chǎn), 加上除草劑(如草甘膦等)過量使用, 油菜田間抗除草劑雜草的數(shù)量逐年增加[34-36]。已有研究表明,/Phi系統(tǒng)可以有效控制棉花和煙草中的雜草[19,22], 但是該系統(tǒng)在油菜中的應(yīng)用還未見報道。本研究將來源于羅爾斯通菌中的ptxD基因轉(zhuǎn)化到甘藍型油菜,ptxD轉(zhuǎn)基因油菜能夠在以亞磷酸為唯一磷源的條件下正常生長, 且與雜草相比具有顯著的生長優(yōu)勢, 為解決磷利用和控制油菜田間雜草提供了一條新途徑。

由于除草劑在農(nóng)業(yè)中的持續(xù)大量使用, 抗除草劑雜草的數(shù)量急劇增加, 因此需要尋找新的除草劑資源。常規(guī)除草劑針對特定的代謝酶, 如草甘膦可以抑制莽草酸途徑(shikimate pathway)中的關(guān)鍵酶 5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的活性[37]。此前已經(jīng)有很多報道, 將EPSPS不同位點的脯氨酸突變可以顯著降低草甘膦與EPSPS的結(jié)合[38-40]。其原理是隨著氨基酸種類的改變, EPSPS的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化, 從而使其與底物的親和力增加, 導(dǎo)致草甘膦無法再占據(jù)PEP結(jié)合位點, 植物因此形成對草甘膦的抗性[41]。但是, 持續(xù)使用相同的除草劑加速了雜草的進化。Gaines等[42]發(fā)現(xiàn)了一種高度抗草甘膦的雜草, 其中基因擴增了100倍, 導(dǎo)致過表達40倍。植物的生長依賴于Pi的持續(xù)供應(yīng), 然而, 大部分Pi會與土壤中的金屬離子(如Ca2+、Fe3+和Al3+)結(jié)合形成不溶性磷酸鹽, 并且Pi被細菌迅速轉(zhuǎn)化為不能被植物直接吸收和利用的有機形式[16,18,43]。磷肥的過量使用還會導(dǎo)致水系富營養(yǎng)化[44-45]。因此, 尋找能夠替代磷的新型肥料成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的迫切需要。與Pi相比, Phi具有獨特的生化特性, 有更高的溶解度, 但與金屬離子的化學(xué)反應(yīng)性較低, 大多數(shù)微生物無法利用[44,46-47]。Phi在結(jié)構(gòu)上類似于Pi, 植物能夠通過Pi轉(zhuǎn)運蛋白吸收Phi[13]。植物自身不能直接代謝Phi, 外施Phi顯著抑制植物的生長發(fā)育[17-19], 表明Phi可以作為單子葉和雙子葉植物的苗前和苗后除草劑。在自然界中, Phi可以被少數(shù)土壤和海洋細菌利用[14,26], 通過NAD依賴性亞磷酸酯氧化還原酶(PTXD)將Phi轉(zhuǎn)化為Pi[47-49]。我們之前從sp. 4506(PtxDR4506)中克隆了基因, 通過定向進化將139位的酪氨酸突變?yōu)楣劝滨０? 脫氫酶的催化活性顯著提高[27]。ptxD轉(zhuǎn)基因品系可以通過將Phi轉(zhuǎn)化為Pi來緩解Phi對油菜的生長抑制(圖2), 并通過提供Phi來減弱ptxD轉(zhuǎn)基因品系的磷饑餓反應(yīng)(圖3)。這些結(jié)果表明, 我們可以利用ptxD基因建立以Phi為磷肥和除草劑的植物磷利用與雜草控制相結(jié)合的體系。此外我們可以看到, Phi可以抑制非轉(zhuǎn)基因油菜和狗尾草的生長, 因此我們推測Phi對雙子葉雜草可能也有同樣的作用效果, 因為本研究所用的雜草為狗尾草, 在后續(xù)在試驗過程中, 我們會在田間進行外施Phi觀察其對雙子葉雜草的防控效果。此外也會選擇一些抗性雜草進行驗證。

在組織培養(yǎng)中, 抗生素和除草劑抗性基因常被用作篩選轉(zhuǎn)基因陽性植株的選擇性標記。然而, 這些抗性基因有可能會轉(zhuǎn)移到可共存的其他雜草中, 從而產(chǎn)生“超級雜草”和10種抗生素耐藥性[50-51]。此外, 很少有選擇性藥物對植物細胞增殖和分化有負面影響[17,52]。由于可以作為植物遺傳轉(zhuǎn)化的新型選擇性標記, 因此在植物生物技術(shù)發(fā)展過程中顯示出巨大的潛力[25]?；蚺c以Phi為唯一磷源的選擇性培養(yǎng)基結(jié)合, 作為一種有效的系統(tǒng)來選擇多種植物的轉(zhuǎn)化細胞[17,19,23]。我們發(fā)現(xiàn)Phi強烈抑制愈傷組織再生(附圖2), 與煙草的研究結(jié)果一致[22]。在Phi培養(yǎng)基中添加了Pi后, 油菜愈傷可以進行再分化(圖1-f), 并最終獲得了再生苗, 但這些再生植株并不是陽性轉(zhuǎn)基因株系, 推測可能是使用的Phi濃度過低, 加上轉(zhuǎn)化的外植體數(shù)量不足等原因?qū)е挛覀兾茨芡ㄟ^Phi篩選到陽性轉(zhuǎn)基因株系,接下來我們將繼續(xù)驗證其作為油菜轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的可能性。

4 結(jié)論

本研究首先使用含有不同濃度的亞磷酸鹽處理甘藍型油菜, 結(jié)果表明, 隨著亞磷酸濃度的升高, 油菜的生長被顯著抑制, 表明亞磷酸對油菜幼苗的生長具有較強抑制作用。前期研究發(fā)現(xiàn), 羅爾斯通菌屬(sp. strain 4506)中ptxD蛋白139位的酪氨酸突變?yōu)楣劝滨０?Y139Q)后能夠提高其催化Phi轉(zhuǎn)化為Pi的活性。在此基礎(chǔ)上, 通過遺傳轉(zhuǎn)化將ptxD轉(zhuǎn)入到甘藍型油菜并獲得陽性轉(zhuǎn)基因株系。與對照植株相比,ptxD轉(zhuǎn)基因油菜可以明顯減輕亞磷酸鹽對油菜生長的抑制作用, 且體內(nèi)正磷酸鹽含量在ptxD轉(zhuǎn)基因株系中顯著提高, 表明轉(zhuǎn)基因油菜能將Phi氧化成Pi供油菜生長發(fā)育。此外,p1300- ptxD轉(zhuǎn)基因油菜比狗尾草具有更強的生長競爭優(yōu)勢, 表明ptxD/Phi系統(tǒng)可以有效控制雜草生長。綜上所述,ptxD轉(zhuǎn)基因油菜具有將Phi轉(zhuǎn)化為Pi的能力, 從而賦予其在Phi條件下比野生型油菜和雜草更強的生長競爭優(yōu)勢, 表明ptxD/Phi是有效的油菜磷利用和雜草控制系統(tǒng), 為有效解決油菜磷利用和雜草控制提供了全新的可行方案。

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附圖1 不同生態(tài)型油菜在Pi和Phi下的水培試驗

Fig. S1 Hydroponics experiments of different ecotypes ofunder Pi and Phi

(a)和(b) 處理2周后不同油菜的生長狀況。Pi濃度為1 mmol L–1, Phi濃度為4 mmol L–1。標尺為2 cm。(c) 處理2周后不同油菜根長的統(tǒng)計。(d) 處理2周后不同油菜鮮重的統(tǒng)計。使用檢驗進行顯著性檢驗: 當≤ 0.05時, 如果用不同的小寫字母標注, 則條形圖代表的值存在顯著差異。

(a) and (b) growth of differentafter 2 weeks of treatment. The Pi concentration is 1 mmol L–1and the Phi concentration is 4 mmol L–1. Scale bar: 2 cm. (c) statistics of differentroot length after 2 weeks of treatment. (D) statistics of differentfresh weight after 2 weeks of treatment. The significance is analyzed at≤ 0.05 by-test. The values represented by the bars chart are significantly different if marked with different lowercase.

附圖2 ptxD蛋白序列分析

Fig. S2 Protein sequence analysis ofptxD

PtxDR4506、PtxDR4506(Y139Q)和PtxDWM88氨基酸序列比對。相同的殘基用黑色表示, 相似的殘基用灰色表示。

Alignment of PtxDR4506, PtxDR4506(Y139Q), and PtxDWM88amino acid sequence. The identical residues were shaded by black, and the similar residues were shaded by gray.

附圖3 潮霉素B和Phi對愈傷組織再生的影響

Fig. S3 Callus regeneration with Hygromycin B or Phi selection on shoot initiation media

(a) 以120 μg mL–1Hygromycin B和1 mmol L–1Phi為篩選劑進行轉(zhuǎn)化。標尺為2 cm。(b) 油菜再生苗DNA水平的PCR分析。數(shù)字編號為不同的油菜再生苗單株, M為marker。(c) 轉(zhuǎn)基因油菜L10株系的根、莖、葉的RT-PCR分析。為油菜內(nèi)參基因。

(a) 120 μg mL–1Hygromycin B and 1 mmol L–1Phi were used as screening agents for transformation. Scale bar: 2 cm. (b) PCR identification ofseedlings at DNA level. The numbers are differentregenerated seedling monocots, M is marker. (c) RT- PCR analysis of roots, stems, and leaves of L10 strain of transgenic rapeseed.isinternal gene.

Developing and resistance assessing of phosphite-tolerant herbicide transgenicL.

ZHONG Yuan, ZHU Tian-Yu, DAI Cheng, and MA Chao-Zhi*

National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University / National Engineering Research Center of Rapeseed / Hongshan Laboratory, Wuhan 430070, Hubei, China

During the production of, the yield and quality of the crop are seriously affected by a large number of accompanying weeds. Herbicide control options are rapidly diminishing due to the recent increase in the number of herbicide-resistant weeds in fields, which affects the sustainable development of agriculture in the future. Plants can take up phosphite (Phi) via orthophosphate (Pi) transporters, but the Phi cannot be metabolized and used as a phosphorus fertilizer for crops, resulting in plant growth inhibition. Previously, agene isolated fromsp. 4506, and the mutant protein ptxDQat position 139, which had tyrosine mutation to glutamine (Y139Q), significantly improved the conversion activity of Phi to Pi. To evaluate the efficacy ofptxD/Phi-based weed control system in, we generated transgenicplants with a codon-optimized(Y139Q,ptxD) gene. Ectopic expression ofptxDconfered the ability to convert Phi to Pi, resulting in improving plant growth in the presence of Phi. Pi-starvation-induced genes (e.g.and) were suppressed in theptxDtransgenic lines by supplying Phi, indicating thatptxDcan transform Phi into Pi in rapeseed. In addition,ptxDtransgenichad a greater competitive growth advantage over wild-typeand monocotyledonous weeds (). In conclusion, theptxD/Phi system provided an effective alternative for suppressing the weed growth while providing adequate Pi nutrition to the crops, which in turn improved the sustainability of agriculture.

; herbicide; phosphite;

10.3724/SP.J.1006.2024.34110

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(32072105)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (32072105).

馬朝芝, E-mail: yuanbeauty@mail.hzau.edu.cn

E-mail: zy14745140090623@163.com

2023-07-03;

2023-10-23;

2023-12-13.

URL: https://link.cnki.net/urlid/11.1809.S.20231212.1648.002

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