張保根 楊澍 陳斌妮 陳文 鄭梓瑩 張燕

為使用生物信息學(xué)系統(tǒng)分析孕激素相關(guān)子宮內(nèi)膜蛋白（Progestagen-associated endometrial protein， PAEP）在胃癌中的早期診斷和預(yù)后預(yù)測性能及免疫浸潤相關(guān)性，該研究構(gòu)建預(yù)測模型ROC曲線和偏差校正曲線檢驗(yàn)其性能準(zhǔn)確性，并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證分析結(jié)果.生信分析結(jié)果顯示，與正常組織相比，胃癌組織中PAEP的表達(dá)較高，在早期（T1期、N0期、M0期）即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ＜0.001），且診斷胃癌的準(zhǔn)確性較高（ROC曲線下面積為0889）；PAEP高表達(dá)的胃癌患者預(yù)后較差（ P ≤0.001）；TNM分期越晚，年齡越大，PAEP表達(dá)越高，胃癌患者生存概率越低，偏差校正曲線接近理想曲線（45°線），顯示預(yù)測結(jié)果良好；PAEP的表達(dá)與胃癌中的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的浸潤水平呈正相關(guān)趨勢，與B細(xì)胞、中央記憶型T細(xì)胞、T細(xì)胞呈顯著的負(fù)相關(guān)趨勢.qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，HGC-27、BGC-823、MKN-45、SGC-7901和AGS細(xì)胞中PAEP基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平均顯著高于GES-1. 結(jié)果表明了PAEP 蛋白可用于胃癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物，并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，其機(jī)制與免疫有關(guān).

胃癌； 孕激素相關(guān)子宮內(nèi)膜蛋白； TCGA； 生存分析； 免疫浸潤

R73-3 A 2024.016002

The role of Progestagen-associated endometrial protein in ?early diagnosis and prognosis of gastric cancer

ZHANG Bao-Gen， YANG Shu， CHEN Bin-Ni， CHEN Wen， ZHENG Zi-Ying， ZHANG Yan

（The Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University， Quanzhou 362000， China）

To use a bioinformatics system to analyze the early diagnosis and prognosis prediction performance and immune infiltration correlation of Progestagen-associated endometrial protein （PAEP） in gastric cancer， this study constructed a predictive model ROC curve and deviation correction curve to test its performance accuracy， and further validate the analysis results through cell experiments. The results of bioinformatics analysis showed that the expression of PAEP in gastric cancer tissues was higher than that in normal tissues， which was statistically significant in the early stages （T1， N0， M0） （ P ?< 0.001）， and the diagnostic accuracy of gastric cancer was higher （the area under ROC curve was 0889）. The prognosis of gastric cancer patients with high expression of PAEP was poor （ P ?≤ 0.001）. The later the TNM stage， the older the age， the higher the expression of PAEP， and the lower the survival probability of gastric cancer patients， and the deviation correction curve was close to the ideal curve （45 ° line）， indicating a good predictive result. The expression of PAEP was positively correlated with the infiltration level of neutrophils and macrophages in gastric cancer， and negatively correlated with B cells， central memory T cells and T cells. qRT-PCR and Western blot results showed that the transcriptional and protein expression levels of PAEP in HGC-27， BGC-823， MKN-45， SGC-7901 and AGS cells were significantly higher than those in GES-1 cells. The results indicate that PAEP protein can be used as a biomarker in the diagnosis and prognosis of gastric cancer， which is verified by experiments， and its mechanism is related to immunity.

Gastric cancer; Progestagen-associated endometrial protein; TCGA; Survival analysis; Immune infiltration

1 引 言

胃癌（Gastric Cancer， GC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，是全球死亡率排名第四的癌癥 ?［1］ .我國是目前全球胃癌發(fā)病率最高的國家，且居癌癥死亡原因第三位 ?［2，3］ .目前，早期診斷、治療胃癌的手段仍存在很多不足之處，胃癌的手術(shù)治療作為唯一能夠根治的手段，常因早期診斷方法的限制、早期癥狀隱匿不被察覺而難以實(shí)施，多數(shù)患者一經(jīng)診斷即為晚期，預(yù)后不盡人意 ?［4］ .雖然胃癌的篩查方法多種多樣，但這些篩查方法仍存在著靈敏度及特異度不佳等諸多問題 ?［5，6］ ，難以在臨床中廣泛篩選出胃癌患者.因此，提高胃癌檢出率，挖掘更靈敏、更特異的胃癌潛在的診斷、免疫和預(yù)后生物標(biāo)志物已經(jīng)受到越來越多研究者的關(guān)注.

孕激素相關(guān)子宮內(nèi)膜蛋白（Progestagen-associated endometrial protein， PAEP）是一種糖蛋白，近年人們通過研究發(fā)現(xiàn)PAEP能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲 ?［7-9］ .有研究 ?［9-12］ 發(fā)現(xiàn)PAEP在多種惡性腫瘤中特異性表達(dá)，與癌癥患者的診斷和預(yù)后密切相關(guān)，并且可以影響腫瘤免疫微環(huán)境從而導(dǎo)致腫瘤免疫逃脫，但目前國內(nèi)外有關(guān)PAEP在胃癌發(fā)生發(fā)展及臨床意義方面的研究相對較匱乏.

本研究將采用生物信息學(xué)方法，分析PAEP基因表達(dá)與胃癌的相關(guān)性，通過對腫瘤基因圖譜（The Cancer Genome Atlas， TCGA）數(shù)據(jù)庫挖掘和分析，探討PAEP在胃癌中的早期診斷和預(yù)后預(yù)測性能及免疫浸潤相關(guān)性，最后通過qRT-PCR和Western blot技術(shù)進(jìn)一步進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，證明PAEP在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)，旨在提高對早期胃癌的檢出率，盡早行之以有效的治療，并為臨床上該病的診斷提供新的思路，爭取做到“早發(fā)現(xiàn)，早干預(yù)”，提高患者生存質(zhì)量.

2 材料與方法

2.1 數(shù)據(jù)源

TCGA數(shù)據(jù)庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）是一個大規(guī)模癌癥研究參考數(shù)據(jù)庫，目前收錄了33種癌癥的臨床和病理信息.本研究的胃癌患者RNA-Seq的表達(dá)數(shù)據(jù)和匹配臨床病理信息是來源于TCGA的STAD項(xiàng)目中對應(yīng)的正常組織數(shù)據(jù)以及泛癌數(shù)據(jù)，因來源是同一個項(xiàng)目，使用的設(shè)備、采用的材料方法以及選用參數(shù)是相同的，故不需要再進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理.TCGA數(shù)據(jù)庫是開放訪問和公開使用的，因此不需要得到當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會的批準(zhǔn).

2.2 方 法

2.2.1 表達(dá)差異分析 ?轉(zhuǎn)換與整理數(shù)據(jù)后，運(yùn)用R 3.6.3軟件的ggplot2包對正常癌旁組織與胃癌組織的數(shù)據(jù)進(jìn)行PAEP基因表達(dá)的差異分析.進(jìn)一步對臨床數(shù)據(jù)分析，根據(jù)不同TNM分期的患者進(jìn)行基因表達(dá)差異性比較.同時繪制ROC曲線，計(jì)算曲線下面積AUC值以評估PAEP診斷胃癌的準(zhǔn)確性.

2.2.2 生存分析 ?為了探究PAEP的表達(dá)水平是否影響胃癌患者的臨床結(jié)果，本研究使用R 363軟件的survival包對患者的生存資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并通過survminer包作可視化處理，構(gòu)建Kaplan-Meier（K-M）生存曲線來比較PAEP高低表達(dá)患者間的生存差異.

2.2.3 單因素和多因素Cox回歸分析 ?使用R 3.6.3軟件的survival包進(jìn)行Cox回歸分析，進(jìn)一步確定PAEP表達(dá)在胃癌患者中的影響.為控制混合偏倚，聯(lián)合單因素與多因素Cox回歸分析來評估與胃癌患者生存率相關(guān)的預(yù)后因素.當(dāng) P 值小于0.05時，該預(yù)后因素在回歸分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性.

2.2.4 預(yù)測因素Nomogram分析 ?為了提供一種預(yù)測胃癌患者預(yù)后的定量方法，基于單因素及多因素回歸模型的結(jié)果，選擇其中的預(yù)后因素建立列線圖，個性化分析1、3、5年的預(yù)測生存概率.運(yùn)用R 3.6.3軟件的RMS包與survival包對獨(dú)立預(yù)后因素的數(shù)據(jù)進(jìn)行校準(zhǔn)與Nomogram分析，生成包含顯著臨床特征和校準(zhǔn)圖的列線圖.校準(zhǔn)曲線通過將列線圖預(yù)測概率與觀測到的概率相映射以進(jìn)行圖形評估，45°線代表最佳預(yù)測值.使用一致性指數(shù)以確定列線圖的區(qū)分度，并比較列線圖和單獨(dú)預(yù)后因素的預(yù)測準(zhǔn)確性.所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均為雙尾檢驗(yàn)，研究的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平設(shè)置為0.05.

2.2.5 免疫浸潤相關(guān)分析 ?利用R 3.6.3軟件的GSVA包進(jìn)行免疫浸潤相關(guān)分析，具體算法為GSVA包的內(nèi)置算法ssGSEA，相關(guān)性分析方法選用Spearman分析.

2.2.6 細(xì)胞培養(yǎng) ?將人胃癌HGC-27、BGC-823、MKN-45、SGC-7901和AGS細(xì)胞株以及正常胃上皮細(xì)胞株GES-1（細(xì)胞均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）接種至加有加10%胎牛血清，青霉素（100 U/mL）以及鏈霉素（100 U/mL）的1640-DF12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于5% CO 2，37 ℃，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)基.

2.2.7 qRT-PCR法檢測PAEP mRNA表達(dá) ?將人胃癌HHGC-27、BGC-823、MKN-45、SGC-7901和AGS細(xì)胞株以及正常胃上皮細(xì)胞株GES-1培養(yǎng)后，Trizol試劑（貨號15596026，Thermo Fisher Scientific）用于提取各細(xì)胞株的總mRNA，并按照試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作，合成cDNA，利用qRT-PCR法檢測PAEP mRNA表達(dá)水平，在qRT-PCT儀（ABI 7500 Fast Real-Time PCR System，Thermo Fisher Scientific）以95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s進(jìn)行循環(huán)，循環(huán)40次.取PCR產(chǎn)物8 μL加 5× Loading Buffer 2 μL 2%瓊脂糖凝膠電泳 120 V ，100 mA，30min溴化乙錠染色，凝膠成象儀成象并保存結(jié)果.采用2-△△CT法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量.

2.2.8 Western Blot檢測細(xì)胞中PAEP蛋白表達(dá) ?提取細(xì)胞株總蛋白，并使用BCA法進(jìn)行蛋白濃度定量操作.細(xì)胞裂解液置于聚丙烯酰胺凝膠泳道中，電泳分離并利用轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜過夜，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，利用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入以1∶1000稀釋的一抗，在4 ℃溫度下過夜，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH.TBST洗膜3次，加入1∶1000稀釋的二抗，室溫下震蕩1 h，TBST洗滌3次，化學(xué)發(fā)光法顯色、顯影，蛋白條帶采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行分析.

2.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 ?實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ?x±ｓ ） 表示，利用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組之間比較利用單因素方差分析，組間兩兩比較利用t檢驗(yàn).差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)為 P <0.05.

3 結(jié) 果

3.1 臨床特征

來自TCGA的375個胃癌樣本和32個正常癌旁組織樣本的RNA測序數(shù)據(jù)和詳細(xì)的臨床信息資料被納入本研究中.在去除重復(fù)樣本后，表2總結(jié)了胃癌患者中PAEP高表達(dá)與低表達(dá)的臨床信息，包括TNM分期、病理階段、主要治療效果、性別、年齡、殘留腫瘤、組織學(xué)分級等信息.

3.2 基因差異分析結(jié)果

圖1中，A為非配對樣本的差異基因分析，腫瘤組PAEP的表達(dá)量明顯高于正常對照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ＜0.001）.B為配對樣本的差異基因分 析，來自同一個病人的樣本同樣表現(xiàn)出??PAEP表達(dá)量胃癌組織高于正常組織，進(jìn)一步能說明PAEP的表達(dá)與胃癌相關(guān).圖2的亞組分析對TNM不同分期的正常人與胃癌患者進(jìn)行差異性分析，結(jié)果顯示正常人與不同分期的胃癌患者的PAEP表達(dá)均有顯著差異，胃癌患者的樣本中PAEP呈高表達(dá).在TNM分期的早期（T1期、N0期、M0期），PAEP的表達(dá)量就明顯高于正常對照組，提示PAEP可能有利于胃癌患者的早期篩查.繪制ROC曲線進(jìn)一步評價PAEP診斷胃癌的準(zhǔn)確性，曲線下面積AUC值為0.889，說明PAEP對于胃癌診斷的準(zhǔn)確性較高，見圖3.

3.3 生存分析結(jié)果

借助K-M生存曲線評估預(yù)測模型的預(yù)測能力，結(jié)果表明PAEP表達(dá)較高的胃癌患者總體生存率、疾病特異性生存率、無進(jìn)展生存率均較低，預(yù)后較差，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ≤0.001），見圖4.

3.4 預(yù)后因素Nomogram分析

在基于多因素Cox回歸分析的列線圖中，將胃癌患者TNM期、年齡與PAEP表達(dá)的積分相加得 到總分，總分越高，胃癌患者在1年、3年和5年的生存概率越低（圖5a），并通過模型擬合分析列線圖的預(yù)測效率（圖5b）.結(jié)果表明，TNM分期越晚，年齡越大，PAEP表達(dá)越高，胃癌患者生存概率越低.校準(zhǔn)圖中的偏差校正線接近理想曲線（45°），顯示預(yù)測結(jié)果良好，且1年的生存概率更接近理想情況.

3.5 基因PAEP與浸潤性免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析

腫瘤相關(guān)的浸潤性淋巴細(xì)胞會影響腫瘤患者的生存率，本研究分析了PAEP的表達(dá)與24種浸潤性免疫細(xì)胞的相關(guān)性.結(jié)果顯示PAEP的表達(dá)與中性粒細(xì)胞（ P ＜0.001）、巨噬細(xì)胞（ P ＜0.05）、B細(xì)胞（ P ＜0.001）、中央記憶型T細(xì)胞（ P ＜0.001）、T細(xì)胞（ P ＜0.001）密切相關(guān)，前二者為正關(guān)聯(lián)關(guān)系，后三者為負(fù)關(guān)聯(lián)關(guān)系.

3.6 胃癌細(xì)胞中PAEP表達(dá)情況

qRT-PCR結(jié)果顯示，胃癌（HGC-27、BGC-823、MKN-45、SGC-7901和AGS）細(xì)胞mRNA表達(dá)比正常胃上皮（GES-1）細(xì)胞中表達(dá)高，經(jīng)組間t檢驗(yàn)比較得出，升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.01）.Western blot結(jié)果顯示，PAEP蛋白條帶在胃癌（HGC-27、BGC-823、MKN-45、SGC-7901和AGS）細(xì)胞中明顯，通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)以及灰度統(tǒng)計(jì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)胃癌（HGC-27、BGC-823、MKN-45、SGC-7901和AGS）細(xì)胞相較于正常胃上皮（GES-1）細(xì)胞PAEP蛋白表達(dá)明顯升高（ P <001），如圖8.

4 討 論

胃癌作為我國最常見的惡性腫瘤之一，已成為困擾我國人民的一個重要公共衛(wèi)生問題 ?［13，14］ .胃癌在世界上的發(fā)病率和死亡率也一直處于居高不下的地位，因其早期癥狀的隱匿性，導(dǎo)致很多患者錯失治療最佳時期，是危及人民生命健康，全世界關(guān)注并且急需早日解決的的重大難題 ?［15］ .

許多研究 ?［16-19］ 發(fā)現(xiàn)，PAEP異常表達(dá)于多種惡性腫瘤組織，且與腫瘤的多種重要生物學(xué)行為息息相關(guān)，但其中與胃癌相關(guān)的報道較少，PAEP在胃癌的分期、預(yù)后中的關(guān)系仍不甚明確.胃癌一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，治療就將會變得十分困難.Riker等提出在在腫瘤發(fā)展的不同階段，一些基因會過表達(dá)而另一些則會低表達(dá)，如胃蛋白酶，骨髓增生異常白血病因子1相互作用蛋白等表達(dá)就與胃癌發(fā)生發(fā)展有關(guān) ?［20-22］ .這為探索胃癌發(fā)展過程中的分子機(jī)制，嘗試找出PAEP與胃癌診斷、免疫和預(yù)后的聯(lián)系提供了新的線索.

本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對PAEP表達(dá)與胃癌發(fā)生發(fā)展、預(yù)后及免疫之間的關(guān)系進(jìn)行探究.結(jié)果表明，PAEP可能是胃癌早期診斷、預(yù)后的潛在標(biāo)志物，與正常對照組相比，其在胃癌組中呈高表達(dá)，且兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ＜0.001）.PAEP表達(dá)與生存時間、預(yù)后相關(guān)，PAEP表達(dá)越高，胃癌患者生存概率越低，預(yù)后越差，尤其在早期的胃癌（T1期、N0期、M0期）中有較顯著的預(yù)測效應(yīng).ROC曲線是一種用于預(yù)測準(zhǔn)確率情況的統(tǒng)計(jì)學(xué)模型，在醫(yī)學(xué)上常用于判斷某種因素對于某種疾病的診斷是否有診斷價值 ?［23］ .ROC曲線下面積（AUC）常用作評價預(yù)測模型優(yōu)劣的定量指標(biāo)，一般而言，AUC為0.5時表示無預(yù)測意義，0.7至0.8被認(rèn)為是可接受的，0.8至0.9被認(rèn)為是優(yōu)秀的，超過0.9被認(rèn)為杰出的 ?［24］ .本研究構(gòu)建了PAEP診斷胃癌的預(yù)測模型，ROC曲線下面積為0.889，介于0.8～0.9之間，說明PAEP作為診斷早期胃癌的標(biāo)志物，準(zhǔn)確性較高.

生存分析結(jié)果表明，PAEP高表達(dá)的胃癌患者預(yù)后較差.在臨床影響因素方面，本研究納入了影響因素進(jìn)行單因素和多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示年齡＞65歲和治療結(jié)果中的完全緩解指標(biāo)（CR）是影響TCGA胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素.Nomogram分析是基于回歸分析的結(jié)果預(yù)測某臨床事件發(fā)生可能性的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 ?［25］ .本研究根據(jù)多因素Cox回歸分析構(gòu)建了Nomogram模型，并以模型擬合分析評價Nomogram模型，校準(zhǔn)圖中偏差校正線接近理想曲線，說明擬合度良好，可對疾病進(jìn)程進(jìn)行預(yù)測.預(yù)測結(jié)果表明，TNM分期越晚，年齡越大，PAEP表達(dá)越高，胃癌患者生存概率越低.

免疫浸潤方面，本研究發(fā)現(xiàn)PAEP的表達(dá)水平與胃癌中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的浸潤水平有顯著一致的相關(guān)性，整體呈正相關(guān)趨勢，而B細(xì)胞、中央記憶型T細(xì)胞、T細(xì)胞則與PAEP的表達(dá)水平呈顯著的負(fù)相關(guān)趨勢.Weber等 ?［26］ 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)PAEP在癌癥中作為預(yù)后生物標(biāo)志物具有可行性并且其作為免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑具有潛在的作用.有研究 ?［27，28］ ?表明，PAEP的表達(dá)與巨噬細(xì)胞有強(qiáng)相關(guān)性，糖蛋白A（Glycodelin A， GdA）屬于PAEP亞型的一種，其能抑制單核細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)單核細(xì)胞凋亡.PAEP與T細(xì)胞、B細(xì)胞的表達(dá)水平也有較強(qiáng)相關(guān)性，整體呈顯著的負(fù)相關(guān)趨勢，如GdA使T細(xì)胞不能對IL-2作出反應(yīng)，從而刺激細(xì)胞周期停滯、效應(yīng)功能喪失和不同T細(xì)胞亞群的凋亡 ?［29］ ；GdA能抑制B細(xì)胞的增殖，但是不能誘導(dǎo)其凋亡 ?［30］ .

為進(jìn)一步驗(yàn)證PAEP在胃癌中的作用，本研究利用qRT-PCR和Western blot的實(shí)驗(yàn)方法檢測了PAEP基因與蛋白表達(dá)在胃癌細(xì)胞與正常胃上皮細(xì)胞中的差異，qRT-PCR結(jié)果顯示胃癌細(xì)胞中PAEP基因的表達(dá)明顯升高.Western blot結(jié)果顯示胃癌細(xì)胞中PAEP蛋白的表達(dá)明顯升高.

綜上所述，PAEP的高表達(dá)與胃癌的進(jìn)展、預(yù)后不良以及免疫細(xì)胞浸潤有關(guān)，可作為胃癌潛在的早期診斷、預(yù)后及免疫標(biāo)志物.但本研究尚待進(jìn)一步的臨床實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果.

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收稿日期： ?2023-02-17

基金項(xiàng)目： ?福建省中醫(yī)藥科研課題（2017FJZYLC502）

作者簡介： ??張保根（1986-）， 男， 江西吉安人， 碩士研究生， 研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合防治腫瘤疾病.E-mail： 395085502@qq.com

通信作者： ?楊澍. E-mail： 775648951@qq.com