摘 要：目的：驗(yàn)證沈陽市食品藥品檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)室是否有開展《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中4-己基間苯二酚殘留量的測定》（GB 5009.280—2020）項(xiàng)目的檢驗(yàn)?zāi)芰?。方法：采用高效液相色譜進(jìn)行分離，熒光檢測器進(jìn)行檢測分析，根據(jù)保留時間進(jìn)行定性分析，外標(biāo)法進(jìn)行準(zhǔn)確定量，同時驗(yàn)證方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍、檢出限、定量限、精密度和回收率。結(jié)果：當(dāng)4-己基間苯二酚濃度在0.02～2.00 mg·L-1時，呈現(xiàn)出的線性關(guān)系良好，方法檢出限、定量限、精密度和回收率均能滿足國家標(biāo)準(zhǔn)方法要求。結(jié)論：沈陽市食品藥品檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)室有能力進(jìn)行食品中4-己基間苯二酚殘留量的測定。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜；食品；4-己基間苯二酚；方法驗(yàn)證

Validation of Method for Determination of 4-Hexylresorcinol Residues in Food by High Performance Liquid Chromatography

WANG Yun1， LI Qiaolian1， LIN Yang1， YU Jiaozhu1， JU Xiaoying1， DANG Hui2

（1.Shenyang Food and Drug Inspection Institute， Shenyang 110122， China; 2.Liaoning Open University， Shenyang 110034， China）

Abstract： Objective： To verify whether the laboratory of Shenyang Institute for Food and Drug Control has the ability to carry out the GB 5009.280—2020 project. Method： High performance liquid chromatography was used for separation， fluorescence detector was used for detection and analysis， qualitative analysis was carried out according to the retention time， and external standard method was used for accurate quantification. At the same time， the linear range， detection limit， quantitative limit， precision and recovery rate of the standard curve of the method were verified.Result： When the concentration of 4-hexylresorcinol is in the range of 0.02～2.00 mg·L-1， the linear relationship is good. The detection limit， quantitative limit， precision and recovery rate of the method can meet the requirements of national standard method. Conclusion： The laboratory of Shenyang Food and Drug Inspection Institute has the ability to determine the residual amount of 4-hexylresorcinol in food.

Keywords： high performance liquid chromatography; food; 4-hexylresorcinol; method verification

4-己基間苯二酚是一種新型抗氧化劑，能夠抑制褐變，其本身為黃白色、白色針狀結(jié)晶，如遇空氣、光則變成淡棕粉紅色，有強(qiáng)澀味，弱臭，可使舌頭產(chǎn)生麻木感，微溶于甲醇、植物油、乙醇、氯仿、水及苯等物質(zhì)[1-3]。4-己基間苯二酚是一種水產(chǎn)品類的加工助劑，能夠有效抑制蝦類產(chǎn)品機(jī)體中的多酚氧化酶的活性，可在貯存過程中保持蟹類、蝦類等甲殼水產(chǎn)品不產(chǎn)生褐變，色澤較好[4-6]。原國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會于2014年12月24日發(fā)布的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）規(guī)定，4-己基間苯二酚為我國合法的食品添加劑，可作為抗氧化劑應(yīng)用在蝦類鮮水產(chǎn)的食品中，要求按生產(chǎn)需要適量使用，食品中殘留量應(yīng)≤1 mg·kg-1。

在國民經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展的時代，人們對健康更加重視，對水產(chǎn)品的營養(yǎng)成分、口感、鮮嫩程度要求越來越高。因此，4-己基間苯二酚作為一種可應(yīng)用于蝦類鮮水產(chǎn)中的抗氧化劑備受關(guān)注[7-9]。目前，食品中4-己基間苯二酚殘留量的檢測方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法以及氣相色譜-質(zhì)譜法[10]。采用高效液相色譜分離，熒光檢測器檢測的方法可準(zhǔn)確快速地對4-己基間苯二酚進(jìn)行定性定量分析，此方法已被廣泛應(yīng)用于鮮水產(chǎn)蝦和螃蟹中4-己基間苯二酚殘留量的測定中。

本文根據(jù)實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)認(rèn)定的相關(guān)要求，在使用檢驗(yàn)方法前對食品中4-己基間苯二酚殘留量進(jìn)行方法驗(yàn)證，從而保證本實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境條件、儀器設(shè)備、人員能力和試劑耗材能夠滿足《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中4-己基間苯二酚殘留量的測定》

（GB 5009.280—2020）方法的要求。本次驗(yàn)證的內(nèi)容主要包括標(biāo)準(zhǔn)品、儀器設(shè)備、試劑耗材等是否滿足要求，方法檢出限、定量限、標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍、精密度和回收率是否滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦：市售；乙腈：色譜純，美國Fisher公司；甲醇：色譜純，美國Fisher公司；乙酸乙酯：色譜純，國藥集團(tuán)；正己烷：色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；無水硫酸鈉：分析純，天津市博迪化工有限公司；實(shí)驗(yàn)用水：均為GB/T 6682—2008規(guī)定的超純水；4-己基間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度為98.8%，F(xiàn)irst standard。

1.2 主要設(shè)備和儀器

Waters e2695高效液相色譜儀，配2475FlR檢測器，美國Waters公司；QUINTIX213-1CN電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；KQ-250DB超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DMV-16多試管渦旋混合器，廣東省科寅公司；H1750R醫(yī)用離心機(jī)，長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

取代表性樣品的可食部分約500 g，經(jīng)組織搗碎機(jī)粉碎混勻后，裝入潔凈的容器中作為試樣，密封并做好標(biāo)識，試樣于-18 ℃保存。

1.3.2 樣品前處理

（1）提取。準(zhǔn)確稱取2.00 g制備好的樣品于

50 mL離心管中，加入乙酸乙酯20 mL，無水硫酸鈉3 g，均質(zhì)30 s，然后離心3 min，將上清液全部轉(zhuǎn)移到100 mL濃縮瓶中，在剩余的殘?jiān)屑尤?0 mL乙酸乙酯，重復(fù)上述流程，進(jìn)行均質(zhì)，離心，合并兩次上清液于同一個濃縮瓶之中，在35 ℃水浴中蒸發(fā)至近干。

（2）凈化。在提取好的殘?jiān)屑尤? mL甲醇-乙腈-水（1∶2∶1）混合溶液進(jìn)行復(fù)溶，然后進(jìn)行10 s超聲、30 s渦旋，使殘?jiān)咳芙?，再加入乙腈飽和正己烷溶? mL，渦旋后轉(zhuǎn)移至離心管中，離心3 min，棄去正己烷層后，再次向離心管中加入2 mL乙腈飽和正己烷溶液，先進(jìn)行30 s渦旋，然后離心，棄去上層正己烷，吸取下層溶液經(jīng)0.45 μm有機(jī)膜過濾后待測。

1.3.3 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 mg·L-1）：稱取10 mg（精確到0.01 mg）4-己基間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，置于100 mL容量瓶中，使用甲醇進(jìn)行溶解，然后定容至刻度線，混合均勻。

標(biāo)準(zhǔn)中間液（10 mg·L-1）：吸取1.00 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL容量瓶中，用甲醇進(jìn)行稀釋、定容。

標(biāo)準(zhǔn)系列工作液：分別吸取0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL標(biāo)準(zhǔn)中間液，置于10 mL容量瓶中，用甲醇-乙腈-水（1∶2∶1）混合溶液定容至10 mL，得到濃度分別為0.02 mg·L-1、0.05 mg·L-1、0.10 mg·L-1、0.50 mg·L-1、1.00 mg·L-1及2.00 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

1.3.4 儀器條件

色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈∶水=65∶35（體積比）；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長310 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及其相關(guān)要求

按照標(biāo)準(zhǔn)的儀器條件將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別注入液相色譜儀中進(jìn)行測試分析，4-己基間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖如圖1所示。由圖1可知，采用反相液相色譜-熒光檢測器測定4-己基間苯二酚，所得色譜峰兩邊對稱，無拖尾，不分叉，較為理想。

4-己基間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)系列工作液得到的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線如圖2所示。由圖2可知，4-己基間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)校正曲線線性方程為Y=1.85×106X-9.46×103，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 136，滿足《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）的要求（R2≥0.99）。因此，當(dāng)4-己基間苯二酚濃度為0.20～2.00 mg·L-1時，線性關(guān)系良好。

2.2 方法檢出限

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)《合格評定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》（GB/T 27417—2017）中“信噪比法評估LOD”的方法對方法檢出限進(jìn)行測定，以檢出限（0.020 0 mg·kg-1）水平進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，10次平行測定結(jié)果分別為0.021 0 mg·kg-1、0.024 0 mg·kg-1、0.023 0 mg·kg-1、0.025 0 mg·kg-1、0.023 0 mg·kg-1、0.022 0 mg·kg-1、0.025 0 mg·kg-1、0.021 0 mg·kg-1、0.023 0 mg·kg-1及0.024 0 mg·kg-1，平均值為0.023 0 mg·kg-1，信噪比（s/n）均大于3。

2.3 方法定量限

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)《合格評定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》（GB/T 27417—2017）中“信噪比法評估LOD”的方法對方法定量限進(jìn)行測定，以定量限（0.050 0 mg·kg-1）水平進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，10次平行測定結(jié)果分別為0.052 0 mg·kg-1、0.051 0 mg·kg-1、0.050 0 mg·kg-1、0.050 0 mg·kg-1、0.053 0 mg·kg-1、0.051 0 mg·kg-1、0.052 0 mg·kg-1、0.050 0 mg·kg-1、0.053 0 mg·kg-1及0.051 0 mg·kg-1，平均值為0.051 3 mg·kg-1，信噪比（s/n）均大于10。

2.4 精密度

根據(jù)《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）的要求，選取一種陽性樣品進(jìn)行3水平6平行精密度試驗(yàn)。本研究選取選取低（0.050 0 mg·kg-1）、中（0.100 0 mg·kg-1）、高（0.500 0 mg·kg-1）3種濃度的樣品分別進(jìn)行6次平行試驗(yàn)。低、中、高三水平下的精密度分別為1.02%、2.88%、1.15%，均滿足GB/T 27404—2008對于精密度的要求。

2.5 加標(biāo)回收率

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404—2008相關(guān)要求，以空白蝦為樣品進(jìn)行3水平加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，不同加標(biāo)濃度下的加標(biāo)回收率如表1所示。由表1可知，低濃度（0.050 0 mg·kg-1）下的加標(biāo)回收率為101.4%，中濃度（0.100 0 mg·kg-1）下的加標(biāo)回收率為96.8%，高濃度（0.500 0 mg·kg-1）下的加標(biāo)回收率為85.0%，均滿足GB/T 27404—2008對于加標(biāo)回收率的要求。

3 結(jié)論

在現(xiàn)有的儀器和設(shè)備條件下，對本實(shí)驗(yàn)室檢測食品中4-己基間苯二酚殘留量的能力進(jìn)行驗(yàn)證，分別對標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍、檢出限、定量限、精密度和回收率進(jìn)行分析實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，4-己基間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)校正曲線線性方程為Y=1.85×106X-9.46×103，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 136，符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404—2008的要求（R2≥0.99）；檢出限為0.023 0 mg·kg-1，且樣品峰高均能到達(dá)基線噪音的3倍，滿足GB 5009.280—2020中檢出限0.020 0 mg·kg-1的要求；定量限為0.051 3 mg·kg-1，且樣品峰高均能達(dá)到基線噪音的10倍，滿足GB 5009.280—2020中定量限0.050 0 mg·kg-1的要求；低、中、高三水平下的精密度分別為1.02%、2.88%、1.15%，滿足GB/T 27404—2008對于精密度的要求；低、中、高三水平下的加標(biāo)回收率分別為101.4%、96.8%、85.0%，滿足GB/T 27404—2008對于加標(biāo)回收率的要求。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)室檢測食品中4-己基間苯二酚殘留量的能力可以滿足GB 5009.280—2020的要求。

參考文獻(xiàn)

[1]蘆江會，王小寶，張書芬，等.高效液相色譜法測定鮮蝦中4-己基間苯二酚殘留量的不確定度分析[J].中國食品添加劑，2019，30（6）：128-134.

[2]MENDES R，PESTANA J，PESTANA C.Changes in 4-hexylresorcinol residues during processing of deepwater pink shrimp（Parapenaeus longirostris）[J].European Food Research and Technology，2006，223（4）：509-515.

[3]錢韻芳，楊勝平，謝晶.4-己基間苯二酚對凡納濱對蝦3種腐敗菌的抑菌活性及蝦品質(zhì)的影響[J].食品科學(xué)，2017，38（21）：21-29.

[4]施進(jìn)，胡興娟，章偉鋒，等.分光光度法測定海捕蝦中4-己基間苯二酚[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)，2023，14（15）：85-92.

[5]GUPTA S，SOOD M，GUPTA N，et al.Food browning，its type and controlling measures：a review article[J].Chemical Science Review and Letters，2022，11（44）：417-424.

[6]RASANE P，SINGH J，KAUR S，et al.Strategic advances in the management of browning in fruits and vegetables[J].Food and Bioprocess Technology，2023，1：1-26.

[7]高學(xué)慧，郝云彬，張小軍，等.超高效液相色譜法測定水產(chǎn)品保鮮劑中4-己基間苯二酚的含量[J].浙江海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，36（6）：511-515.

[8]孫凱峰，周陶憶，顧蓓麗.蝦中4-己基間苯二酚的檢測技術(shù)研究[J].現(xiàn)代食品科技，2010，26（3）：326-330.

[9]YU Q，LIU J，YANG J，et al.Postharvest preservation technologies for marine-capture shrimp：a review[J].Food and Bioprocess Technology，2023，16：2343-2358.

[10]段小娟，蔡發(fā)，牟志春，等.高效液相色譜熒光檢測法測定蝦中的4-己基間苯二酚[J].食品科學(xué)，2009，30（14）：238-239.

作者簡介：王韻（1987—），女，山東萊州人，碩士，工程師。研究方向：食品檢測與分析。