吳 凡，范紹輝，何國良，梁思宇，徐 巖，唐 柯*

(1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇無錫 214000；2.廣東石灣酒廠集團有限公司，廣東佛山 528031；3.石灣清雅型酒研究院，廣東佛山 528031)

白酒是中國特有的一種蒸餾酒，在世界蒸餾酒市場具有重要地位[1]。由于原料、工藝以及陳釀等條件的差異，中國白酒的香型具有多種多樣的特點。清雅型石灣玉冰燒白酒以大米為原料，經(jīng)過小曲（摘取野生菌種，添加甘草、茴香、肉桂葉等中草藥）糖化發(fā)酵、釜式蒸餾、山洞陳釀等釀造環(huán)節(jié)而成[2]。獨有的釀造工藝構(gòu)成了清雅型石灣玉冰燒“清、雅、醇、綿”的感官特點，香氣清雅協(xié)調(diào)，口味怡暢，風格自成一派[2]，與傳統(tǒng)的“白酒十二香型”具有較為明顯的差異。

白酒中的揮發(fā)性香氣成分僅占總量的2%，但含量和比例對白酒的香型、品質(zhì)具有關(guān)鍵作用，在很大程度上影響消費者的選擇[3]。不斷嘗試使用更為靈敏精確的檢測手段對微量香氣活性化合物進行捕捉鑒定，是現(xiàn)代解析白酒風格特征的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對白酒品質(zhì)把控具有重要意義。近年來，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法被廣泛應(yīng)用于白酒香氣的鑒定，為白酒香氣品質(zhì)的把控提供了更為直觀的數(shù)據(jù)支撐[4]。然而，白酒中包含的揮發(fā)性化合物累計報道超過2000 種，一維氣相色譜質(zhì)譜法的峰容量漸漸不能滿足白酒更為復(fù)雜的分析要求，因此分離度更高的二維氣相色譜質(zhì)譜法越來越受到科研人員的關(guān)注。二維氣相色譜使用兩根極性不同的氣相色譜柱，采用連續(xù)調(diào)制的方式，可一次性實現(xiàn)上千個物質(zhì)的分離，具有高分辨率、高靈敏度、高峰容量等優(yōu)勢[5]。飛行時間質(zhì)譜在掃描范圍、靈敏度和分析速度方面比傳統(tǒng)檢測器性能更佳。近年來，二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜（GC×GC-TOFMS）廣泛應(yīng)用于白酒風味的研究中，如季克良等[6]利用GC×GC-TOFMS 解析了濃香型、醬香型和清香型白酒的重要揮發(fā)性物質(zhì)。隨后，研究人員運用GC×GCTOFMS 陸續(xù)分析了劍南春、古井貢酒、瀘州老窖等白酒的揮發(fā)性組分[7-9]。近年來，全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)也被應(yīng)用到痕量物質(zhì)的專一檢測和對白酒等級品質(zhì)特征物質(zhì)的鑒定中[10-12]。此外，感官分析是香氣表征另外一個重要手段。定量描述分析（quantitative descriptive analysis,QDA）是一種采用線性標尺對感官屬性進行強度表征的感官實驗方法，可以同時評估多種樣品的感官屬性強度，結(jié)果直觀。由于其感官實驗結(jié)果的客觀性和可控性，被廣泛應(yīng)用于酒類的感官風味研究中[13-14]。如陸佳玲等[15]使用定量描述分析實驗研究了清香型白酒在梯度稀釋過程中的香氣屬性強度變化，解析了清香型白酒降度后風味變化規(guī)律。

目前關(guān)于清雅型石灣玉冰燒白酒風味的研究剛剛開展[2]，其香氣的物質(zhì)基礎(chǔ)和整體感官特征尚不清晰。因此，本研究采用GC×GC-TOFMS 全面定性清雅型石灣玉冰燒酒中的揮發(fā)性化合物，進一步通過香氣數(shù)據(jù)庫明確具有香氣特征的化合物，初步構(gòu)建清雅型石灣白酒的風味信息庫；最后結(jié)合定量描述分析法，明確清雅型石灣玉冰燒白酒的感官香氣特征，為清雅型石灣白酒香氣的深入研究及生產(chǎn)調(diào)控提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 樣品

實驗使用的樣品是清雅型石灣玉冰燒洞藏9成品酒（40 %vol），由廣東石灣酒廠集團有限公司提供。

1.1.2 試劑及耗材

無水乙醇（色譜純，上海安譜科學(xué)儀器公司），二氯甲烷（色譜級，美國Sigma-Aldrich 公司），無水硫酸鈉（分析純，上海國藥集團），氯化鈉（分析純，上海國藥集團）。

1.1.3 儀器設(shè)備

頂空固相微萃取多功能自動進樣系統(tǒng)（MPS2），德國Gerstel 公司；全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀（GC×GC-TOFMS，Pegasus 4D），美國LECO 公司；7890B 氣相色譜儀，美國安捷倫公司；玻璃色譜柱（30 cm×1.5 cm）；DC-12 氮吹儀，上海安譜實驗科技股份有限公司；超純水儀Mili-Q，美國密理博公司；超聲波清洗儀SB-25-12D，寧波新芝生物科技股份有限公司；電子天平，Mettler-Toledo 公司；電熱鼓風干燥箱，上海恒科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋DK-S24 型，上海森信實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 定量描述分析

參照國際標準ISO 8586—2012 對品評員進行篩選和培訓(xùn)。通過問卷問詢和香氣味覺測試，從江南大學(xué)生物工程學(xué)院學(xué)生中篩選12 位無感官缺陷，無不良嗜好，年齡在18～25 歲之間的品評員（5男，7 女）。對感官品評員進行為期一個月的感官培訓(xùn)，每周三次，每次時長1小時。

參考樣選擇：通過感官品評小組的集體討論，選定了油質(zhì)、植物、烘焙、甜香、果香、花香、米香、酸香八種感官屬性詞。依據(jù)實際香氣特點，選擇合適的香氣參照樣品，對感官品評員進行香氣屬性及強度的培訓(xùn)，具體香氣參照樣品如表1所示。

表1 香氣屬性的定義及參照

正式感官實驗時，將15 mL 酒樣倒入50 mL 品評杯中，遞交給感官品評員，使用0～9 分打分標準對清雅型石灣玉冰燒白酒進行香氣強度打分。

1.2.2 全二維氣相色譜儀飛行時間質(zhì)譜

1.2.2.1 前處理

（1）頂空固相微萃取。參考文獻[16]并略作改進，將酒樣酒精度加超純水稀釋至10 %（體積分數(shù)），振蕩混勻。向20 mL 頂空瓶中依次加入1.5 g NaCl，5 mL 稀釋后的酒樣，用帶有PTEE 藍色硅膠隔墊的空心磁性金屬蓋密，之后采用MSP 2 進行頂空固相微萃取。50 ℃條件下樣品平衡5 min，接著萃取45 min，結(jié)束后在GC 進樣口解吸附5 min，進行全二維氣相色譜飛行時間質(zhì)譜的程序，條件不變運行平行樣品3次。

（2）液液萃取。參考文獻方法[17]并略作改進，向分液漏斗分別加入50 mL 酒樣、200 mL 飽和食鹽水以及150 mL（分三次萃?。┒燃淄椋ㄉV級），充分震蕩5 min，取有機相。有機相中加入足量無水硫酸鈉振蕩除水后，放到-20 ℃冰箱中過夜，氮吹濃縮至500 μ L。

1.2.2.2 全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜條件[18]

二維氣相色譜設(shè)置條件：進樣口溫度250 ℃，進樣模式為1∶1 分流進樣。樣品以恒流模式運行，使用純度大于99.9995%的氦氣作為載氣，設(shè)置氦氣流速為1 mL/min。一維柱溫箱升溫程序：起始溫度45 ℃，維持3 min 后，以4 ℃/min 升溫至150 ℃，保持2 min；以6 ℃/min 升溫至200 ℃；接著以10 ℃/min 升溫至230 ℃并保持10 min。在整個過程中，二維烘箱的溫度比一維烘箱高5 ℃，調(diào)制補償溫度為20 ℃。熱脈沖時間為0.8 s，調(diào)制周期為4 s。

飛行時間質(zhì)譜設(shè)置條件：無溶劑延遲。采用EI電離源，離子源電壓設(shè)置為70 eV，傳輸線溫度為240 ℃，離子源溫度為230 ℃，檢測器電壓設(shè)置為1430 V。采集質(zhì)量數(shù)范圍為35～400 amu，采集頻率為100 spectra/s。二維數(shù)據(jù)由LECO 公司ChromaTOF?工作站采集。

1.2.2.3 定性方法

使用儀器自帶的ChromaTOF? 4.61.1.0 software（LECO Corporation）軟件對采集的數(shù)據(jù)進行解析。一維保留時間偏差設(shè)置為12 s，二維保留時間偏差設(shè)置為0.2 s。自動識別信噪比大于200 的色譜峰，并自動解卷積和質(zhì)譜庫（NIST 2014）進行比對。從結(jié)果中選擇相似度大于700 的化合物組分，刪除柱流失過程中產(chǎn)生的化合物（含Si、金屬元素），去除含鹵族元素的化合物。在相同的色譜條件下，通過正構(gòu)烷烴（C7—C30）來計算化合物的保留指數(shù)（retention index,RI），與前人研究中報道的進行比對，保留指數(shù)RI 相差50 以內(nèi)的化合物作為定性結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 清雅型石灣玉冰燒白酒的物質(zhì)特征

由于白酒中含有的揮發(fā)性化合物超過2000種，這些物質(zhì)具有不同的熱穩(wěn)定性、極性、溶解性、揮發(fā)性等性質(zhì)，因此使用單一的前處理方式不能滿足所有物質(zhì)的提取[18]。為了更加系統(tǒng)地了解清雅型石灣玉冰燒中的揮發(fā)性化合物，本實驗采用頂空相微萃?。℉eadspace Solid-Phase Microextraction，HS-SPME）和液液萃?。↙iquid-Liquid Extraction，LLE）兩種樣品前處理方式，全面分析清雅型石灣玉冰燒酒中的揮發(fā)性化合物。

結(jié)果如表2 所示，采用HS-SPME 前處理，從清雅型石灣玉冰燒洞藏9 鑒定出270 種揮發(fā)性化合物，采用LLE 前處理方式，鑒定到234 種揮發(fā)性化合物。其中，有134 種化合物使用兩種進樣方式都可以檢測到，有136 種物質(zhì)僅能通過HS-SPME 進樣檢測到，有100 種物質(zhì)僅能通過LLE 進樣方式檢測到。匯總兩種前處理方式的定性結(jié)果，最終從清雅型石灣玉冰燒洞藏9 中鑒定出370 種揮發(fā)性化合物，使用多種前處理方式相結(jié)合可以更加全面地得到清雅型石灣玉冰燒白酒的潛在香氣化合物。從檢測結(jié)果上看，萜類、含氮類化合物以及芳香族化合物三類化合物對于某一類前處理方式的偏好明顯。萜類化合物偏好HS-SPME 前處理方式，這可能與此類物質(zhì)濃度低且不適用本研究中使用的萃取溶劑有關(guān)；含氮類化合物是一類在酒精飲料中含量低、香氣影響大的化合物，在檢測中僅有2 種含氮化合物是由HS-SPME 進樣獲得，其他13 種均由LLE 進樣檢測得到，這說明含氮類化合物更適用于有機溶劑萃取進樣方法；芳香族化合物是一類含有苯環(huán)的香氣物質(zhì)，是香氣研究中一類重要的化合物，共有15 種芳香族化合物是由HS-SPME 進樣獲取的，這可能和LLE選擇的溶劑極性以及萃取過程中香氣物質(zhì)損失過大有關(guān)。

表2 HS-SPME和LLE定性揮發(fā)性化合物分類表

并不是所有揮發(fā)性化合物都具有香氣特征，食品研究更加關(guān)注具有香氣特征的香氣化合物，因此通過檢索文獻與Flavornet、Flavor DB 等香氣數(shù)據(jù)庫進行比對[19]，最終從已經(jīng)鑒定到的370 種揮發(fā)性化合物中篩選出245 種具有香氣特征的化合物。其中包含酯類化合物68種，醇類化合物41種，醛類化合物34 種，酮類化合物17 種，酸類化合物12 種，醚類化合物2 種，萜類化合物（包括萜烯類，萜類衍生物）26 種，呋喃類化合物（呋喃類等）11 種，含氮類化合物（吡嗪類等）6 種，含硫類化合物4 種，酚類化合物4 種，內(nèi)酯類化合物6 種、芳香族化合物9 種和其他類化合物5種（圖1）。

圖1 清雅型石灣玉冰燒白酒潛在香氣化合物分類圖

將潛在香氣化合物根據(jù)其化合物結(jié)構(gòu)和香氣屬性進行分類，繪制清雅型石灣玉冰燒的香氣化合物分類圖（圖2）。由圖2 可知，篩選出的香氣化合物根據(jù)香氣屬性大致可以分成果香、花香、植物香、油脂香、烘焙香、香料等，清雅型石灣玉冰燒白酒的整體香氣風格是由多種香氣屬性的化合物構(gòu)成的。

圖2 清雅型石灣玉冰燒白酒香氣化合物分類及部分化合物結(jié)構(gòu)圖

在這245 種化合物中，酯類、醇類、醛酮類化合物的種類占比最多，這一結(jié)果與其他香型白酒的研究結(jié)果相同[20]。在以往的白酒香氣研究中[21]，酯類物質(zhì)對于整體香氣輪廓具有重要的貢獻。從清雅型石灣玉冰燒中檢測到的酯類香氣化合物的數(shù)量最多，其中半數(shù)為乙酯類物質(zhì)，香氣屬性上多呈現(xiàn)愉悅的水果、花卉、甜等香氣，極有可能對清雅型石灣玉冰燒白酒的整體香氣具有重要影響。另外，檢測到二元酸二乙酯類物質(zhì)10 種，其中辛二酸二乙酯、庚二酸二乙酯、壬二酸二乙酯是國家標準《豉香型白酒》規(guī)定例行檢驗的指標之一[22]。醇類化合物數(shù)量在清雅型石灣玉冰燒白酒中也較多，且多數(shù)為飽和脂肪醇，常為酒體貢獻花香、果香等風味，另外檢測到烯醇類物質(zhì)12 種，表現(xiàn)為青草、油脂、花卉等香氣。醛類化合物中檢測出不飽和烯醛14 種，這些烯醛的香氣表現(xiàn)為青草、堅果、油脂等，可能是構(gòu)成清雅型石灣玉冰燒白酒中油質(zhì)香氣的重要組分。Fan 等[23]發(fā)現(xiàn)反-2-辛烯醛、反-2-壬烯醛、反-2-癸烯醛、反-2-十一烯醛和反-2,4-癸二烯醛是傳統(tǒng)豉香型白酒中具有油脂風味的關(guān)鍵香氣物質(zhì)。在清雅型石灣玉冰燒白酒中，酸類物質(zhì)的數(shù)量有17 種，且往往呈現(xiàn)汗臭、酸臭、奶酪等不愉悅的香氣，但是這些酸卻是酒精飲料中不可或缺的協(xié)調(diào)成分和呈味物質(zhì)。呋喃類化合物具有低閾值、香氣獨特的香氣特點，是許多天然食品的重要香氣特征物質(zhì)。在清雅型石灣玉冰燒白酒中檢測到了較多的呋喃類化合物，表現(xiàn)為焦糖、堅果等香氣特點。其中苯丙呋喃、2(5H)-呋喃酮被研究證明具有抗菌殺菌及抗炎抗癌等生理功效[24-25]。吡嗪類物質(zhì)是白酒中一類具有強烈堅果、焦香、烘焙氣味的香氣化合物，同時具有多種生理健康功效。例如，檢測到的2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪[26-27]均被研究證明具有抗氧化性，2,3,5,6-四甲基吡嗪也是一種具有藥用功效的中藥生物堿，其生理功效備受醫(yī)學(xué)界關(guān)注[28]。檢測到的內(nèi)酯類化合物共11 種，主要表現(xiàn)為奶油、果香、堅果等濃烈的愉悅香氣。從清雅型石灣玉冰燒白酒中還檢測到了大量的萜類化合物，其香氣貢獻以草本、木質(zhì)、花香為主。清雅型玉冰燒白酒在制曲過程中加入了甘草、茴香、肉桂葉等多種中草藥，在先前的研究中，何張?zhí)m等[29]通過對肉桂葉原料的揮發(fā)性香氣化合物進行分析，發(fā)現(xiàn)其中含有多種萜類化合物。因此清雅型石灣玉冰燒白酒中檢測到的大量萜類化合物可能部分來源于酒曲中加入的中草藥。萜類化合物的閾值低、香氣愉悅且強度大，對清雅型石灣玉冰燒酒的整體香氣特征也具有重要影響。除了香氣貢獻外，許多萜類物質(zhì)也被證明具有多種生理功效，如4-萜烯醇、茴香腦、β-桉葉油醇等萜類化合物具有鎮(zhèn)痛、抗菌、抗氧化[30-31]等生理效果。

2.2 清雅型石灣玉冰燒的感官特征

2.2.1 感官數(shù)據(jù)有效性檢測

采用R 語言對感官小組進行的QDA 實驗結(jié)果進行可靠性和有效性檢測（表3）。表3 中，灰色區(qū)域的數(shù)值表示該項內(nèi)容具有顯著差異性（P＜0.05）。樣品之間不同屬性之間均具有顯著差異，即感官品評員能夠很好的區(qū)別出不同樣品之間相同屬性的強度差異。除了酸香和烘焙香氣外，品評員和樣品x 品評員對其他屬性的香氣強度評價并無明顯差異，這說明感官品評員在香氣屬性強度上具有較為一致的評價，對同一樣品香氣屬性強弱的感知也基本相同。重復(fù)，樣品x 重復(fù)和品評員x 重復(fù)中均未出現(xiàn)顯著差異值，這說明感官實驗結(jié)果數(shù)據(jù)具有很好的重復(fù)性。因此，以上結(jié)果可以判斷感官實驗結(jié)果數(shù)據(jù)可靠且有效。

表3 R語言檢驗感官數(shù)據(jù)的有效性

在前期的描述詞選擇中，出現(xiàn)頻率最高的8 個詞作為正式感官實驗的描述詞，分別為油質(zhì)、植物、花香、烘焙、果香、甜香、酸香和米香。根據(jù)感官品評員對樣品各香氣屬性的打分，繪制出清雅型石灣玉冰燒白酒的香氣輪廓圖（圖3）。通過全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜的鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，清雅型石灣玉冰燒酒中含31 種具有香氣屬性的醛類化合物。QDA 實驗結(jié)果中，油質(zhì)屬性香氣得分最高，結(jié)合全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜定性出的物質(zhì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多種醛類化合物可能是造成其油質(zhì)類香氣的重要物質(zhì)，烯醛類化合物在豉香型白酒研究中被證明在脂肪類香氣上具有重要作用[23]。植物香氣和花香也是清雅型石灣玉冰燒白酒香氣輪廓的重要組成，造成這一類香氣的化合物包括醇類、飽和脂肪醛類、萜類化合物。在前期分析中可發(fā)現(xiàn)，清雅型石灣玉冰燒白酒中含有較多的萜類化合物，此類化合物的閾值低、香氣強度大，可能是構(gòu)成其植物香氣的重要組分。烘焙香氣在清雅型石灣玉冰燒白酒整體香氣中也占了較為重要的一部分。在化合物定性過程中發(fā)現(xiàn)的較多呋喃類、吡嗪類化合物在食品中常常表現(xiàn)為烘焙、堅果等香氣，這對酒體中烘焙香味具有重要影響。在前期檢測出的多種類化合物中均存在甜味屬性，因此，構(gòu)成清雅型石灣玉冰燒中甜味感官的化合物類型暫時無法確定。由于清雅型石灣玉冰燒白酒的主要原料是大米和糯米，因此清雅型石灣玉冰燒白酒中與經(jīng)典米香型白酒具有相同的米香香氣。目前針對米香型白酒的米香構(gòu)成仍未有準確定論，研究人員猜測是由乙酸苯乙酯、苯乙醇等具有蜂蜜香氣的香氣化合物形成。酯類物質(zhì)是構(gòu)成果香的代表性物質(zhì)，在多種香型白酒的研究中，酯類都被認為是造成果香感官的主要化合物。二維檢測中，酯類物質(zhì)是清雅型石灣玉冰燒酒中鑒定出的種類最多的物質(zhì)。但是在QDA 實驗的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，果香屬性雖存在，但是強度較低，因此可以推測，清雅型石灣玉冰燒白酒中的酯類物質(zhì)濃度可能較低，造成了香氣構(gòu)成中果香屬性強度較低的結(jié)果。

圖3 清雅型石灣玉冰燒白酒感官評價雷達圖

3 結(jié)論

采用全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)，從清雅型石灣玉冰燒白酒中檢測到了370 種揮發(fā)性化合物，進一步確定了245 種具有香氣屬性的化合物，初步構(gòu)建了清雅型石灣玉冰燒酒的香氣信息庫。篩選出具有香氣屬性的揮發(fā)性化合物數(shù)量最多的是酯類，其次是醇類、醛類、萜類以及酮類化合物。結(jié)合QDA 實驗，確定了清雅型石灣玉冰燒白酒的整體香氣輪廓主要由油質(zhì)香、植物香、花香、烘焙香、甜香、米香、酸香構(gòu)成，而這些屬性的產(chǎn)生也與檢測出的化合物的種類數(shù)量和香氣屬性特點大致相符。通過對清雅型石灣玉冰燒白酒化合物的分析和重要感官屬性的確定，為今后深入研究清雅型石灣白酒香氣提供了更多數(shù)據(jù)支持。