蘭 童,雍紹文,王金山,羅曉峰,錢 江,劉 成,*,陳 衛(wèi)

(1.河海大學淺水湖泊綜合治理與資源開發(fā)教育部重點實驗室,江蘇南京 210098;2.河海大學環(huán)境學院,江蘇南京 210098;3.寧夏水投銀川水務有限公司,寧夏銀川 750201)

1982 年,Xu 等[1]首次發(fā)現(xiàn)并提出了細菌的“活的非可培養(yǎng)” 狀態(tài)(viable but non-culturable,VBNC),明確了其基本概念:細菌在不良外界環(huán)境中,無法在常規(guī)固體培養(yǎng)基上生長繁殖形成菌落,但仍然具有代謝活性的一種特殊休眠狀態(tài),在合適條件下可以復蘇并恢復可培養(yǎng)性[2]。

VBNC 狀態(tài)的存在影響了基于細胞可培養(yǎng)性的傳統(tǒng)檢測方法的準確性,易導致微生物泄漏問題。包秋華等[3]通過研究1994 年—2021 年Web of Science 數(shù)據(jù)庫中836 篇關于VBNC 的文獻發(fā)現(xiàn),細菌VBNC 研究方向主要集中在微生物學、傳染病學、生物化學分子生物學等領域,高頻關鍵詞也反映了目前的研究熱點包括檢測手段、誘導條件、形成機制等方面,具體如圖1 所示。 目前對于飲用水過程中細菌的VBNC 狀態(tài)研究相對較少,部分研究結果表明一些致病菌能夠在飲用水處理過程中呈現(xiàn)VBNC狀態(tài),并在輸配水環(huán)節(jié)復蘇,恢復致病性,威脅飲用水安全。 然而人們對該轉變過程的影響因素和作用機制尚不明確。

圖1 VBNC 細菌研究方向和高頻關鍵詞[3]Fig.1 Research Directions and High Frequency Keywords of VBNC Bacterial[3]

因此,本文從VBNC 狀態(tài)水源性致病菌種類、生物學特性變化、檢測技術的發(fā)展以及誘導因素對目前細菌VBNC 狀態(tài)的研究進行論述,并結合飲用水處理過程中的工藝環(huán)節(jié)和水質(zhì)條件,分析細菌VBNC 狀態(tài)的形成和復蘇機制,重點探討了臭氧-生物活性炭(O3-BAC)單元對細菌實現(xiàn)VBNC 狀態(tài)轉變的影響。 論文內(nèi)容可為有效控制飲用水中VBNC 狀態(tài)致病菌、保障飲用水供水安全提供一定的參考。

1 飲用水中VBNC 狀態(tài)細菌涉及的種類和生物學特征

1.1 飲用水中VBNC 狀態(tài)細菌涉及的種類

迄今國內(nèi)外已陸續(xù)報道100 余種微生物能夠在某些不利的環(huán)境條件下誘導進入VBNC 狀態(tài),包括多種細菌類群和部分真菌,細菌又分為致病菌和非致病菌。 其中,常見的水源性致病菌種類如表1[4-6]所示,大多數(shù)為革蘭氏陰性菌(G-),以變形菌門γ-變形菌綱細菌為主(11 屬20 種),其余則屬于α-變形菌綱(1 屬1 種)、β-變形菌綱(1屬1 種)、ε-變形菌綱(1 屬1 種)和擬桿菌門(1屬1 種);僅有少量細菌為革蘭氏陽性菌(G+),分別屬于厚壁菌門(4 屬4 種)和放線菌門(2 屬2種)。

表1 飲用水中部分已報道可進入VBNC 狀態(tài)的致病菌種類Tab.1 Some Pathogenic Bacteria in Drinking Water Reportedly Entering into VBNC State

1.2 飲用水中VBNC 狀態(tài)細菌的生物學特征

進入VBNC 狀態(tài)的細菌,它的多種生物學特征均會發(fā)生較明顯變化,主要表現(xiàn)在細胞形態(tài)、代謝活性、抗性與致病性等方面。

細胞形態(tài):細胞形態(tài)的變化是不同菌體應對環(huán)境變化的一種自我保護現(xiàn)象。 大多數(shù)細菌進入VBNC 狀態(tài)后,細胞體積變小,桿狀和弧狀細菌通常會變?yōu)榍驐U狀或球狀[7];而有些處于VBNC 狀態(tài)的G+,如糞腸球菌[8]的細胞形態(tài)則會變大并稍微伸長。

代謝活性:VBNC 狀態(tài)的細菌能夠保持較低的代謝活性。 利用5-氰基-2,3-二甲苯基四氮唑(CTC)染色結合流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)VBNC 狀態(tài)下的大腸桿菌仍然保持呼吸活性,但較可培養(yǎng)細胞降低了約50%[9]。 同樣地,金黃色葡萄球菌進入VBNC 狀態(tài)后,與代謝相關的基因明顯下調(diào)、代謝活性受到抑制[10]。

抗性:一般情況下,處于VBNC 狀態(tài)的細菌細胞代謝活性減弱、分裂增殖能力下降,對外界脅迫因子的抗性增強。 VBNC 狀態(tài)的副溶血性弧菌對高溫(42、47 ℃)、低滲透壓(0.9% NaCl)和高濃度酸(pH 值=4.0)應激條件的抗性增強[11];VBNC 狀態(tài)的大腸桿菌對氨芐西林、慶大霉素、多黏菌素、環(huán)丙沙星等9 種典型抗生素也表現(xiàn)出良好的耐受性[12]。

致病性:VBNC 狀態(tài)致病菌能夠直接表達毒力因子或保留致病潛力,復蘇后恢復致病性,對水質(zhì)安全和人類健康造成潛在危害。 利用實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術檢測發(fā)現(xiàn),進入VBNC 狀態(tài)的副溶血性弧菌可以表達毒力基因tdh2[13];然而哈維氏弧菌的毒力基因表達檢測結果顯示,VBNC 狀態(tài)細胞中未檢測到溶血毒素基因的表達,但復蘇細胞仍能導致斑馬魚的死亡,說明復蘇后該細菌的致病性也隨之恢復[14]。

2 VBNC 狀態(tài)細菌檢測方法

細菌進入VBNC 狀態(tài)后會喪失可培養(yǎng)性,常規(guī)平板計數(shù)法無法對其進行有效檢測,導致“漏檢”部分致病菌、影響水質(zhì)安全,需建立快速、準確的VBNC 細菌檢測方法。

目前尚未報道能夠直接檢測VBNC 狀態(tài)細菌數(shù)量的方法,一般而言,該過程需要分別對總菌、活菌和可培養(yǎng)菌進行定量計數(shù),當可培養(yǎng)菌數(shù)明顯小于活菌數(shù)時,即可認為存在部分處于VBNC 狀態(tài)的細菌,其數(shù)量可通過活菌數(shù)和可培養(yǎng)菌數(shù)的差值獲得,即VBNC 狀態(tài)菌數(shù)=活菌數(shù)-可培養(yǎng)菌數(shù)。 可培養(yǎng)菌數(shù)由平板計數(shù)法獲得,由此可見關鍵在于對活菌數(shù)的準確測定。

目前針對活菌數(shù)量的檢測主要使用由Kogure等[15]最初采用的活菌直接計數(shù)法(direct viable counting,DVC),而部分革蘭氏陽性菌對萘啶酮酸的抗性會導致觀察效果不好。 為進一步提高檢測結果的準確性,LIVE/DEAD 試劑盒檢測法、流式細胞儀檢測法、免疫學法等檢測手段陸續(xù)得到發(fā)展和應用。近年來,實時熒光定量PCR 法(quantitative real-time PCR)、疊氮溴化丙錠聯(lián)合實時熒光定量PCR 法(PMA-qPCR)、核酸探針等分子生物學檢測手段也被用于VBNC 狀態(tài)的檢測[16]。 上述幾種VBNC 狀態(tài)細菌檢測方法的對比如表2[17]所示。 由于單一檢測方法的結果具有局限性,在實際應用過程中大多通過兩種或以上的方法組合驗證的方式來提高檢測精確度。

表2 VBNC 狀態(tài)細菌檢測方法比較Tab.2 Comparison of Determination Methods for Bacteria in VBNC State

3 VBNC 狀態(tài)細菌的形成和復蘇機制

3.1 VBNC 狀態(tài)細菌的誘導因素

目前已證實多種環(huán)境因素可以誘導細菌進入VBNC 狀態(tài),包括溫度、營養(yǎng)、pH、鹽度、氧氣濃度、紫外照射等物理因素,以及消毒劑、抗生素等化學因素。 在飲用水處理過程中,溫度(季節(jié)變化)和營養(yǎng)缺乏(饑餓狀態(tài))是影響細菌VBNC 狀態(tài)形成的主要因素。

3.1.1 溫度

溫度對細菌VBNC 狀態(tài)的誘導與細菌種類有關,主要區(qū)別在于細菌對高溫/低溫的敏感度。 分別在10～30 ℃和4～6 ℃條件下培養(yǎng)霍亂弧菌和空腸彎曲桿菌,發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌在4 ～6 ℃時更容易進入VBNC 狀態(tài),而空腸彎曲桿菌在30 ℃條件下的誘導效果更好[2]。 相關研究表明,大多數(shù)水源性致病菌對低溫較敏感,能夠在低溫條件下進入VBNC 狀態(tài)。在飲用水處理全過程中,水溫呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性變化,尤其是冬季和夏季。 在不同的季節(jié),細菌可能呈現(xiàn)不同的生存狀態(tài),在活菌和VBNC 狀態(tài)之間相互轉化。

3.1.2 營養(yǎng)缺乏

營養(yǎng)缺乏是影響細菌進入VBNC 狀態(tài)的重要因素之一,VBNC 狀態(tài)可增強細菌對寡營養(yǎng)環(huán)境的抗性。 使用無菌蒸餾水培養(yǎng)軍團菌,發(fā)現(xiàn)軍團菌在饑餓狀態(tài)下進入VBNC 狀態(tài),并伴隨有細胞膜的損傷和酯酶活性降低等現(xiàn)象[18]。

3.1.3 其他因素

飲用水處理過程中的紫外照射和消毒劑處理也被證實可以導致多種細菌進入VBNC 狀態(tài)[19-20]。使用質(zhì)量濃度為1 mg/L 的氯處理大腸桿菌5 ～60 min 后,發(fā)現(xiàn)可培養(yǎng)細菌從1×106CFU/mL 降至0,而活菌數(shù)相差不大,認為已被誘導進入VBNC 狀態(tài)。 相較而言,鹽度和滲透壓對于水源性細菌影響相對較弱。

3.2 細菌VBNC 狀態(tài)的形成機制

目前,細菌VBNC 狀態(tài)的形成機制尚不明確,現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)該過程涉及細菌多種代謝途徑中的眾多相關基因,主要包括嚴緊反應、蛋白酶對抗毒素的降解和毒素-抗毒素(toxin-antitoxin,TA)系統(tǒng)[21],三者相互協(xié)同發(fā)揮作用。 此外,氧化應激反應和一些關鍵調(diào)控因子對VBNC 狀態(tài)的形成也具有重要意義,主要形成機制如圖2 所示。

圖2 VBNC 狀態(tài)形成機制Fig.2 Formation Mechanism of VBNC State

3.2.1 嚴緊反應、蛋白酶對抗毒素的降解和TA系統(tǒng)

嚴緊反應是通過減緩細菌生長實現(xiàn)菌體內(nèi)氨、基酸水平升高的一種作用機制,該過程主要利用信號分子鳥苷五磷酸或鳥苷四磷酸[(p)ppGpp]對細胞分裂轉錄和翻譯等生理過程進行調(diào)控。 在營養(yǎng)缺乏的條件下,被激活的核糖體蛋白RelA 和胞質(zhì)蛋白SpoT 能夠合成 (p)ppGpp 信號分子,(p)ppGpp 通過抑制外切聚磷酸酶(PPX) 對多聚磷酸鹽(polyphosphates,PolyP)的降解、促進多聚磷酸鹽激酶(PPK1、PPK2)的活化實現(xiàn)細菌體內(nèi)PolyP 的逐漸積累。 Lon/Clp 蛋白酶被積累的PolyP 激活并開始降解TA 系統(tǒng)的抗毒素,使得毒素(toxin)和抗毒素(antitoxin)比例升高,游離毒素通過抑制細胞DNA 復制和mRNA 翻譯等過程抑制細胞分裂和生長,進而調(diào)控VBNC 狀態(tài)的形成[22-23]。

3.2.2 氧化應激反應

ROS 和氧化應激反應是VBNC 狀態(tài)形成的重要因素。 研究[24]表明,抗氧化酶AhpC、谷胱甘肽S-轉移酶GST、過氧化氫酶KatA/KatG、超氧化物歧化酶SodA 等與ROS 相關的蛋白質(zhì)均參與VBNC 細菌的形成。 在低溫條件下,過氧化氫酶活性受到抑制、細胞可培養(yǎng)性降低,部分水源性致病菌能夠進入VBNC 狀態(tài)。 對于紫外線照射和消毒處理等過程而言,過量自由基的產(chǎn)生、氧化應激反應及相關基因的表達也能促進VBNC 狀態(tài)細菌的形成。

3.2.3 關鍵調(diào)控因子

RNA 聚合酶sigma 因子(RNA polymerase sigma factor,RpoS)和轉錄調(diào)控因子OxyR 對VBNC 狀態(tài)的形成具有一定的調(diào)控作用[25]。 RpoS 蛋白能夠調(diào)控細菌轉錄、翻譯、蛋白質(zhì)水解等過程,菌體內(nèi)(p)ppGpp 水平的增加會導致RpoS 蛋白的積累,進而誘導VBNC 狀態(tài);OxyR 的作用機制主要與活性氧及抗氧化脅迫有關,通過影響AhpC 和GST 等基因的表達實現(xiàn)對細菌VBNC 狀態(tài)的調(diào)控[24]。

3.3 VBNC 狀態(tài)細菌的復蘇機制

針對不同的細菌種類和誘導條件,VBNC 狀態(tài)細菌的復蘇方法和能力也大不相同。 目前可行的VBNC 狀態(tài)復蘇方法主要有兩種:一是去除誘導因子,即降低外界環(huán)境脅迫;二是添加與復蘇相關的特定信號分子,如復蘇促進因子、自誘導因子等。

3.3.1 去除誘導因子

低溫、寡營養(yǎng)、紫外線照射等不利條件均可誘導細菌進入VBNC 狀態(tài),相對應地,通過提高培養(yǎng)溫度、添加某些營養(yǎng)物質(zhì)、添加自由基清除劑(丙酮酸鈉)等方法直接去除環(huán)境誘導因子可以實現(xiàn)VBNC狀態(tài)細菌的復蘇。 在培養(yǎng)液中添加營養(yǎng)物質(zhì)并升溫培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)低溫寡營養(yǎng)條件下誘導的VBNC 狀態(tài)副溶血弧菌細菌能夠在48 h 內(nèi)復蘇為可培養(yǎng)狀態(tài),且復蘇后的副溶血弧菌與正常狀態(tài)的細菌形態(tài)相似[26]。

然而現(xiàn)有研究結果表明,僅有少量被誘導進入VBNC 狀態(tài)的細菌能夠在實驗室條件下成功復蘇。由此可見,該過程并不是簡單的逆轉過程,具體的作用機制仍需進一步探討。

3.3.2 添加信號分子

(1)復蘇促進因子

1995 年,Mukamolova 等[27]首次在滕黃微球菌中發(fā)現(xiàn)了復蘇促進因子Rpf(resuscitation-promoting factor)。 Rpf 是一種高度保守的分泌蛋白,廣泛存在于高G+C 的G+中,能有效促進該類細菌,尤其是放線菌門細菌的生長和復蘇[28]。

目前針對Rpf 促進VBNC 狀態(tài)細菌復蘇機制的研究主要從兩個方面考慮:①Rpf 作為細胞因子,能夠與VBNC 狀態(tài)細菌表面的受體蛋白結合并傳遞生長信號,促進細胞的生長和復蘇,但目前仍未發(fā)現(xiàn)相關的受體以及上、下游調(diào)控因子[29];②Rpf 作為一種胞壁溶解酶,其作用機制與溶菌酶相似,通過水解VBNC 狀態(tài)細菌細胞壁中的肽聚糖,使得細胞壁部分裂解,促進細胞分裂和生長[30],降解得到的肽聚糖產(chǎn)物也可能充當“第二信使”,協(xié)同其他的影響因素,共同參與VBNC 狀態(tài)細菌的生長和復蘇過程。

此外,在部分G-(沙門氏菌屬、弧菌屬等)中也發(fā)現(xiàn)了類似于Rpf 的復蘇促進因子,如YeaZ、Gcp等[31-32],這些蛋白類似于糖蛋白酶,其蛋白互作網(wǎng)絡與細胞分裂和DNA 代謝密切相關。 然而G-的蛋白結構較復雜,目前相關研究較少,作用機制尚未形成定論。

(2)自誘導因子

自誘導因子(AI-2) 是由群體感應(quorum sensing,QS)分泌的一種信號分子,能夠實現(xiàn)VBNC狀態(tài)細菌的復蘇。 研究[21]表明,細菌的生理過程變化受到多種蛋白的共同調(diào)控,如LuxR 蛋白能夠調(diào)節(jié)細菌的毒性基因表達和生物膜形成,RpoS 蛋白則能夠調(diào)節(jié)細菌在不良環(huán)境下的應激表達。 在適當條件下,群體感應信號分子AI-2 能夠提高luxR和rpoS等相關基因的表達, 實現(xiàn)VBNC 狀態(tài)細菌的復蘇[33]。

4 飲用水處理過程對細菌VBNC 狀態(tài)的影響

相關報道顯示,在飲用水處理及管道輸配過程中,受到多種外界環(huán)境因素的影響,部分水源性致病菌可能會被誘導進入VBNC 狀態(tài)[34],能夠直接表達毒力因子或保留致病潛力。 因此,進一步探究飲用水處理過程對于細菌VBNC 狀態(tài)形成和復蘇的影響,對于保障飲用水安全具有重要意義。

飲用水常規(guī)處理工藝包括混凝-沉淀-過濾-消毒,為了有效去除水中大分子有機物、提高出水水質(zhì),部分水廠增設了如O3-BAC、膜處理等深度處理單元。 其中,涉及到VBNC 狀態(tài)細菌變化的主要工藝包括混凝、沉淀、過濾、O3-BAC 工藝和消毒處理。

4.1 混凝、沉淀、過濾工藝單元

混凝、沉淀、過濾是飲用水處理過程中最基本的處理單元,其主要凈水原理是通過投加混凝劑,使水中膠體物質(zhì)凝聚成團沉降,利用石英砂過濾去除水中的細小懸浮顆粒,其中包括一部分的VBNC 狀態(tài)細菌。 針對全尺寸飲用水處理廠中致病菌VBNC 狀態(tài)的檢測結果[35]表明,相較于水源水而言,該階段的VBNC 狀態(tài)細菌數(shù)量有所減少。 然而目前尚未見有關混凝、沉淀、過濾工藝誘導細菌進入VBNC 狀態(tài)的報道。

4.2 O3-BAC 工藝

O3氧化能夠破壞細菌的細胞膜結構,程度嚴重時會導致細胞死亡,對水中微生物具有一定的控制作用。 同時能通過產(chǎn)生過量自由基,誘導微生物上調(diào)抗氧化相關基因表達,促使部分未被完全滅活的細菌進入VBNC 狀態(tài)[20]。

BAC 上富集大量的微生物,具有豐富的種群多樣性和種群結構,能夠為細菌提供更多的生態(tài)位,同時為實現(xiàn)細菌VBNC 狀態(tài)的轉變提供了更多的可能性。 相關研究表明,BAC 顆粒上的致病微生物大多來源于水源水,而大多數(shù)致病菌在水源水中已經(jīng)處于VBNC 狀態(tài)[35],部分致病微生物在BAC 前置處理過程中也會轉變?yōu)閂BNC 狀態(tài),這些VBNC 狀態(tài)細菌能夠直接富集在BAC 上,因此,BAC 生物膜上的致病微生物是活菌和VBNC 狀態(tài)細菌的混合體。炭池運行過程中形成的不利環(huán)境條件也能夠誘導部分致病微生物進入VBNC 狀態(tài)。 VBNC 狀態(tài)細菌在炭池不同深度的分布情況間接反映了O3-BAC 對VBNC 狀態(tài)的誘導作用。 表層細菌由于長期暴露于O3環(huán)境下,易造成細胞膜的破壞;而深層細菌能夠持續(xù)消耗營養(yǎng)物質(zhì)和O2,易形成寡營養(yǎng)環(huán)境,并導致細菌數(shù)量降低[36],營養(yǎng)缺乏和O3都是細菌VBNC 狀態(tài)形成的重要因素,兩者的共同作用對細菌VBNC 狀態(tài)轉變的影響,需要進行進一步的系統(tǒng)研究。

4.3 消毒工藝單元

常見的飲用水消毒處理方法(氯氣、紫外線等)均可誘導細菌進入VBNC 狀態(tài)。 其中,紫外線處理能夠降低細胞的可培養(yǎng)性,引起微生物機體內(nèi)活性氧的失衡, 促使其進入VBNC 狀態(tài)[37];而氯氣消毒則主要依靠細胞膜的損傷、抑制酶促反應來實現(xiàn)[20]。

細菌種類和誘導因子均會影響消毒處理誘導微生物進入VBNC 狀態(tài)的復蘇能力。 利用紫外線分別誘導大腸桿菌和銅綠假單胞菌進入VBNC 狀態(tài),發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的復蘇能力比銅綠假單胞菌強[37];經(jīng)氯/氯胺處理后的大腸桿菌均可進入VBNC 狀態(tài),但僅有氯處理的VBNC 狀態(tài)細菌能夠在37 ℃的LB培養(yǎng)基中復蘇[9]。

4.4 水廠控制VBNC 狀態(tài)微生物的關鍵環(huán)節(jié)探討

相較于其他飲用水處理工藝,O3-BAC 工藝對于VBNC 狀態(tài)微生物的控制起著關鍵的作用。 一方面,通過O3氧化可以有效滅活大部分微生物,但也能誘導部分未被滅活的微生物處于VBNC 狀態(tài),并在BAC 單元截留、富集;另一方面,BAC 單元凈化過程中,微生物在BAC 顆粒表面和孔隙內(nèi)大量富集、滋生、增殖,以及生物膜厚度的增加,造成局部營養(yǎng)物含量不足及生長條件惡化,誘導部分微生物進入VBNC 狀態(tài)。 在一般水廠應用中,O3-BAC 工藝常被設置于凈化工藝末端,會直接影響最終出水中VBNC 細菌的種類和含量。 因此,O3-BAC 工藝對于水廠VBNC 細菌控制具有重要的意義,具體可通過以下途徑予以優(yōu)化控制:

1)解析O3氧化滅活微生物效能與誘導微生物處于VBNC 狀態(tài)的“劑量-效應”關系,探討水質(zhì)條件的影響因素,優(yōu)化O3投加劑量;

2)明確BAC 單元中VNBC 微生物富集以及誘導生物膜微生物進入VBNC 狀態(tài)的機制及關鍵條件,合理調(diào)整BAC 運行參數(shù),規(guī)避或減弱BAC 凈化過程中對VBNC 狀態(tài)的誘導效應;

3)強化O3-BAC 工藝出水中VBNC 狀態(tài)微生物的控制,通過BAC 單元結構的優(yōu)化設計,改進底部砂墊層的組成及厚度,強化對逸散微生物的截留及控制效能,必要情況下,可通過后置增設超濾膜截留、優(yōu)化消毒工藝形式等方式來確保VBNC 狀態(tài)微生物的有效控制。

5 結論

飲用水處理過程中存在的各種物理、化學等環(huán)境脅迫因素,能夠誘導部分致病菌進入VBNC 狀態(tài),并在適當條件下復蘇,致病性的恢復對飲用水安全和人體健康造成了嚴重威脅。 因此,進一步探討飲用水全處理流程中細菌VBNC 狀態(tài)的形成和復蘇機制、建立有效的VBNC 狀態(tài)細菌控制手段是今后的研究重點,主要體現(xiàn)在以下幾個方面:(1)明確VBNC 狀態(tài)細菌在飲用水處理全過程中的分布情況,分析VBNC 狀態(tài)細菌的轉變規(guī)律;(2)研究飲用水處理條件對VBNC 狀態(tài)細菌的誘導作用,深入探討VBNC 狀態(tài)的形成及復蘇機制;(3)建立快速、準確的VBNC 狀態(tài)細菌檢測方法,避免致病菌的“漏檢”,保障供水安全。