卯明艷,余炫頡,張麗君

(1.六盤水職業(yè)技術(shù)學(xué)院,貴州 六盤水 553000;2.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院;3.咸寧市中心醫(yī)院介入科;4.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)學(xué)院,湖北 咸寧 437100)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy,DPN)是糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)最常見和最嚴重的并發(fā)癥之一[1],最終將影響近50%的成年DM患者,并與疼痛、足部潰瘍和下肢截肢的發(fā)病率有關(guān)[2]。DPN對神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞等周圍神經(jīng)系統(tǒng)組織造成損害[3]。尤其是背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia,DRG)神經(jīng)元位于血腦屏障之外,并暴露于高血糖應(yīng)激源中,它們更容易受到傷害[4]。研究表明,DRG的一些分子和形態(tài)學(xué)變化(如細胞應(yīng)激和凋亡)與DPN的發(fā)生和進展息息相關(guān)[5],并且高糖(high glucose,HG)誘導(dǎo)DRG神經(jīng)元凋亡是一種常見的DPN形態(tài)學(xué)損傷[6]。文獻研究發(fā)現(xiàn),HG誘導(dǎo)DRG神經(jīng)元凋亡涉及到多個病理過程,主要包括應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、多元醇途徑、ROS積累和AGE的產(chǎn)生。同時,多條信號通路也參與其中,包括PI3K/AKT/mTOR、NF-κB、Nrf2/HO-1/ARE和AMPK/PGC-1α。死亡受體通路(TNF信號通路)是介導(dǎo)凋亡的三大信號通路之一[7],但是該通路在HG誘導(dǎo)DRG神經(jīng)元凋亡過程中研究尚不充足。

DPN不僅對個人的生活質(zhì)量和經(jīng)濟造成極大影響,同時也成為了社會的經(jīng)濟負擔(dān),可有效的治療方法尚在積極探索中。目前以有效控制血糖、定期足部檢查和積極管理疼痛的形式進行篩查和治療,達到延緩疾病發(fā)展進程[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物及其代謝物對DPN有較好的治療作用,有望成為DPN新的治療選擇方向[8]。其中,槲皮素(Quercetin,Que)和山柰酚(Kaempferol,Kae)是黃酮家族的重要成員,廣泛存在于各類飲食中,如水果,蔬菜,紅酒等等,作為膳食補充劑,在增強免疫系統(tǒng)和促進健康生活中發(fā)揮重要作用[9]。Que的抗氧化、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等生物功能使其成為病理機制涉及氧化應(yīng)激、炎癥和免疫的不健康狀況的潛在候選者[10],并且在DM及其并發(fā)癥中具有較好的治療效果[11]。岳等人[12]和張等人[13]的研究表明Que的神經(jīng)保護作用與激活Nrf-2/HO-1和AMPK/PGC-1α通路,抑制NF-κB通路,以及保護線粒體,防止其被損傷有關(guān)。Kae具有廣泛的藥理活性,包括抗氧化、抗炎、抗DM病和神經(jīng)保護作用[14]。在一項研究中,Kae可降低氧化應(yīng)激,減弱H2O2-和aβ誘導(dǎo)的細胞凋亡,對PC12細胞和初級皮質(zhì)神經(jīng)元起到保護作用[15]。雖然Que和Kae在DM及其并發(fā)癥中都呈現(xiàn)出有益的治療潛力,但對二者的協(xié)同作用研究尚不充分。前期借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對二者協(xié)同防治DPN的作用機制進行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Que和Kae的防治作用與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細胞凋亡等病理過程和激活或抑制胰腺癌相關(guān)通路、AGE-RAGE和TNF等信號通路有關(guān)[16]。因此,本研究在細胞水平研究Que聯(lián)合Kae通過抑制細胞死亡受體通路保護大鼠DRG細胞免受HG損傷,明確Que和Kae的協(xié)同作用,為DPN的防治提供研究基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)大鼠DRG細胞購自北納生物,標準條件(37 ℃、21% O2和5% CO2)下,用DMEM(葡萄糖濃度為25 mM)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。DMEM完全培養(yǎng)基由89% DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗配置而成,4 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩＜毎麖?fù)蘇后接種于培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng),每24 h更換一次培養(yǎng)液。細胞密度達到80%左右時,使用0.25% (w/v)胰蛋白酶溶液消化細胞進行傳代。

1.2 DPN體外模型取對數(shù)期DRG細胞鋪板,置于標準條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細胞分為以下幾組:對照組僅在完全DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng);HG組為額外加入20%的無菌D-(+)-葡萄糖溶液,使完全培養(yǎng)基中葡萄糖濃度達到35 mM、45 mM、55 mM、65 mM、75 mM、85 mM、95 mM、105 mM。處理條件是細胞鋪板后立給予HG,處理24 h后進行CCK8檢測,確定HG誘導(dǎo)DRG細胞損傷的DPN體外模型。

1.3 藥物處理取對數(shù)期DRG細胞鋪板,Que處理的細胞分為以下幾個組:Con、HG組、HG+Que組(5 μM、10 μM、20 μM、40 μM、60 μM、80 μM和100 μM)。Kae處理的細胞分為Con、HG組、HG+Kae組(1 μM、2.5 μM、5 μM、10 μM、20 μM、30 μM和40 μM)。Que+Kae處理組的細胞分為Con、HG組、HG +Kae +Que組(2.5 μM+5 μM、2.5 μM+10 μM、2.5 μM+20 μM、5 μM+5 μM、5 μM+10 μM、5 μM+20 μM、10 μM+5 μM、10 μM+10 μM、10 μM+20 μM)。均置于標準條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。借助CCK8試劑盒檢測細胞活力,首先確定Que和Kae的最佳給藥濃度,再將對細胞活力有促進作用的單藥濃度進行交叉實驗,最終明確組合藥的最優(yōu)濃度。

1.4 細胞活力Cell Counting Kit-8(簡稱CCK-8)試劑可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析。按照DPN體外模型和藥物處理條件,清除培養(yǎng)液后每孔加1/10體積CCK8,繼續(xù)培養(yǎng)1 h,利用酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀讀取波長為450 nm處的各孔光吸收值,通過OriginPro.2019b.Win軟件計算并繪制細胞增殖曲線圖,確定HG、單藥及組合藥最佳給藥濃度,用于后續(xù)實驗。

1.5 細胞內(nèi)ROS水平檢測DRG細胞6孔板鋪板,每孔3×105/mL,分為6組,即Con組、Rosup組、HG組、HG+Que組、HG+Kae組和HG+Que+Kae組。細胞培養(yǎng)24 h后,首先準備ROS探針,用無血清培養(yǎng)液稀釋H2DCFDA,比列是1∶1 000,使其工作濃度為10 μM。其次裝載探針,去除陳舊培養(yǎng)基,無菌PBS溶液清洗2次,6孔板中每孔加入2 mL稀釋好的H2DCFDA工作液,完全覆蓋細胞,然后放置于37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)避光孵育30 min。再清洗細胞,無菌PBS溶液清洗細胞2次,徹底去除沒有進入細胞內(nèi)的H2DCFDA。最后熒光顯微鏡照相:將細胞置于顯微鏡下,通過FITC濾光片觀察熒光。根據(jù)綠色熒光強弱判斷細胞內(nèi)活性氧水平。

1.6 免疫熒光檢測細胞凋亡量DRG細胞6孔板鋪板,每孔3×105/mL,分為5組,即Con組、HG組、HG+Que組、HG+Kae組和HG+Que+Kae組,24 h后將其從培養(yǎng)箱取出,沿壁去除陳舊培養(yǎng)基,再用無菌PBS潤洗2次,然后每皿加入1 mL的染色工作液,并在每皿中分別加入5 μL Hoechst染色液和5 μL PI染色液,輕輕搖動培養(yǎng)皿,使液體分散均勻,完全覆蓋皿底,至于4 ℃環(huán)境中孵育20～30 min,最后染色結(jié)束后,再沿壁去除染色液,無菌PBS溶液洗滌2次,放在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 蛋白質(zhì)印跡分析蛋白表達水平DRG細胞6孔板鋪板,每孔3×105/mL,分為5組,即Con組、HG組、HG+Que組、HG+Kae組和HG+Que+Kae組,24 h后將其從培養(yǎng)箱取出并去除陳舊完全培養(yǎng)基,無菌PBS清洗2次,至于冰上加入裂解液進行細胞裂解,4 ℃,12 000 r離心后提取上清液,進行蛋白定量及處理。使用10%雅酶PAGE凝膠進行電泳,電壓為150 V,待標記物跑到底部停止電泳。250 mA轉(zhuǎn)模100 min,雅酶無蛋白快速封閉液封閉15 min,TBST洗膜3次,每次10 min。加入一抗稀釋液FADD(單抗,1∶1 000)、Caspase-3(單抗,1∶1 000)、Caspase-8(單抗,1∶1 000)、TNFR1(多抗,1∶1 000)、內(nèi)參β-Actin(1∶2 000),4 ℃搖床過夜。次日回收一抗,TBST洗膜,常溫孵育二抗(1∶15 000)1 h。最后TBST洗膜、顯影,運用Image J對圖像進行灰度值分析計算蛋白表達量。

1.8 統(tǒng)計分析使用SPSS 26.0軟件完成統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均表示為至少三個獨立實驗結(jié)果的“均數(shù)±標準差”。多組間統(tǒng)計分析采用單因素方差分析。P<0.05的值被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8實驗結(jié)果

2.1.1 DPN體外模型的建立 根據(jù)DRG細胞活力結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度達到45 mM時,細胞活力呈濃度依賴形式逐漸降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。當葡萄糖濃度達到85 mM時對DRG的活力影響比較明顯,細胞活力下降至62%左右,如圖1所示。因此,后續(xù)實驗均采用HG濃度為85 mM,作用24 h為DPN體外模型的建模條件。

圖1 HG對DRG細胞活力的影響

2.1.2 Que給藥濃度的確定 將不同濃度的Que作用于HG環(huán)境中的DRG細胞,經(jīng)CCK-8檢測發(fā)現(xiàn),在HG環(huán)境中,Que對DRG細胞有一定的保護作用,可以增強細胞活力,由圖2可知,隨著Que濃度的升高,DRG細胞活力逐漸上升,當Que濃度達到20 μM時,促進細胞增殖作用最明顯,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),當Que濃度達到80 μM時,DRG細胞活力反而呈下降趨勢,并且隨濃度的增高,細胞活力呈下降趨勢,因此將20 μM作為Que給藥最佳濃度。

圖2 不同濃度Que對HG環(huán)境中DRG的影響

2.1.3 Kae給藥濃度的確定 將不同濃度的Kae作用于HG環(huán)境中的DRG細胞,經(jīng)CCK-8檢測發(fā)現(xiàn),在HG環(huán)境中,Kae對DRG細胞有一定的保護作用,可以增強細胞活力,由圖3可知,隨著Kae濃度的升高,DRG細胞活力逐漸上升,當Kae濃度達到2.5 μM、5 μM和10 μM時,均有促進細胞增殖作用,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),當濃度達到5 μM時促進作用最明顯。當Kae濃度達到20 μM及以后,DRG細胞活力反而呈下降趨勢,遵循最小用藥原則,將Kae的給藥濃度被確定為5 μM。

圖3 不同濃度Kae對HG環(huán)境中DRG的影響

2.1.4 Que+Kae給藥濃度的確定 結(jié)合Que和Kae單獨給藥對HG環(huán)境中DRG的保護作用,本實驗中將10 μM、20 μM和40 μM濃度的Que和2.5 μM、5 μM和10 μM濃度的Kae隨機組合,篩選最佳的組合濃度,突破一貫式的單藥最優(yōu)濃度疊加的模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Kae濃度不變時,隨著Que濃度的增加,細胞活力上升后又呈下降趨勢,詳見圖4,由圖可知,當Kae和Que濃度分別達到5 μM和10 μM時,對HG環(huán)境中的DRG細胞活力具有最明顯的促進作用,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。并且組合藥的促進作用強于單藥的促進作用,差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。因此推斷10 μM濃度的Que和5 μM濃度的Kae是最佳的組合濃度,將用于后續(xù)實驗。

圖4 不同濃度Que和Kae組合后對HG環(huán)境中DRG的影響

2.2 Que+Kae對HG環(huán)境中DRG細胞內(nèi)ROS的影響通過ROS Assay Kit試劑盒的熒光探針DCFH-DA檢測DRG細胞內(nèi)ROS水平,由圖5可以看出,HG組的綠色熒光明顯多于Con組,說明DRG細胞內(nèi)ROS水平高于Con組細胞內(nèi)的ROS水平。與HG組相比,Que、Kae和Que+Kae組的綠色熒光均減少,Que+Kae組的熒光最少,說明單藥或組合藥均能降低HG環(huán)境中的DRG細胞內(nèi)ROS的水平,其中組合藥的作用強于單藥作用。

圖5 Que+Kae對HG環(huán)境中DRG細胞內(nèi)ROS的影響

2.3 Que+Kae對HG環(huán)境中DRG細胞凋亡的影響各組細胞經(jīng)過Hoechst和PI染色后在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),由圖6可知,與Con組比較,HG組細胞對PI吸收較多,強紅色熒光多,則說明細胞損傷嚴重;與HG組相比較,HG+Que組、HG+Kae,以及HG+Que +Kae組的強紅色熒光明顯減少,其中組合藥熒光減少最明顯,說明單藥或組合藥可以抑制HG環(huán)境中DRG細胞的凋亡,其中組合藥的保護作用優(yōu)于單藥。

圖6 單藥或組合藥對HG誘導(dǎo)DRG細胞凋亡的影響

2.4 Que+Kae對TNFR1、FADD、Caspase-8和Caspase-3表達的影響蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果顯示,與對照組相比,HG組TNFR1、FADD、Caspase-8和Caspase-3表達升高(P<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與模型組相比,HG+Que組、HG+Kae組或HG+Que+Kae組的TNFR1、FADD、Caspase-8和Caspase-3表達降低,如圖7所示。其中HG+Que+Kae組降低越明顯,HG+Que組有降低趨勢,但是差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖7 各組細胞凋亡信號通路蛋白表達情況圖

3 討論

DPN的潛在機制是一個復(fù)雜的問題,尚在持續(xù)的研究中,但是高血糖癥和微血管病的影響結(jié)果得到認可[17],其中高血糖作為DPN嚴重程度的關(guān)鍵決定因素備受關(guān)注[18]。DPN波及整個周圍神經(jīng)系統(tǒng)的細胞和(或)組織,尤其是DRG細胞[4]。研究表明,最適合DRG細胞體外存活和生長的葡萄糖濃度為25 mM,超過35 mM就會對DRG細胞造成不同程度的傷害[12]。孫青等人[19]的綜述中闡述了HG濃度在25～300 mM范圍內(nèi)都會對DRG細胞造成損傷。Sharma等人也發(fā)現(xiàn),暴露于HG環(huán)境中,DRG細胞的凋亡數(shù)量明顯上升[20]。在本次研究中發(fā)現(xiàn),當HG濃度達到85 mM,作用24 h后,DRG細胞活力受抑制,細胞內(nèi)ROS水平及細胞凋亡量升高。

HG損傷DRG細胞涉及到多個病理過程,本研究中主要關(guān)注的是細胞凋亡和氧化應(yīng)激。細胞凋亡是一個重要的生物學(xué)過程,受到多基因的嚴格控制,如Bcl-2家族、Caspase家族、癌基因C-myc、抑癌基因P53等[21]。DRG細胞是感覺傳入軀體的節(jié)點,細胞快速凋亡和功能障礙是導(dǎo)致DPN患者肢體麻木和疼痛原因,被認為是DPN發(fā)生的主要原因[22]。DRG也被認為是DPN和糖尿病高血糖的靶組織,持續(xù)HG狀態(tài),葡萄糖的自氧化和蛋白質(zhì)的糖基化致使DRG細胞產(chǎn)生ROS,不斷積累將導(dǎo)致氧化損傷[23]。此外,ROS過量產(chǎn)生導(dǎo)致DRG細胞凋亡,并證實ROS是誘導(dǎo)細胞凋亡的重要因素之一[24]。其中,Caspase是細胞凋亡中最主要最核心的參與者,它的家族對天冬氨酸殘基上的肽健具有特異性,能夠快速識別并切割,在眾多Caspase家族成員中,上游的caspase-8具有雙重功能,既可誘導(dǎo)細胞死亡,又可抑制細胞死亡,它可以通過死亡受體TNFR1,誘導(dǎo)細胞凋亡[25]。下游的Caspase-3是細胞凋亡的執(zhí)行者,正常情況下,Caspase-3沒有活性,當細胞接受死亡信號時,可引起Caspase-3裂解、活化,活化的Caspase-3導(dǎo)致DNA修復(fù)蛋白、細胞骨架蛋白和Caspase激活的DNase抑制劑(ICAD)的蛋白水解,從而導(dǎo)致細胞凋亡[26]。細胞表面的死亡受體(TNFR1/2、Fas和DR3/4/5)和對應(yīng)的配體(TNF-α、FasL、TRAIL、TWEAK)被配體激活,導(dǎo)致銜接蛋白、FADD和TRADD9等死亡誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體形成,進一步激活上游啟動型Caspase-8和下游執(zhí)行型Caspase-3,導(dǎo)致細胞凋亡[25]。

在本研究中,HG可導(dǎo)致DRG細胞活力下降,細胞內(nèi)ROS水平升高,細胞凋亡數(shù)量增加,參與到DPN的發(fā)生發(fā)展過程中。Que、Kae或Que聯(lián)合Kae對HG環(huán)境中的DRG細胞具有保護作用,主要是通過提高細胞活力,降低細胞內(nèi)的ROS水平,減輕氧化損傷,最后減少細胞凋亡數(shù)量。作用機制是通過下調(diào)TNF受體1(TNFR1)、銜接蛋白FADD、上游啟動性蛋白Caspase-8和下游凋亡執(zhí)行者Caspase-3等關(guān)鍵蛋白的表達,抑制細胞死亡受體通路保護DRG免受HG損傷。