王樂樂,王禮躍,蔡為民,康喜龍,馮茜茜,張知之,范雪蓮,朱 玉,劉丹丹,許金俊,潘志明,4,陶建平*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,揚(yáng)州 225009;2.江蘇動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,揚(yáng)州 225009;3.江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,揚(yáng)州 225009;4.宿遷學(xué)院,宿遷 223800)

雞球蟲病是危害集約化養(yǎng)雞場(chǎng)的重大疾病之一,由一種或數(shù)種艾美耳球蟲(Eimeriaspp.)感染引起,其病原有7種,其中柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)和毒害艾美耳球蟲(Eimerianecatrix)是致病性最強(qiáng)的兩種,分別引起雞的急性盲腸球蟲病和急性小腸球蟲病[1]。目前,對(duì)雞球蟲病的防治主要依賴抗球蟲藥物,但長期使用藥物產(chǎn)生了諸多問題,如因耐藥蟲株引起藥效下降、藥物殘留導(dǎo)致的食品安全、污染環(huán)境等。因此,近年來雞球蟲病的防控方法逐漸從藥物防治轉(zhuǎn)向免疫預(yù)防。目前,臨床上主要是用雞球蟲活蟲苗來免疫預(yù)防雞球蟲病?；钕x苗能產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)力,但使用不當(dāng)會(huì)引起球蟲病發(fā)生[2]。而亞單位疫苗與活蟲苗相比無此風(fēng)險(xiǎn),因而更加安全[3]。迄今,已商品化的雞球蟲病亞單位疫苗僅有CoxAbic?一種,該疫苗由3種巨型艾美耳球蟲(Eimeriamaxima)配子體蛋白抗原組成,能較為有效地抵抗巨型艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲以及堆型艾美耳球蟲(Eimeriaacervulina)的感染[4]。但由于生產(chǎn)該疫苗需要用巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊感染無球蟲雞,然后再從雞腸道黏膜上皮細(xì)胞中分離純化配子體,最后用親和層析法從配子體中分離純化配子體蛋白抗原,故生產(chǎn)費(fèi)時(shí)費(fèi)力、成本高,不能大批量生產(chǎn)來滿足市場(chǎng)需求[5]。

ApiAP2蛋白作為調(diào)控頂復(fù)門原蟲蟲體發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子,其研究主要見于瘧原蟲(Plasmodiumspp.)和弓形蟲(Toxoplasmagondii)[6-7],但其免疫功能尚未見有報(bào)道。本研究室前期已克隆、表達(dá)了毒害艾美耳球蟲ApiAP2蛋白,重組蛋白rEnApiAP2能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高效價(jià)的多抗,并能被感染毒害艾美耳球蟲后的雞康復(fù)血清所識(shí)別,顯示具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性[8],但該重組蛋白對(duì)毒害艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲的免疫保護(hù)作用尚未報(bào)道。柔嫩艾美耳球蟲重組配子體蛋白rEtGAM22、rEtGAM56和rEtGAM59對(duì)柔嫩艾美耳球蟲和毒害艾美耳球蟲的免疫保護(hù)效果在本實(shí)驗(yàn)室已進(jìn)行了研究[9],但該重組蛋白與rEnApiAP2聯(lián)合免疫的免疫保護(hù)作用尚未開展。為此,本文通過動(dòng)物試驗(yàn),首先評(píng)價(jià)重組蛋白rEnApiAP2對(duì)毒害艾美耳球蟲的免疫保護(hù)效果和最佳免疫劑量,隨后將rEnApiAP2與rEtGAM56或rEtGAM59聯(lián)合免疫雛雞,同時(shí)設(shè)置三種重組蛋白的單獨(dú)免疫組,評(píng)價(jià)rEnApiAP2單免、及其與rEtGAM56或rEtGAM59聯(lián)免對(duì)毒害艾美耳球蟲或柔嫩艾美耳球蟲的免疫保護(hù)效果,為雞球蟲多價(jià)亞單位疫苗的研發(fā)提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲株、質(zhì)粒和菌株

柔嫩艾美耳球蟲揚(yáng)州株和毒害艾美耳球蟲揚(yáng)州株是由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室建種保存并定期傳代保種。試驗(yàn)之前卵囊經(jīng)雞體傳代復(fù)壯。重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-EnApiAP2、pET28a(+)-EtGAM56和pET28a(+)-EtGAM59,均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存[10-11]。大腸桿菌BL21(DE3)菌株,由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

黃腳麻雞(用于rEnApiAP2不同劑量免疫試驗(yàn)),購自江蘇立華牧業(yè)股份有限公司;如東草雞(用于rEnApiAP2與rEtGAM聯(lián)合免疫試驗(yàn)),購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所。剛出殼后立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,飼養(yǎng)在經(jīng)嚴(yán)格消毒、無球蟲污染的籠具中,自由采食和飲水,全價(jià)飼料不添加任何抗球蟲藥物。本項(xiàng)研究中所有試驗(yàn)方案符合揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物倫理、福利等相關(guān)條例規(guī)定,符合江蘇省科技廳動(dòng)物福利保護(hù)條例,許可證編號(hào):SCXK(蘇)2021-0013。

1.3 免疫抗原的制備

重組蛋白的制備:將3種蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒(pET28a(+)-EnApiAP2、pET28a(+)-EtGAM56和pET28a(+)-EtGAM59)用熱激法分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)菌株中并誘導(dǎo)表達(dá)[8,10-11]。按照Ni-NTA親和層析介質(zhì)(購自金斯瑞公司)說明書方法純化復(fù)性重組蛋白rEnApiAP2、rEtGAM56和rEtGAM59,A280紫外光吸收法測(cè)定重組蛋白濃度。

免疫抗原的制備:用無菌PBS稀釋重組蛋白至各免疫組所需濃度(0.5、1和2 mg·mL-1),分別與弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑(購自Sigma公司)按照體積比1∶1混勻,超聲乳化(滴于水面5 min內(nèi)不擴(kuò)散為標(biāo)準(zhǔn))。

1.4 試驗(yàn)分組和免疫程序

rEnApiAP2不同劑量免疫試驗(yàn):共設(shè)5個(gè)組,每組10只雞。各組的免疫劑量和程序見表1。免疫兩次,兩次免疫抗原劑量相同。在21日齡時(shí)除未免疫未攻蟲組外,其余各組每只雞經(jīng)嗉囊灌服感染1×104個(gè)毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊。在29日齡時(shí)結(jié)束試驗(yàn)。免疫途徑為胸部皮下注射。

表1 rEnApiAP2不同劑量免疫試驗(yàn)設(shè)計(jì)和免疫程序(n=10)Table 1 Experimental design and immune program of rEnApiAP2 at different dosages (n=10)

rEnApiAP2與rEtGAM聯(lián)合免疫試驗(yàn):共設(shè)13個(gè)組,每組10只雞。各組的免疫劑量和程序見表2。免疫兩次,兩次免疫抗原劑量相同。rEtGAM單免組免疫劑量為文獻(xiàn)的最佳免疫劑量[10-11],聯(lián)免組的免疫劑量為50 μg rEnApiAP2與半個(gè)rEtGAM單免劑量之和。在21日齡時(shí)除未免疫未攻蟲組外,每只雞經(jīng)嗉囊灌服感染2×104個(gè)柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊或1×104個(gè)毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊。免疫途徑為胸部皮下注射。

表2 rEnApiAP2與rEtGAM聯(lián)合免疫試驗(yàn)設(shè)計(jì)和免疫程序Table 2 Experimental design and immune program of rEnApiAP2 combination with rEtGAM

1.5 臨床觀察與血便計(jì)數(shù)

每天觀察雞的精神狀態(tài)、食欲、糞便、發(fā)病和死亡情況。攻蟲后若出現(xiàn)血便,則每隔12 h計(jì)算每組的血便堆數(shù)。若雞發(fā)生死亡,則對(duì)死亡雞進(jìn)行稱重,并且剖檢觀察病變情況,以確定是否死于球蟲病。

1.6 卵囊計(jì)數(shù)與腸道病變記分

攻蟲后第5天開始用飽和鹽水漂浮法糞檢卵囊,查見卵囊后每隔12 h收集每組雞的全部糞便,用MacMaster法[12]計(jì)算糞便中的卵囊數(shù),直至攻蟲后第8天。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(攻蟲后第8天)各試驗(yàn)組雞逐只稱重并進(jìn)行剖殺剖檢,取盲腸或小腸進(jìn)行病變記分,并對(duì)盲腸中卵囊進(jìn)行計(jì)數(shù)。最后計(jì)算各組雞的卵囊排出總量。

1.7 免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)指標(biāo)

(1)成活率(%)=(存活雞數(shù)量÷試驗(yàn)雞數(shù)量)×100%。

(2)平均增重ΔW免疫階段=W21 d-W7 d;ΔW攻蟲階段=W29 d-W21 d;相對(duì)增重率RWGR=ΔW試驗(yàn)組/ΔW未免疫未攻蟲組×100%,其中RWGR1=ΔW免疫組免疫階段/ΔW未免疫未攻蟲組×100%,RWGR2=ΔW免疫組攻蟲階段/ΔW未免疫未攻蟲組×100%。

(3)卵囊值與卵囊減少率:各試驗(yàn)組雛雞攻蟲后鏡檢檢測(cè)糞便中卵囊的排出情況,發(fā)現(xiàn)未免疫攻蟲組開始排出卵囊后,每24 h收集1次糞便樣本,用MacMaster法對(duì)糞便中的卵囊進(jìn)行計(jì)數(shù),直至攻蟲后第8天。卵囊值參照索勛[1]的方法計(jì)算,當(dāng)免疫組排出的總卵囊量與未免疫攻蟲組之比為0～1%時(shí),卵囊值記為0;1%～25%時(shí),卵囊值記為5;26%～50%時(shí),卵囊值記為10;51%～75%時(shí),卵囊值記為20;76%～100%時(shí),卵囊值記為40。卵囊減少率=[(未免疫攻蟲組卵囊數(shù)-免疫攻蟲組卵囊數(shù))/未免疫攻蟲組卵囊數(shù)]×100%。

(4)柔嫩艾美耳球蟲的病變記分標(biāo)準(zhǔn)[13]:無肉眼可見病變,記0分;盲腸壁有極少量散在點(diǎn)狀出血斑,腸壁不增厚,內(nèi)容物正常,記1分;病變數(shù)量較多,盲腸內(nèi)容物明顯帶血,盲腸壁稍增厚,記2分;盲腸內(nèi)出血量多或有盲腸核(血凝塊或灰白色干酪樣的香蕉型塊狀物),盲腸壁肥厚明顯,盲腸中糞便含量少,記3分;盲腸內(nèi)充滿大量血液或腸芯并腫大,腸芯中含有糞渣,記4分;雞死于球蟲病記4分。

(5)毒害艾美耳球蟲病變記分標(biāo)準(zhǔn)[13]:無肉眼可見病變,記0分;小腸中部有散在針點(diǎn)狀出血點(diǎn)或白色斑點(diǎn),黏膜損傷不明顯,記1分;小腸中段有多量的出血點(diǎn),可見中部腸管稍充氣,記2分;小腸腔有大量出血,漿膜面見有紅色或白色斑點(diǎn),黏膜面粗糙增厚,腸內(nèi)容物減少,腸壁增厚但長度明顯縮小,記3分;小腸因嚴(yán)重出血呈暗紅色、褐色,大部分腸管氣脹明顯,黏膜增厚加劇,腸腔內(nèi)充滿血液和黏膜組織碎片,漿膜面有白色或紅色病灶,記4分;雞死于球蟲病記4分。

(6)抗球蟲指數(shù)(ACI):按文獻(xiàn)[14]方法計(jì)算,即:ACI=(存活率+RWGR2)-(病變值+卵囊值),其中病變值為每組的平均病變記分×10。ACI值在120～160之間為抗球蟲低效,在160～180為中效,大于180為高效。

1.8 體液免疫水平檢測(cè)

分別在14日齡和21日齡,每組隨機(jī)選取5只雞翅下采血1 mL并分離血清,參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行間接ELISA方法檢測(cè)抗體水平。

1.8.1 rEnApiAP2不同劑量免疫試驗(yàn) 純化復(fù)性的重組蛋白rEnApiAP2用碳酸鹽緩沖液稀釋,包被于96孔板中,每孔1 μg/100 μL,4 ℃過夜。包被后按“1.8.3”進(jìn)行檢測(cè)。

1.8.2 rEnApiAP2與rEtGAM聯(lián)合免疫試驗(yàn) 純化復(fù)性后的重組蛋白rEnApiAP2、rEtGAM56和rEtGAM59按質(zhì)量比1∶1∶1混合后用碳酸鹽緩沖液稀釋,包被于96孔板中,每孔1 μg/100 μL,4 ℃過夜。包被后按“1.8.3”進(jìn)行檢測(cè)。

1.8.3 抗體檢測(cè) PBST洗滌3次,每孔用200 μL 10 g·L-1的BSA溶液37 ℃封閉1 h;PBST洗滌3次,每孔加100 μL按1∶200倍稀釋待檢血清,37 ℃孵育1 h;PBST洗滌3次,每孔加100 μL按1∶10 000倍稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗雞IgG,37 ℃孵育1 h;PBST洗滌3次,每孔加100 μL的TMB底物顯色液,37 ℃孵育10 min;顯色后立即加入50 μL 2 mol·L-1H2SO4溶液終止反應(yīng),酶標(biāo)儀測(cè)定OD450 nm值。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用IBM SPSS Statistics 23軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行一維方差描述性統(tǒng)計(jì)分析,并用鄧肯(Duncan)氏新復(fù)極差法[15]對(duì)組間平均值進(jìn)行多重比較(P<0.05)。

2 結(jié) 果

2.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定

將重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-EnApiAP2、pET28a(+)-EtGAM56和pET28a(+)-EtGAM59分別轉(zhuǎn)化BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá),純化后經(jīng)SDS-PAGE分析,重組蛋白大小分別約為74、56、61.2 ku,與預(yù)期相符(見圖1A、B)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,三種重組蛋白均能被6×His標(biāo)簽單克隆抗體識(shí)別(見圖1C～E)。

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～3. 純化復(fù)性的rEnApiAP2、rEnGAM59和rEnGAM56; 4～6.Western blot鑒定rEnApiAP2、rEnGAM56和rEnGAM59M. Protein marker; 1-3.The purification and renaturation of rEnApiAP2, rEnGAM59, and rEnGAM56; 4-6. Western blot analysis of rEnApiAP2, rEnGAM56, and rEnGAM59圖1 重組蛋白的SDS-PAGE分析(A、B)和Western blot鑒定(C～E)Fig.1 The SDS-PAGE (A, B) and Western blot (C-E) analysis of rEnApiAP2, rEnGAM56 and rEnGAM59

2.2 臨床觀察

rEnApiAP2不同劑量免疫試驗(yàn):攻蟲后第132小時(shí)觀察,除未免疫未攻蟲組外,其余各組雞均排出血便,并出現(xiàn)食欲減退、飲水減少、縮頭呆立等癥狀。攻蟲后第168小時(shí),雞群精神狀態(tài)和食欲逐漸恢復(fù),血便數(shù)下降,直至攻蟲后192 h,各組雞群已無血便排出。與未免疫攻蟲組相比,各免疫組雞的癥狀均較輕。各組排出的血便總數(shù)分別為:重組蛋白高劑量組39堆,重組蛋白中劑量組26堆,重組蛋白低劑量組18堆,未免疫攻蟲組48堆。未免疫未攻蟲組無血便出現(xiàn)。各試驗(yàn)組雞均未發(fā)生死亡,成活率均為100%。

rEnApiAP2與rEtGAM聯(lián)合免疫試驗(yàn):各試驗(yàn)組均無病死的雞,成活率均為100%,未免疫未攻蟲組無血便出現(xiàn);用柔嫩艾美耳球蟲攻蟲后第96小時(shí)左右,各組雞陸續(xù)排出血便,并出現(xiàn)食欲減退、飲水減少、縮頭呆立等癥狀。攻蟲后第180小時(shí)各組雞的精神狀態(tài)和食欲逐漸恢復(fù),血便數(shù)下降,與未免疫攻蟲組相比各免疫組癥狀均輕。各組排出的血便總數(shù)分別為:rEnApiAP2組99堆,rEtGAM56組92堆,rEtGAM59組59堆,rEnApiAP2+rEtGAM56組89堆,rEnApiAP2+rEtGAM59組72堆,未免疫攻蟲組117堆。用毒害艾美耳球蟲攻蟲后第132小時(shí)左右,各組雞陸續(xù)排出血便,并出現(xiàn)食欲減退、飲水減少、縮頭呆立等癥狀。攻蟲后第180小時(shí)雞群精神狀態(tài)和食欲逐漸恢復(fù),血便數(shù)下降。與未免疫攻蟲組相比,各免疫組雞的癥狀均輕。各組排出的血便總數(shù)分別為:rEnApiAP2組21堆,rEtGAM56組32堆,rEtGAM59組18堆,rEnApiAP2+rEtGAM56組27堆,rEnApiAP2+rEtGAM59組19堆,未免疫攻蟲組55堆。

2.3 平均增重、相對(duì)增重率與病變記分

rEnApiAP2不同劑量免疫試驗(yàn)(見表3):在免疫階段,各試驗(yàn)組雞的平均增重?zé)o顯著差異(P>0.05)。攻蟲階段,各免疫組雞的平均增重差異不顯著(P>0.05),但均顯著高于未免疫攻蟲組(P<0.05),其中重組蛋白高劑量組和中劑量組均顯著低于未免疫未攻蟲組(P<0.05)。重組蛋白低劑量組相對(duì)增重率最高(82.36%),且平均腸道病變記分最低,顯著低于未免疫攻蟲組(P<0.05)。在免疫組中,重組蛋白高劑量組的平均腸道病變記分最高。

表3 rEnApiAP2不同劑量免疫試驗(yàn)中各組的增重、相對(duì)增重率和腸道病變記分Table 3 Weight gain, relative weight growth and lesion score of each group immunized with different dosages of rEnApiAP2

rEnApiAP2與rEtGAM聯(lián)合免疫試驗(yàn)(見表4):在免疫階段,各試驗(yàn)組雞的平均增重?zé)o顯著差異(P>0.05)。攻蟲階段,柔嫩艾美耳球蟲攻蟲組中,rEtGAM59組和rEnApiAP2+rEtGAM59組的平均增重均顯著高于未免疫攻蟲組(P<0.05),各免疫組與未免疫攻蟲組的平均增重均顯著低于未免疫未攻蟲組(P<0.05);毒害艾美耳球蟲攻蟲組中,各免疫組間雞的平均增重差異不顯著(P>0.05),但各免疫組雞的平均增重顯著高于未免疫攻蟲組(P<0.05),顯著低于未免疫未攻蟲組(P<0.05)。在柔嫩艾美耳球蟲攻蟲組間比較,rEtGAM59組相對(duì)增重率最高(84.88%)。免疫組的平均腸道病變記分均小于未免疫攻蟲組,其中rEnApiAP2+rEtGAM59組的平均腸道病變記分最低,顯著低于未免疫攻蟲組(P<0.05);在毒害艾美耳球蟲攻蟲組間比較,rEtGAM59組相對(duì)增重率最高(91.26%)。免疫組的平均腸道病變記分均小于未免疫攻蟲組,其中rEtGAM56組和rEnApiAP2+rEtGAM56組的平均腸道病變記分最低,顯著低于未免疫攻蟲組(P<0.05)。

表4 rEnApiAP2與rEtGAM聯(lián)合免疫試驗(yàn)中各組的增重、相對(duì)增重率和腸道病變記分Table 4 Weight gain, relative weight growth and lesion score of each group immunized with rEnApiAP2 combination with rEtGAM

2.4 卵囊產(chǎn)量與卵囊減少率

rEnApiAP2不同劑量免疫試驗(yàn)(見表5):未免疫攻蟲組,每只雞排出卵囊量為2.68×107個(gè)。各免疫組的卵囊產(chǎn)量均低于未免疫攻蟲組,其中重組蛋白低劑量組的卵囊減少率最高(73.88%),其次為重組蛋白高劑量組(35.45%),重組蛋白中劑量組最低(21.27%)。

表5 rEnApiAP2不同劑量免疫試驗(yàn)中各組的卵囊產(chǎn)量與卵囊減少率Table 5 The oocyst output and reduction rates of each group with different dosages of rEnApiAP2

rEnApiAP2與rEtGAM聯(lián)合免疫試驗(yàn)(見表6):各免疫組的卵囊產(chǎn)量均低于未免疫攻蟲組;在柔嫩艾美耳球蟲攻蟲組間比較,rEtGAM59組卵囊減少率最高(51.23%),rEnApiAP2+rEtGAM59組稍次(29.64%),rEnApiAP2+rEtGAM56組最低(20.49%)。在毒害艾美耳球蟲攻蟲組間比較,rEtGAM56組卵囊減少率最高(64.38%),rEnApiAP2+rEtGAM56組稍次(51.13%),rEtGAM59組最低(13.09%)。

表6 rEnApiAP2與rEtGAM聯(lián)合免疫試驗(yàn)中各組的卵囊產(chǎn)量與卵囊減少率Table 6 The oocyst output and reduction rates of each group immunized with rEnApiAP2 combination with rEtGAM

2.5 抗球蟲指數(shù)

rEnApiAP2不同劑量免疫試驗(yàn)(見表7):重組蛋白低劑量組的ACI值最高(155.26),接近抗球蟲中效水平,其次為重組蛋白高劑量組(133.73),屬抗球蟲低效水平。重組蛋白中劑量組的ACI值為117.30屬抗球蟲無效水平。未免疫攻蟲組的ACI值為101.77。

表7 rEnApiAP2不同劑量免疫試驗(yàn)中各組的抗球蟲指數(shù)Table 7 The anti-coccidial index of each group immunized with different dosages of rEnApiAP2

rEnApiAP2與rEtGAM聯(lián)合免疫試驗(yàn)(見表8):在柔嫩艾美耳球蟲攻蟲組間比較,rEtGAM59組的雞抗球蟲指數(shù)最高(151.88),接近抗球蟲中效水平;其次為rEnApiAP2+rEtGAM59組,ACI值為141.62,屬抗球蟲低效水平;rEnApiAP2+rEtGAM56組最低,為115.46,其余組ACI值接近130;在毒害艾美耳球蟲攻蟲組間比較,rEnApiAP2+rEtGAM56組的抗球蟲指數(shù)最高(169.83),屬于抗球蟲中效水平,其次為rEtGAM56組,ACI值為165.48;余下免疫組的ACI值均接近155,rEtGAM59組的ACI值最低,為139.26。

表8 rEnApiAP2與rEtGAM聯(lián)合免疫試驗(yàn)中各組的抗球蟲指數(shù)Table 8 The anti-coccidial index of each group immunized with rEnApiAP2 combination with rEtGAM

2.6 血清特異性抗體水平

rEnApiAP2不同劑量免疫試驗(yàn)(見圖2):用間接ELISA法檢測(cè)14日齡與21日齡各試驗(yàn)組雞的血清特異性抗體水平。在14日齡(圖2A),各免疫組雞的血清特異性抗體水平均顯著高于未免疫攻蟲組和未免疫未攻蟲組(P<0.05),高劑量和中劑量免疫組的抗體水平又顯著高于低劑量免疫組(P<0.05)。在21日齡(圖2B),各免疫組雞的血清特異性抗體水平明顯升高;同樣,各免疫組雞的血清特異性抗體水平均顯著高于未免疫攻蟲組和未免疫未攻蟲組(P<0.05),但高劑量免疫組的抗體水平顯著高于中劑量免疫組、中劑量免疫組又顯著高于低劑量免疫組(P<0.05)。

A. 14日齡血清特異性抗體水平;B. 21日齡血清特異性抗體水平。*** 表示差異極其顯著(P<0.001)A. Serum specific antibody level of 14-day-old; B. Serum specific antibody level of 21-day-old.*** indicates exceedingly significant difference (P<0.001)圖2 rEnApiAP2不同劑量免疫試驗(yàn)各組雞血清特異性抗體水平Fig.2 Antibody level of each group immunized with different dosages of rEnApiAP2

rEnApiAP2與rEtGAM聯(lián)合免疫試驗(yàn)(見圖3):用間接ELISA法檢測(cè)14日齡、21日齡各組雞的血清特異性抗體水平。在14日齡(圖3A),各免疫組雞的血清特異性抗體水平均顯著高于未免疫攻蟲組和未免疫未攻蟲組(P<0.05);rEtGAM56組特異性抗體水平又顯著高于其他免疫組,rEnApiAP2組的特異性抗體水平顯著低于其余免疫組(P<0.05)。余下免疫組的特異性抗體水平相接近。在21日齡(圖3B),各免疫組雞的血清特異性抗體水平明顯升高;同樣,各免疫組雞的血清特異性抗體水平均顯著高于未免疫攻蟲組和未免疫未攻蟲組(P<0.05);在各免疫組,rEtGAM56組顯著高于其余免疫組,rEnApiAP2組顯著低于其余免疫組(P<0.05)。余下免疫組的特異性抗體水平相接近。

A. 14日齡血清特異性抗體水平;B. 21日齡血清特異性抗體水平。*表示差異顯著(P<0.05);***表示差異極其顯著(P<0.001)A. Serum specific antibody level of 14-day-old; B. Serum specific antibody level of 21-day-old. * indicates significant difference (P<0.05);*** indicates exceedingly significant difference (P<0.001)圖3 rEnApiAP2與rEtGAM聯(lián)合免疫試驗(yàn)中各組雞血清特異性抗體水平Fig.3 Antibody level of each group immunized with rEnApiAP2 combination with rEtGAM

3 討 論

近年來隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展以及7種艾美耳球蟲基因組測(cè)序工作的完成,大大加快了亞單位疫苗的研發(fā)進(jìn)程。目前已從7種雞艾美耳球蟲的不同發(fā)育階段分離與克隆了數(shù)十種保護(hù)性抗原,并對(duì)其中的部分重組抗原(如AMA-1、cSZ-JN1、cSZ-JN2、EF-1α、Em6、Em8、EMHP-1、EMHP-2、EmCKRS、EmJS-1、Em14-3-3、EMRP、EmSAG、EtMIC1、EtMIC2、Gam82、GAPDH、IMPI、LDH、MICs、MIF、NA-4、NPmz19、rEtSO7和TA4等)的免疫保護(hù)力進(jìn)行了觀察[16]。這些抗原免疫雞群可以獲得部分的免疫保護(hù)作用,但距臨床實(shí)際要求還有較大的差距,其原因可能是單一抗原免疫產(chǎn)生的免疫保護(hù)力弱,因此用兩種或以上抗原聯(lián)合免疫可能會(huì)產(chǎn)生更有效的免疫保護(hù)作用[17]。

球蟲配子體蛋白是卵囊壁的前體蛋白,參與卵囊壁的形成[18]。柔嫩艾美耳球蟲配子體蛋白基因有Etgam22、Etgam56和Etgam59三種。朱玉蘭[11]克隆、原核表達(dá)了Etgam59基因,對(duì)重組蛋白進(jìn)行了雛雞免疫保護(hù)試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)100 μg劑量的免疫效果最好,相對(duì)增重率55.89%～56.92%,卵囊減少率46.74%～58.98%。劉悅[10]克隆、原核表達(dá)了Etgam56基因,對(duì)重組蛋白的雛雞免疫保護(hù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)200 μg劑量的免疫效果最好,相對(duì)增重率62.99%,卵囊減少率50.37%。王禮躍等[9]觀察了rEtGAM22、rEtGAM56和rEtGAM59分別單獨(dú)免疫或聯(lián)合免疫對(duì)柔嫩艾美耳球蟲和毒害艾美耳球蟲的免疫保護(hù)力,結(jié)果顯示單獨(dú)免疫時(shí)rEtGAM22免疫保護(hù)力均低于rEtGAM56和rEtGAM59,故在本研究中沒選用rEtGAM22,且重組蛋白rEtGAM59和rEtGAM56的單免劑量分別設(shè)置為100和200 μg,聯(lián)合免疫劑量減半,分別為50和100 μg。

因重組蛋白rEnApiAP2的免疫保護(hù)力尚不明確,為此本研究首先通過動(dòng)物試驗(yàn)比較了rEnApiAP2不同劑量免疫雛雞對(duì)毒害艾美耳球蟲的保護(hù)力,結(jié)果顯示低劑量組(50 μg/雞)病變記分最低、平均增重和卵囊減少率最高,其ACI值(155.26)接近抗球蟲中效水平。隨后選擇50 μg為rEnApiAP2的免疫劑量,分別與rEtGAM56或rEtGAM59聯(lián)合免疫雛雞,同時(shí)設(shè)置3種重組蛋白的單免組,分別比較聯(lián)合免疫與單免對(duì)毒害艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲的免疫保護(hù)力。結(jié)果顯示rEnApiAP2與rEtGAM聯(lián)免對(duì)毒害艾美耳球蟲的保護(hù)效力要好于單免,其中rEnApiAP2與rEtGAM56聯(lián)免組的ACI值最高,達(dá)169.83;在對(duì)柔嫩艾美耳球蟲的保護(hù)效力中,聯(lián)免組的保護(hù)力反而低于相應(yīng)的rEtGAM56或rEtGAM59單免組,同樣,王禮躍等[9]觀察到rEtGAM56與rEtGAM59聯(lián)免組的抗柔嫩艾美耳球蟲ACI值(148.85)反而低于rEtGAM59單免組(159.47),rEtGAM22與rEtGAM56聯(lián)免組的抗毒害艾美耳球蟲ACI值(127.19)也低于rEtGAM56單免組(155.70)。因此,其可能原因是免疫劑量減半所致,這有待進(jìn)一步探析。兩次試驗(yàn)中50 μg rEnApiAP2組的抗毒害艾美耳球蟲ACI值相近,顯示該重組蛋白對(duì)毒害艾美耳球蟲有較強(qiáng)的免疫保護(hù)力。

在遺傳學(xué)上柔嫩艾美耳球蟲與毒害艾美耳球蟲親緣關(guān)系最近,兩者的gam56和gam59基因相似性分別達(dá)87.9%和93.4%,Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示重組蛋白rEtGAM56和rEtGAM59可被毒害艾美耳球蟲感染的雞康復(fù)血清特異性識(shí)別,具有良好的交叉反應(yīng)原性[10-11]。同樣,兩者的ApiAP2基因相似性為90.4%,重組蛋白rEnApiAP2可被柔嫩艾美耳球蟲感染的雞康復(fù)血清特異性識(shí)別[8]。因此,rEtGAM和rEnApiAP2均有一定的雞球蟲種間的交叉免疫保護(hù)力,但rEnApiAP2對(duì)毒害艾美耳球蟲的免疫保護(hù)力明顯大于對(duì)柔嫩艾美耳球蟲的免疫保護(hù)力。rEtGAM56和rEtGAM59對(duì)毒害艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲的免疫保護(hù)力正好相反,前者對(duì)毒害艾美耳球蟲的免疫保護(hù)力要大,后者對(duì)柔嫩艾美耳球蟲的免疫保護(hù)力要大,這與王禮躍等[9]的報(bào)道相一致。

雞球蟲病亞單位疫苗CoxAbic?由巨型艾美耳球蟲的天然配子體抗原GAM230、GAM82和GAM56組成,其中GAM82與GAM56與卵囊壁形成有關(guān)[4]。母雞免疫該疫苗后可產(chǎn)生大量母源抗體,并通過卵黃傳遞給子代。子代體內(nèi)的高水平抗體可以抑制巨型艾美耳球蟲發(fā)育,并將卵囊產(chǎn)量減少60%～80%,從而阻斷球蟲病的傳播[19]。本文用間接ELISA法分別檢測(cè)各試驗(yàn)組雞二免前和攻蟲前血清特異性抗體水平,均檢查到血清特異性抗體水平顯著升高。用不同劑量rEnApiAP2免疫雛雞,雞血清特異性抗體水平隨免疫劑量增加而升高,但血清抗體水平與ACI值不一致,這一現(xiàn)象與Jang等[20]的報(bào)道相似,后者分別用60 μg和30 μg重組蛋白rEnGAM82免疫雞群,發(fā)現(xiàn)30 μg免疫組的保護(hù)效果更好。因此,rEnApiAP2蛋白的免疫保護(hù)性機(jī)制有待進(jìn)一步研究。重組蛋白聯(lián)合免疫2次后,免疫組雞血清特異性抗體水平升高約1倍,免疫rEnApiAP2組的血清特異性抗體水平顯著低于rEtGAM56組和rEtGAM59組,其ACI值(128.37、156.29)低于rEtGAM56組(130.12、165.48)、高于或低于rEtGAM59組(151.88、139.26)。由此可見,雞血清特異性抗體水平與ACI值無相關(guān)性。

4 結(jié) 論

重組蛋白rEnApiAP2以50 μg免疫劑量的保護(hù)效果最好,抗毒害艾美耳球蟲效果接近中效水平;rEnApiAP2與rEtGAM聯(lián)合免疫可提高抗毒害艾美耳球蟲的免疫保護(hù)效力,其中rEnApiAP2與rEtGAM56聯(lián)免抗毒害艾美耳球蟲效果達(dá)抗球蟲中效水平。本研究為雞球蟲病重組亞單位疫苗的研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。