羅曉琴,郭志廷,王 賀,張景艷,張 康,王 磊,馬永華,李建喜,*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,蘭州 730070;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心,蘭州 730050)

雞球蟲病是一種嚴(yán)重危害家禽養(yǎng)殖的腸道寄生蟲病。雞球蟲在國內(nèi)外公認(rèn)的有7個種,其中,柔嫩、毒害、巨型和堆型艾美耳球蟲的感染性比較強(qiáng)[1]。臨床上往往是幾種球蟲的混合感染,感染后引起雞腸道組織損傷,導(dǎo)致消化功能紊亂、脫水、失血并繼發(fā)感染細(xì)菌性疾病[2-3]。以往抗生素和化學(xué)合成抗球蟲藥物是防治雞球蟲病的主要途徑,隨著球蟲耐藥性和藥物殘留的日趨嚴(yán)重,以及綠色健康養(yǎng)殖的逐步實(shí)施,迫切需要研發(fā)新型抗球蟲藥物[4-5]。

中藥常山為虎耳草科植物的干燥根,別名黃常山、雞骨常山、雞骨風(fēng)、風(fēng)骨木等,分布于陜西、湖南、甘肅、安徽、湖北等地[6-8]?！侗静菥V目》中記載:“常山有截痰截瘧之功”,在民間主要用于治療瘧疾?，F(xiàn)代研究表明,常山具有抗瘧疾、抗球蟲、抗腫瘤、抗瘢痕等廣泛的藥理活性[9]。利用現(xiàn)代中藥提取分離技術(shù),從中藥常山中將有效成分常山堿充分提取出來,制成常山口服液,并用于防治雞球蟲病。依據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第1596號公告《獸用中藥、天然藥物臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》和第2337號公告《獸藥臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范》的相關(guān)規(guī)定,開展試驗(yàn)感染雞治療效果和臨床病例治療效果的分析,旨在驗(yàn)證常山口服液的抗球蟲療效、最佳給藥劑量和給藥時間,為今后申報(bào)新獸藥和防治雞球蟲病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

常山口服液中試產(chǎn)品(500 mL·瓶-1,批號15090501),石家莊正道動物藥業(yè)有限公司生產(chǎn),推薦劑量是5 mL·L-1飲水給藥。百球清(妥曲珠利溶液,含量2.5%)為對照藥物,購自拜耳(四川)動物保健有限公司,按1 mL·L-1飲水給藥。

1.2 試驗(yàn)蟲株

柔嫩艾美耳球蟲廣東株(1996年分離自廣東花都),由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所禽病研究室保存和提供[10]。

1.3 試驗(yàn)動物和飼料

1日齡AA黃羽肉雞,購自蘭州市某種雞場,飼養(yǎng)于無雞球蟲污染籠舍內(nèi);飼料為肉小雞全價料,不含任何抗球蟲藥物,購自蘭州養(yǎng)動力飼料有限公司。

1.4 試驗(yàn)感染雞治療效果分析

1.4.1 動物分組與處理 1日齡健康雛雞,在無球蟲感染條件下飼養(yǎng)至16日齡,隨機(jī)分為6組,包括健康對照組、感染對照組、妥曲珠利對照組、常山口服液低中高劑量組,每組20只雞。除健康對照組外,其余各組每只雞經(jīng)口感染6×104個柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊(攻蟲前2個月健康雛雞復(fù)壯,以保證蟲株感染活力),攻蟲24 h后開始給藥,每天觀察各組試驗(yàn)雞的精神狀態(tài)、飲食飲水和血便情況。如有死亡雞,應(yīng)及時進(jìn)行解剖,觀察各臟器病理變化。具體分組與處理見表1。

1.4.2 抗球蟲效果評判標(biāo)準(zhǔn) 試驗(yàn)前(16日齡)和試驗(yàn)結(jié)束(24日齡),每組雞稱重,計(jì)算平均增重。試驗(yàn)結(jié)束(24日齡)全部捕殺,收集盲腸,縱向剪開后對每對盲腸按Johnson與Reid(1970)的方法進(jìn)行病變計(jì)分,收集盲腸內(nèi)容物進(jìn)行球蟲卵囊計(jì)數(shù)。根據(jù)各組試驗(yàn)雞的相對增重率、存活率、病變值和卵囊值,按照美國Merck公司的計(jì)算公式,計(jì)算抗球蟲指數(shù)(ACI)[11-13]。

ACI=(相對增重率+存活率)×100 -(病變值+卵囊值)

以ACI來判定藥效:ACI<120 為無效;ACI=120～160為低效;ACI=160～180為良好;ACI>180為高效。

1.5 臨床病例治療效果分析

1.5.1 動物分組和處理 選取自然感染球蟲的病雞開展本試驗(yàn)。經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查、臨床診斷、死亡雞剖解、糞便中球蟲卵囊檢查診斷為雞球蟲病。所有病例的畜主均同意參加試驗(yàn)并按照本方案進(jìn)行治療。依據(jù)常山口服液抗球蟲預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,確定其臨床推薦劑量為5 mL·L-1飲水[14],具體分組與處理見表2。

表2 試驗(yàn)雞分組與處理Table 2 Grouping and treatment of the chick

1.5.2 療效判定 根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

治愈:用藥后臨床癥狀消失,血便停止,精神及采食量恢復(fù)正常,7 d后糞檢無卵囊,判為治愈,每組治愈雞數(shù)占每組試驗(yàn)雞總數(shù)的百分率為治愈率。

有效:用藥后臨床癥狀減輕,血便減少,精神及采食量基本恢復(fù)正常判為有效,每組治愈雞數(shù)加上有效數(shù)占每組試驗(yàn)雞總數(shù)的百分率為有效率。

無效:用藥后臨床癥狀未見任何減輕,血便沒有減少,甚至加重或死亡,判為無效。

1.5.3 組織病理學(xué)檢查 試驗(yàn)結(jié)束后,常山口服液組、妥曲珠利組和感染對照組經(jīng)尸體解剖學(xué)檢查的部分試驗(yàn)雞,采集盲腸,10%甲醛溶液固定,制作石蠟組織切片,HE染色,觀察組織病理學(xué)變化,在顯微鏡下觀察雞盲腸上皮細(xì)胞形態(tài)變化、炎癥細(xì)胞浸潤等情況,并和健康對照組進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1 試驗(yàn)感染雞治療效果分析

2.1.1 臨床癥狀 結(jié)果顯示,感染對照組試驗(yàn)雞攻蟲后4～5 d,開始出現(xiàn)臨床癥狀,包括精神不振、飲食欲減退、羽毛蓬亂,病雞排出血便。但常山口服液中、高劑量組和妥曲珠利對照組試驗(yàn)雞臨床癥狀明顯減輕或消失,無血便排出。健康對照組試驗(yàn)雞精神狀態(tài)和飲食均正常。

2.1.2 盲腸剖解變化 結(jié)果顯示,感染對照組試驗(yàn)雞盲腸明顯腫脹,內(nèi)容物中血液較多。常山口服液中、高劑量組和妥曲珠利對照組試驗(yàn)雞盲腸腫脹明顯減輕,內(nèi)容物中血液明顯減少。健康對照組試驗(yàn)雞盲腸無腫脹和內(nèi)容物無血液(圖1)。

A. 健康對照組;B. 感染對照組;C. 妥曲珠利組;D. 常山口服液低劑量組;E. 常山口服液中劑量組;F. 常山口服液高劑量組A. Healthy control group; B. Infection control group; C. Toltrazuril group; D. Low dose CSL group; E. Medium dose CSL group; F. High dose CSL group圖1 試驗(yàn)雞盲腸病理變化Fig.1 Pathological changes of chicken cecum

2.1.3 抗球蟲效果 結(jié)果顯示,常山口服液中、高劑量組試驗(yàn)雞的相對增重率(101.6%和119.8%)和存活率(100%)均高于妥曲珠利組和攻蟲不給藥組。但妥曲珠利組試驗(yàn)雞的病變值(22.5)和卵囊值(10)均低于常山口服液各劑量組。通過相對增重率、存活率、病便值和卵囊值計(jì)算抗球蟲指數(shù),結(jié)果表明,常山口服液中、高劑量組抗球蟲指數(shù)分別為166.6和173.8(表3和4)。

表3 相對增重率(n=20)Table 3 Relative weight gain rate (n=20)

表4 抗球蟲指數(shù)Table 4 Anticoccidial index

2.2 臨床病例治療效果分析

2.2.1 病例納入情況 試驗(yàn)雞品種:清遠(yuǎn)麻雞,存欄量:20 000羽,試驗(yàn)地點(diǎn):云南省石林縣板橋。臨床癥狀:51日齡雞群有血便,剖檢盲腸內(nèi)有血液,小腸有點(diǎn)狀出血,腸管充氣腫脹,51日齡開始每天死亡10～20只。實(shí)驗(yàn)室檢查:病雞糞便中檢出大量雞球蟲卵囊(圖2)。

A.病雞排出血便;B.病雞盲腸腫脹;C.糞便中檢出球蟲卵囊A. Bloody excrement; B. Swelling cecum; C. Coccidium oocysts in the excrement圖2 臨床癥狀、剖解變化和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果Fig.2 Clinical signs, anatomical changes and laboratory determination

2.2.2 臨床病例治療效果分析 參照雞球蟲病診斷標(biāo)準(zhǔn),將“2.2.1”中發(fā)病初期的病雞隨機(jī)挑出1 000只(51日齡),開展本試驗(yàn),試驗(yàn)分組和處置見表2。結(jié)果表明,常山口服液和妥曲珠利給藥后第1天,試驗(yàn)組雞每天死亡2～3只;給藥后第2天,試驗(yàn)組雞死亡停止,血便明顯減少,采食量提升;給藥后第3天,試驗(yàn)雞血便排出停止;給藥后第4天,病雞臨床表現(xiàn)基本恢復(fù)正常?？瞻讓φ战M病雞死亡數(shù)隨時間呈上升趨勢。具體治療結(jié)果見表5。

表5 常山口服液治療結(jié)果Table 5 Therapeutic effect of CSL

2.2.3 盲腸組織病理學(xué)結(jié)果 結(jié)果表明,健康對照組雞盲腸結(jié)構(gòu)完整,盲腸上皮細(xì)胞形態(tài)良好,可見大量杯狀細(xì)胞。感染對照組雞盲腸肌肉厚度和隱窩深度增加,盲腸上皮細(xì)胞內(nèi)可見較多球蟲配子或卵囊,組織內(nèi)有大量炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤,杯狀細(xì)胞明顯減少。常山口服液組和妥曲珠利組雞盲腸結(jié)構(gòu)基本完整,隱窩深度、肌層和漿膜厚度與健康組比較增加不明顯,杯狀細(xì)胞數(shù)量減少(圖3)。

A. 健康對照組;B. 感染對照組;C. 常山口服液組;D. 妥曲珠利組A. Healthy control group; B. Infection control group; C. CSL group; D. Toltrazuril group圖3 雞盲腸組織病理學(xué)變化(100×)Fig.3 Histopathological changes of chick cecum (100×)

3 討 論

隨著現(xiàn)代肉雞養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；?、集約化的快速發(fā)展,球蟲病的危害也日益加重,其中柔嫩、堆型、巨型艾美耳球蟲危害最為嚴(yán)重。球蟲病的暴發(fā)會導(dǎo)致雞生長受阻、飼料轉(zhuǎn)化率降低和肉蛋品質(zhì)下降,全世界每年由于該病造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)30億元[15-16]。目前雞球蟲病的防治主要依靠化學(xué)合成藥物(如妥曲珠利、地克珠利、常山酮、磺胺類藥等),以上藥物的使用降低了雞球蟲病的危害,但也引起耐藥蟲株的不斷出現(xiàn),同時藥物殘留導(dǎo)致的食品安全問題也引起了人們的高度關(guān)注[17-18]。

中藥防治雞球蟲病的作用機(jī)理與西藥不同,西藥是直接抑殺球蟲,而對于球蟲引起患病雞腸道損傷和全身臨床癥狀無明顯的治療作用,而中藥是依據(jù)中獸醫(yī)藥理論,在對球蟲病辯證的基礎(chǔ)上進(jìn)行合理組方,不僅可以有效抑殺球蟲,還能修復(fù)損傷的腸道,減輕臨床癥狀[19-20]。結(jié)果表明,中藥復(fù)方(由常山、檳榔、地榆、黃芩等組成)高、中劑量對雞球蟲病有良好的預(yù)防效果,抗球蟲指數(shù)分別為 183.01、183.83[21]。自擬方劑(由青蒿、常山、仙鶴草和地榆組成)同樣對雞球蟲病有良好的治療效果,抗球蟲指數(shù)為170.41,且能有效改善球蟲病雞受損的盲腸組織,加快其腸道功能恢復(fù)[22]。常山紅藤湯(由常山、紅藤、白頭翁、柴胡等組成)對兔球蟲病有較好的治療效果,給藥組病兔臨床表現(xiàn)、腸道病變值、每克糞便卵囊數(shù)均明顯低于陽性對照組,平均增重明顯高于陽性對照組[23]。

常山具有良好的抗球蟲效果,主要有效成分為常山堿甲和乙;但目前國內(nèi)外對于常山堿的分離純化、抗球蟲作用及機(jī)理研究甚少。養(yǎng)雞生產(chǎn)中有直接應(yīng)用常山原粉的防治方法,但雞不能很好地消化纖維素,導(dǎo)致常山堿不能被充分吸收利用,抗球蟲效果大幅降低[24-25]。本課題組利用現(xiàn)代中藥提取分離技術(shù),將常山堿從中藥常山中充分提取出來,制成口服液制劑,具有易吸收、起效快和療效好的特點(diǎn),便于現(xiàn)代規(guī)?；B(yǎng)雞場臨床給藥,更好發(fā)揮抗球蟲作用[26]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明,常山口服液中、高劑量組具有良好的抗球蟲效果,抗球蟲指數(shù)分別為166.6和173.8;且藥物對試驗(yàn)雞具有較好的促生長效果(相對增重率為101.6%、119.8%)。在臨床實(shí)踐中,雞球蟲病多是幾種球蟲混合感染,如柔嫩艾美耳、毒害艾美耳混合引起的球蟲病,臨床上病雞排出番茄樣糞便或血便,剖解盲腸和十二指腸均有出血點(diǎn)。臨床病例治療效果分析表明,常山口服液以5.0 mL·L-1飲水給藥,連續(xù)給藥4 d,可有效治療自然感染球蟲的病雞,治愈率和有效率分別為80.7%和96.7%;病雞一般給藥3 d即可治愈,為了鞏固療效,臨床上多給藥1 d,共計(jì)4 d,取得了良好的防治效果,后期隨訪無復(fù)發(fā)。組織病理學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn),感染對照組雞盲腸上皮細(xì)胞內(nèi)可見較多球蟲配子或卵囊,組織內(nèi)有大量炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤。但常山口服液組和妥曲珠利組雞盲腸結(jié)構(gòu)基本完整,隱窩深度、肌層和漿膜厚度基本正常。

綜合分析以上試驗(yàn)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)常山口服液和妥曲珠利防治雞球蟲病各有所長,前者在促增重方面略勝一籌,這可能和其能夠提高機(jī)體免疫力有關(guān)[27];后者在減輕雞盲腸病變和減少球蟲卵囊方面效果較好(病變值和卵囊值分別為22.5和10.0)。但妥曲珠利是化學(xué)合成藥物,在臨床上使用已有幾十年,臨床上耐藥性和藥物殘留比較嚴(yán)重,本試驗(yàn)中抗球蟲指數(shù)為154.4,可能和其產(chǎn)生耐藥性有關(guān)。

4 結(jié) 論

常山口服液按照5.0 mL·L-1飲水給藥,連用4 d,對人工感染和自然感染的雞球蟲病有較好的治療效果和促增重作用。常山口服液作為一類純中藥制劑,具有綠色環(huán)保、抗球蟲療效好等特點(diǎn),為進(jìn)一步研發(fā)新藥提供了重要的數(shù)據(jù)支撐。