金睿妍,張 陽,黃仲舜,冉 維,丁紅雷

(西南大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物支原體學(xué)實驗室,重慶 400715)

麻旺鴨,因原產(chǎn)于重慶市土家族苗族自治縣麻旺鎮(zhèn)而得名,屬于蛋鴨優(yōu)良品種[1],2000年被當?shù)匦竽莲F醫(yī)局發(fā)現(xiàn)。2009年10月15日,農(nóng)業(yè)部第1278號公告將麻旺鴨確認為國家級畜禽遺傳源。目前,劃定3個麻旺鴨保護區(qū),區(qū)內(nèi)有麻旺鴨核心保種場1個、擴繁場10個、孵抱戶200余個。但是,由于酉陽縣地處武陵山區(qū),距離主城區(qū)較遠,麻旺鴨養(yǎng)殖人員的素質(zhì)整體不高,對麻旺鴨的疫病防控能力欠缺。

作者在麻旺鴨核心保種場調(diào)查發(fā)現(xiàn),現(xiàn)階段麻旺鴨群發(fā)生細菌性疾病的比例較低,但隨著交通運輸逐漸繁忙和人類活動逐漸頻繁,麻旺鴨發(fā)生細菌性傳染病的風險在增大。除了鴨傳染性漿膜炎疫苗,還沒有鴨的其他常發(fā)細菌性疾病疫苗。因此,摸清麻旺鴨群細菌對常見抗菌藥物的敏感性,可以為麻旺鴨細菌性疾病發(fā)生后的治療提供數(shù)據(jù)支撐和技術(shù)儲備。大腸桿菌是鴨腸道的常見細菌。測定大腸桿菌對常用抗菌藥物的敏感性不僅可以為大腸桿菌病的發(fā)生提供用藥指導(dǎo),還可以間接為其他病原菌引起的傳染病提供用藥參考。根據(jù)對重慶市食品動物源腸桿菌科細菌耐藥基因研究顯示,在重慶市食品動物分離的沙門菌廣泛攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因和質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥(plasmid-mediated quinolone resistance,PMQR)基因[2]?；诖?作者想了解麻旺鴨源大腸桿菌是否也廣泛攜帶這兩類耐藥基因。作者在麻旺鴨的核心保種場和3個擴繁場采集了麻旺鴨的肛拭子,從中分離出大腸桿菌,然后測定了分離菌株對25種抗菌藥物的敏感性,同時檢測了分離菌株中β-內(nèi)酰胺酶基因和PMQR基因攜帶情況,以期為麻旺鴨細菌性疾病發(fā)生后的治療提供用藥參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、培養(yǎng)基及參考菌株

BPW培養(yǎng)基、MH肉湯培養(yǎng)基購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司,麥康凱瓊脂培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司,藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司,PowerPol 2×PCR Mix購自武漢愛博泰克(ABclonal)生物科技有限公司,DL2000 DNA marker購自寶生物工程(大連)有限公司。大腸桿菌ATCC?* 25922由西南大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物支原體學(xué)實驗室保存。

1.2 樣品采集與處理

2023年2月,在酉陽縣麻旺鴨核心保種場和3個擴繁場采集泄殖腔拭子樣品,其中,在核心保種場采樣100份,在擴繁場1、擴繁場2、擴繁場3分別采樣15、16、15份。采樣時,用無菌棉簽輕輕刮取鴨泄殖腔,將棉簽折斷置于裝有1 mL BPW液體培養(yǎng)基的2 mL離心管。所有樣品放置于帶冰袋的泡沫箱,12 h內(nèi)運回實驗室。裝有樣品的離心管渦旋振蕩15 s,使樣品在BPW培養(yǎng)基充分分散,取0.1 mL糞便樣品加入10 mL LB液體培養(yǎng)基,37 ℃ 220 r·min-1培養(yǎng)6～12 h。培養(yǎng)的菌液劃線接種麥康凱平板,37 ℃培養(yǎng)18～24 h。挑取有大腸桿菌典型菌落特征的單菌落進行革蘭染色,油鏡下觀察細菌形態(tài)。

1.3 大腸桿菌臨床菌株的PCR檢測

將革蘭染色疑似為大腸桿菌的菌落接種10 mL LB液體培養(yǎng)基,37 ℃ 220 r·min-1搖床培養(yǎng)6～8 h。取1.5 mL菌液置于2 mL滅菌離心管,12 000 r·min-1室溫離心2 min,棄上清;加入1 mL滅菌ddH2O,重懸菌液后12 000 r·min-1室溫離心2 min,棄上清。加入50 μL滅菌ddH2O,重懸菌液。105 ℃處理10 min,12 000 r·min-1室溫離心2 min,吸取上清液作為PCR反應(yīng)的DNA模板。

根據(jù)大腸桿菌phoA基因(GenBank No. NZ_JAACYX010 000 057.1)設(shè)計特異性引物phoA-F:5′-CGATTCTGGAAATGGCAAAAG-3′和phoA-R:5′-CGTGATCAGCGGTGACTATGAC-3′。引物由重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系:PowerPol 2×PCR Mix 12.5 μL,phoA-F(10 μmol·L-1)1 μL,phoA-R(10 μmol·L-1)1 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O 9.5 μL,總反應(yīng)體系25 μL。PCR反應(yīng)條件:98 ℃預(yù)變性5 min;98 ℃變性20 s,58 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,共30個循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。

1.4 藥物敏感性試驗

根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)抗菌藥物敏感性試驗標準,采用紙片擴散法對大腸桿菌分離株進行藥物敏感性試驗。共使用25種抗菌藥物。以大腸桿菌ATCC?* 25922作為質(zhì)控菌株。結(jié)果根據(jù)CLSI M100-S32[3]和VET08Ed4E[4]判定。

1.5 β-內(nèi)酰胺酶基因和PMQR基因檢測

PCR檢測分離菌株中β-內(nèi)酰胺酶基因和PMQR基因攜帶情況。檢測的β-內(nèi)酰胺酶基因包括blaTEM[2]、blaCTX-M[2]、blaSHV[5]、blaOXA(blaOXA-1、blaOXA-2、blaOXA-10)[2]、blaCMY(CMY-1-F/CMY-1-R檢測blaCMY2、blaCMY12-blaCMY18、blaCMY-25、blaCMY-30-blaCMY31、blaCMY-97、blaCMY-109、blaCMY-116、blaCMY162,CMY-2-F/CMY-2-R檢測blaCMY-100和blaCMY-104,CMY-1-F/CMY-1-R檢測blaCMY-19)[2]、blaPSE[6]、blaPER[6]、blaVEB[7]、blaGES(blaGES-1-blaGES-9,blaGES-11)[7],檢測的PMQR基因包括qnrA[8]、qnrB[2]、qnrC[9]、qnrD[2]、qnrVC(共兩對引物)[2]、qnrS[2]、aac(6′)-Ib-cr[2]、oqxA[10]、oqxB[10]、qepA[2]。引物由重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。相應(yīng)的反應(yīng)參數(shù)根據(jù)文獻報道設(shè)定(表1)。擴增出的基因送生工生物工程(上海)股份有限公司重慶分公司測序并在NCBI進行序列比對。

表1 PCR擴增β-內(nèi)酰胺酶和PMQR基因的相關(guān)參數(shù)Table 1 The parameters for PCR amplification of β-lactamase and PMQR genes

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用 GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計分析軟件進行分析,使用卡方檢驗(Chi-square test)比較各養(yǎng)殖場多重耐藥菌株比例之間的顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 菌株分離鑒定

通過選擇性培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)、革蘭染色和分子生物學(xué)鑒定,在采集的146份樣品中分離到146株大腸桿菌。分離的大腸桿菌在麥康凱平板上形成圓形凸起、表面光滑濕潤的桃紅色菌落(圖1A);經(jīng)革蘭染色后鏡檢可見紅色、桿狀的革蘭陰性菌(圖1B);所有菌株均能擴增出大腸桿菌特異性的phoA基因(圖1C)。

A. 大腸桿菌在麥康凱平板的菌落形態(tài);B. 大腸桿菌革蘭染色后的細菌形態(tài)(1 000×);C. PCR擴增大腸桿菌特異的phoA基因(M. DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標準;1～6. 樣品)A. Colony morphology of E. coli on MacConkey plate; C. Bacterial morphology of E. coli after Gram staining (1 000×); C. Amplification of the phoA gene from E. coli by PCR (M. DL2000 DNA marker;1-6. Samples)圖1 大腸桿菌的分離鑒定Fig.1 Isolation and identification of E. coli

2.2 大腸桿菌臨床分離株的藥物敏感性

146株大腸桿菌臨床分離株對25種抗菌藥物的耐藥情況見表2。分離菌株對不同藥物的耐藥率有較大差異。對氨芐西林(66.4%)、頭孢唑啉(50%)的耐藥率超過50%;對頭孢噻吩、亞胺培南、鏈霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、甲氧芐啶的耐藥率在30%～50%,分別為38.4%、43.2%、35.6%、44.5%、32.2%、41.8%;對慶大霉素、阿米卡星、氧氟沙星完全敏感;對頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、妥布霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、依諾沙星和恩諾沙星的耐藥率不超過5%。

表2 麻旺鴨源大腸桿菌臨床分離株的耐藥情況Table 2 Antimicrobial resistance profiles of E. coli isolates recovered from Mawang ducks %

從不同的藥物種類來看,分離菌株對部分β-內(nèi)酰胺類(氨芐西林、頭孢噻吩、頭孢唑啉、亞胺培南)、氨基糖苷類(鏈霉素)、四環(huán)素類(四環(huán)素、多西環(huán)素)和磺胺類(甲氧芐啶、復(fù)方新諾明)藥物耐藥率較高,而對部分β-內(nèi)酰胺類(頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南)和氨基糖苷類(慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素)、氟喹諾酮類藥物較為敏感。各養(yǎng)殖場分離菌株對不同抗菌藥物的耐藥趨勢和總體的耐藥趨勢相同,但擴繁場2的分離菌株對各個藥物的耐藥率整體高于其余3個養(yǎng)殖場。

2.3 大腸桿菌多重耐藥情況

146株臨床分離菌株中有76株為多重耐藥菌,占總菌株數(shù)的52.1%(圖2)。從不同養(yǎng)殖場來看,3個擴繁場的多重耐藥菌比例均高于核心保種場,特別是從擴繁場2分離的菌株的多重耐藥菌數(shù)占81.3%,但各養(yǎng)殖場的多重耐藥菌比例沒有顯著差異(P>0.05)。

圖2 不同養(yǎng)殖場大腸桿菌的多重耐藥情況Fig.2 Multi-drug resistance of Escherichia coli at different farms

2.4 大腸桿菌臨床分離株β-內(nèi)酰胺酶基因和PMQR基因攜帶情況

經(jīng)PCR擴增和PCR產(chǎn)物測序,最終在111株(76.0%)大腸桿菌中檢測到β-內(nèi)酰胺酶基因,blaTEM、blaOXA和blaCTX-M基因檢出率分別為74.0%(108株)、3.4%(5株)和1.4%(2株),未檢測到blaSHV、blaCMY、blaPSE、blaPER、blaVEB、blaGES。PMQR基因陽性菌株有83株(56.8%),qnrS和aac(6′)-Ib-cr基因檢出率分別為54.8%(80株)和4.1%(6株),未檢測到其他PMQR基因(圖3)。

圖3 大腸桿菌臨床分離株中β-內(nèi)酰胺酶基因和PMQR基因檢測結(jié)果Fig.3 Distribution of β-lactamase genes and PMQR genes in E. coli isolates

分離菌株攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因和PMQR基因情況見表3。146株大腸桿菌臨床分離株中,15株不攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因和PMQR基因,分別有13、14、1、19、1、19、1株菌僅攜帶blaTEM-1、blaTEM-116、blaTEM-116、blaTEM-135、blaTEM-171、blaTEM-215、qnrS1、qnrS2基因;其余63株菌攜帶2～3個β-內(nèi)酰胺酶基因和PMQR基因,有18種組合形式,最為流行是blaTEM-171+qnrS1(24.0%,35株),其次是blaTEM-135+qnrS1(3.4%,5株)和blaTEM-1+qnrS1(2.7%,4株),其余組合形式不超過3株菌。

表3 大腸桿菌中β-內(nèi)酰胺酶基因和PMQR基因分布Table 3 Distribution of β-lactamase genes and PMQR genes in E. coli

3 討 論

酉陽縣地處武陵山區(qū),是麻旺鴨的主要養(yǎng)殖區(qū)域。搞好疫病防控,特別是核心育種場的疫病防控是保種工作的重要內(nèi)容。大腸桿菌是鴨的一種重要病原菌。目前,麻旺鴨的養(yǎng)殖仍以放養(yǎng)和開放式飼養(yǎng)為主,感染致病性大腸桿菌的風險較大。提前做好麻旺鴨體內(nèi)大腸桿菌的耐藥性監(jiān)測,可以為麻旺鴨大腸桿菌病發(fā)生后的治療提供資料儲備。

飼養(yǎng)麻旺鴨的麻旺鎮(zhèn)較為偏僻,人員流動相對較少,麻旺鴨發(fā)病也較少,所以養(yǎng)殖場很少用藥。但本研究中在麻旺鴨分離的146株大腸桿菌對部分β-內(nèi)酰胺類(氨芐西林、頭孢噻吩、頭孢唑啉、亞胺培南)和氨基糖苷類(鏈霉素)、四環(huán)素類、磺胺類藥物的耐藥率較高,這一研究結(jié)果和本實驗室在重慶食品動物中分離的沙門菌耐藥趨勢相同[2]。2018年,陳春林等[11]從重慶市榮昌區(qū)、大足區(qū)、武隆縣、黔江區(qū)、石柱縣和酉陽縣分離的雞源大腸桿菌對卡那霉素、慶大霉素和頭孢噻肟的耐藥率均高于本研究。2020年,呂紅林[12]對從重慶永川區(qū)、潼南區(qū)、銅梁區(qū)、江津區(qū)、北碚區(qū)等區(qū)縣分離的大腸桿菌進行藥物敏感性分析,發(fā)現(xiàn)豬、雞源大腸桿菌對四環(huán)素的耐藥率在90%以上,這個結(jié)果也遠遠高于本研究的結(jié)果。與從重慶[13]和四川[14]兩個鴨場分離的大腸桿菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥性相比,本研究分離的菌株對氟喹諾酮類藥物的耐藥率較低。隨著鄉(xiāng)村振興持續(xù)推進,鄉(xiāng)村旅游逐漸升溫,酉陽縣人員往來逐漸增多,必然會增加麻旺鴨患病的風險。了解麻旺鴨源細菌的耐藥表型,對于麻旺鴨疫病防控具有積極意義。氨曲南和亞胺培南是人專用抗生素,本研究發(fā)現(xiàn)分離的大腸桿菌對這兩種藥物存在耐藥,特別是對亞胺培南的耐藥率達到43.2%。這可能是由于耐藥菌株中存在這些藥物的耐藥基因。而這些耐藥基因由細菌對其他β-內(nèi)酰胺類藥物(和氨曲南/亞胺培南有共同的耐藥基因)的耐藥獲得[15-16],或者通過存在多種耐藥基因的耐藥質(zhì)粒共轉(zhuǎn)移獲得[17]。

從麻旺鴨來源的大腸桿菌攜帶的β-內(nèi)酰胺酶基因和本實驗室分離的食品動物來源沙門菌中β-內(nèi)酰胺酶基因的流行趨勢相同[2],即blaTEM基因最為流行,而我國其他地區(qū)報道的腸桿菌科細菌中流行的β-內(nèi)酰胺基因以blaCTX-M為主[18-19]。分離菌株對測定的5種喹諾酮類藥物耐藥率較低(不超過5%),但菌株中廣泛攜帶PMQR基因(56.8%,83/146)。這可能和PMQR基因與其他耐藥基因在同一耐藥質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)移有關(guān)[18,20]。

上述結(jié)果提示,抗菌藥物在食品動物的廣泛使用造成耐藥基因在不同區(qū)域內(nèi)或者區(qū)域間廣泛傳播。為有效遏制動物源細菌耐藥不斷上升的趨勢和獸藥殘留超標,更加全面提升畜禽綠色健康養(yǎng)殖的水平,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2019年發(fā)布第194號公告,要求停止生產(chǎn)、經(jīng)營、進口和使用部分藥物飼料添加劑,對一些飼料添加劑的相關(guān)管理政策作出調(diào)整,并在2019年12月19日的第246號公告發(fā)布了藥物飼料添加劑品種目錄及使用規(guī)范,宣布廢止僅有促生長用途的藥物飼料添加劑等品種質(zhì)量標準15個,注銷相關(guān)獸藥產(chǎn)品批準文號558個、進口獸藥注冊證書3個。此外,為確?！笆奈濉睍r期全國產(chǎn)出每噸動物產(chǎn)品獸用抗菌藥的使用量持續(xù)下降的趨勢,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2021年10月21日發(fā)布《全國獸用抗菌藥使用減量化行動方案(2021—2025年)》,要求到2025年末50%以上的規(guī)模養(yǎng)殖場實施養(yǎng)殖減抗行動。羅干等[21]對2014—2021年在重慶分離的大腸桿菌進行藥物敏感性分析,發(fā)現(xiàn)2020—2021年分離的大腸桿菌的耐藥率總體呈現(xiàn)下降趨勢。減抗是一場持久戰(zhàn),希望通過在全國范圍內(nèi)開展獸用抗菌藥使用減量化行動能切實減少耐藥菌株的出現(xiàn),保證畜牧業(yè)高質(zhì)量發(fā)展,保障動物源性食品安全和公共衛(wèi)生安全。

4 結(jié) 論

通過對重慶市酉陽縣麻旺鴨泄殖腔中大腸桿菌的分離鑒定和藥物敏感性檢測,分析了麻旺鴨源大腸桿菌的耐藥表型,對麻旺鴨臨床用藥具有一定參考意義。通過對大腸桿菌中β-內(nèi)酰胺酶基因和PMQR基因的檢測,發(fā)現(xiàn)blaTEM和qnrS基因在麻旺鴨源大腸桿菌中廣泛流行。