郭祉賓，楊德國，陳 亮，顏文斌，朱挺兵

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430223)

仔稚魚是魚類早期資源重要的生活史階段。開展仔稚魚調(diào)查有助于評估漁業(yè)種群資源量和了解魚類種群數(shù)量的動態(tài)變化，同時通過了解影響特定魚類早期資源分布的環(huán)境條件，也可進(jìn)一步研究魚類群落整體動態(tài)變化[10]。開展仔稚魚資源調(diào)查的難點(diǎn)之一在于物種鑒定，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定不僅需要詳實(shí)的水域魚類群落背景資料，還需要足夠的形態(tài)學(xué)參考文獻(xiàn)以及豐富的鑒定經(jīng)驗(yàn)[11]，面對同一科或同一屬不同物種的鑒定，也可能出現(xiàn)形態(tài)學(xué)特征不足以區(qū)分到種級別的情況[12]。而且，目前我國存有背景資料的仔稚魚形態(tài)學(xué)鑒定資料僅為我國已知魚類種數(shù)的1%左右，因此僅僅依靠形態(tài)學(xué)鑒定方法很難獲得全面準(zhǔn)確的物種信息。相比之下，采用DNA分子標(biāo)記進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定則具有操作較簡單且更易發(fā)現(xiàn)近緣種等優(yōu)勢[13-14]。雖然目前分子生物學(xué)鑒定技術(shù)還存在鑒定材料無法重復(fù)利用，或由于固定劑的不同導(dǎo)致同一批樣品無法使用不同鑒定手段等缺陷[15]，但該技術(shù)仍為魚類早期發(fā)育階段重要的鑒定手段且發(fā)展迅速。

目前有關(guān)西藏魚類早期資源的研究，多集中在人工控制條件下的魚類早期發(fā)育研究[16-18]，而自然條件下仔稚魚的種類組成和分布特征還未有報(bào)道。因此，本研究采用形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)方法，對采自雅魯藏布江中游的仔稚魚樣本進(jìn)行了種類鑒定，同時對主要種類的分布進(jìn)行了研究，以為雅魯藏布江漁業(yè)早期資源保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 研究方法

1.1 調(diào)查范圍與采樣點(diǎn)設(shè)置

本研究的調(diào)查范圍為雅魯藏布江中游。分別于2015年4月、2015年6月和2016年4月開展野外調(diào)查。其中，2015年設(shè)置了18個采樣點(diǎn)，2016年為補(bǔ)充調(diào)查，設(shè)置了6個采樣點(diǎn)(圖1、表1)。采樣點(diǎn)的設(shè)置遵循均勻分布、有明顯仔稚魚群體聚集、交通相對便利的原則，從下至上沿雅魯藏布江中游巡查，選擇有河漫灘及沙洲、仔稚魚較為密集的水域作為采樣點(diǎn)。采樣點(diǎn)主要環(huán)境因子見表2。

表1 年雅魯藏布江中游仔稚魚采樣點(diǎn)序號、海拔及經(jīng)緯度Tab.1 Serial number，altitude，longitude and latitude of sampling stations in the middle reaches of the Yarlung Zangbo River

表2 雅魯藏布江中游環(huán)境因子Tab.2 Environmental factors in the middle reaches of the Yarlung Zangbo River

圖1 雅魯藏布江中游仔稚魚采樣點(diǎn)示意圖Fig.1 Fish larvae and juveniles sampling stations in the middle reaches of the Yarlung Zangbo River

1.2 樣本采集方法

使用圓錐形手抄網(wǎng)(網(wǎng)口直徑15 cm，網(wǎng)長40 cm)在采樣點(diǎn)水域淺水區(qū)、沙洲洄水灣附近隨機(jī)捕撈可視的仔稚魚，捕撈時間約10～15 min，并盡量確保所有種類的仔稚魚均被采集。仔稚魚樣本用純酒精固定保存于50 mL離心管中后帶回實(shí)驗(yàn)室。同時記錄采樣點(diǎn)位置信息，測量海拔、水溫、流速、溶解氧、pH、濁度、底質(zhì)類型等基礎(chǔ)環(huán)境數(shù)據(jù)。

1.3 仔稚魚種類鑒定

首先對仔稚魚樣本進(jìn)行初步的形態(tài)學(xué)鑒定，然后基于形態(tài)學(xué)結(jié)果將各采樣點(diǎn)采集到的仔稚魚每個采樣點(diǎn)每種各選取3～5尾，整尾提取DNA，進(jìn)行Cytb基因序列測序，用于PCR擴(kuò)增的Cytb基因引物為通用引物L(fēng)14724(5′-GAC TTG AAA AAC CAC CGT TG-3′)和H15915(5′-CTC CGA TCT CCG GAT TAC AAG AC-3′)。去除引物兩端可能產(chǎn)生干擾的錯讀堿基序列后與NCBI在線網(wǎng)站序列進(jìn)行比對，以進(jìn)一步鑒定種類。將送檢的仔稚魚編號，方法為采樣點(diǎn)編號-尾數(shù)編號或采樣點(diǎn)編號-各站形態(tài)學(xué)鑒定種類序號-尾數(shù)編號。選擇BLAST結(jié)果相似度較高的序列，使用MEGA5.0軟件，ML法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析，當(dāng)Cytb基因序列相似度≥99%時認(rèn)為是同一種，序列相似度在92%～99%時認(rèn)為是同一屬，序列相似度在85%～92%時認(rèn)為是同一科[19]。

2 結(jié)果

2.1 雅魯藏布江中游仔稚魚種類組成

共采集到仔稚魚樣本3 502尾，其中2 015年采集到仔稚魚1 867尾，2016年共采集到仔稚魚1 635尾。共對157尾仔稚魚樣本進(jìn)行了Cytb基因測序。經(jīng)過比對，共鑒定出仔稚魚12種，隸屬于2科5屬。其中138尾樣本可鑒定到種，2尾樣本可鑒定到屬，17尾樣本可鑒定到科。2015年樣本共鑒定出仔稚魚10種，2016年樣本共鑒定出仔稚魚6種(表3)。選取NCBI數(shù)據(jù)庫上BLAST結(jié)果相近的幾條DNA與測序結(jié)果構(gòu)建ML系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2、圖3，結(jié)果顯示分子鑒定結(jié)果基本可信。

表3 雅魯藏布江中游仔稚魚物種組成Tab.3 Species composition of fish larvae and juveniles in the middle reaches of the Yarlung Zangbo River

圖2 2015年雅魯藏布江中游仔稚魚Cyt b基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree using Cyt b gene of fish larvae and juveniles in the middle reaches of the Yarlung Zangbo River in 2015

圖3 2016年雅魯藏布江中游仔稚魚Cyt b基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree using Cyt b gene of fish larvae and juveniles in the middle reaches of the Yarlung Zangbo River in 2016PZ：采樣點(diǎn)B1，ZB：采樣點(diǎn)B2，LL：采樣點(diǎn)B3，WLJZ：采樣點(diǎn)B4，BZ：采樣點(diǎn)B5，ZD：采樣點(diǎn)B6

2.2 仔稚魚種類數(shù)及尾數(shù)的空間變化

2015年仔稚魚捕獲尾數(shù)最多的采樣點(diǎn)為A8，共捕獲仔稚魚352尾，最少的采樣點(diǎn)為A12、A13，各捕獲仔稚魚4尾；2016年仔稚魚捕獲尾數(shù)最多的采樣點(diǎn)為B6，共捕獲649尾，最少的采樣點(diǎn)為B2，共捕獲15尾。2015年仔稚魚種類數(shù)分布最多的采樣點(diǎn)為A8，共出現(xiàn)6種仔稚魚；最低的采樣點(diǎn)為A14、A15，分別僅出現(xiàn)1種仔稚魚；2016年仔稚魚種類數(shù)分布最多的采樣點(diǎn)為B6，共出現(xiàn)5種仔稚魚，最少的采樣點(diǎn)為B2、B3，各出現(xiàn)2種仔稚魚(圖4、圖5)。

圖4 2015年雅魯藏布江中游仔稚魚的尾數(shù)及種類數(shù)量分布情況Fig.4 Distribution of the number of individuals and species of fish larvae and juveniles of the middle reaches of the Yarlung Zangbo River in 2015

圖5 2016年雅魯藏布江中游仔稚魚的尾數(shù)及種類數(shù)量分布情況Fig.5 Distribution of the number of individuals and species of fish larvae and juveniles of the middle reaches of the Yarlung Zangbo River in 2016

2.3 主要種類的空間分布

由表4、表5可見，2015年分布最廣的仔稚魚物種為細(xì)尾高原鰍，18個采樣點(diǎn)中有11個采樣點(diǎn)出現(xiàn)，其次為拉薩裸裂尻魚，共有9個采樣點(diǎn)中出現(xiàn)。分布最狹窄的為拉薩裂腹魚，僅在A8一個采樣點(diǎn)出現(xiàn)，其次為異尾高原鰍、雙須葉須魚及尖裸鯉，各在2個采樣點(diǎn)中出現(xiàn)。2016年分布最廣的仔稚魚也為細(xì)尾高原鰍和拉薩裸裂尻魚，6個采樣點(diǎn)中5個采樣點(diǎn)出現(xiàn)。分布最狹窄的則為異齒裂腹魚和高原鰍屬一種，各在B5、B6采樣點(diǎn)中出現(xiàn)。

表4 雅魯藏布江中游2015年各采樣點(diǎn)仔稚魚種類的空間分布情況Tab.4 Spatial distribution of species in each sampling station in the middle reaches of the Yarlung Zangbo River in 2015

表5 雅魯藏布江中游2016年各采樣點(diǎn)仔稚魚種類的空間分布情況Tab.5 Spatial distribution of species in each sampling station in the midle reaches of the Yarlung Zangbo River in 2016

2.4 環(huán)境因子對雅魯藏布江中游仔稚魚種類分布的影響

本研究中，裂腹魚類仔稚魚種類數(shù)分布隨海拔梯度存在先增高再降低的傾向，其余環(huán)境因子則對本研究中仔稚魚分布造成的影響并不顯著(表6)。本研究2015年海拔2 908～2 921 m(A1、A2)未采集到裂腹魚類仔稚魚，而海拔3 008、3 555 m處(A6、A8)裂腹魚類仔稚魚物種豐富度達(dá)到最大(圖6a)。2016年設(shè)置采樣點(diǎn)較少，處于海拔3 100 m以下，仔稚魚物種數(shù)量呈現(xiàn)隨海拔梯度增高而增加的現(xiàn)象。，且2015年未采集到裂腹魚類的樣點(diǎn)附近(B1、B2)也采集到了裂腹魚類仔稚魚(圖6b)。而高原鰍分布則較為廣泛，基本各海拔都采集到了高原鰍仔稚魚樣本(圖7)。

表6 雅魯藏布江中游仔稚魚物種數(shù)、尾數(shù)與環(huán)境因子間的相關(guān)性分析Tab.6 Correlation analysis between species number，individual number and environmental factors of the middle reaches of the Yarlung Zangbo River

圖6 雅魯藏布江中游裂腹魚類仔稚魚種類數(shù)分布Fig.6 Distribution of the number of species of fish larvae and juveniles in the family Cyprinidae of the middle reaches of the Yarlung Zangbo River

圖7 雅魯藏布江中游高原鰍類仔稚魚種類數(shù)分布Fig.7 Distribution of the number of species of fish larvae and juveniles in the family Balitoridae of the middle reaches of the Yarlung Zangbo River

3 討論

3.1 基于Cyt b基因的雅魯藏布江中游仔稚魚種類鑒定

基于Cytb基因等DNA保守片段進(jìn)行物種鑒定的技術(shù)是發(fā)展較為迅速的新興生物鑒定技術(shù)，且其在水生生物尤其是仔稚魚鑒定中得到了較為廣泛的應(yīng)用，如DANIEL等[20]使用形態(tài)學(xué)-分子生物學(xué)復(fù)合鑒定技術(shù)對馬尾藻海的仔稚魚物種組成及多樣性進(jìn)行了研究，PAUL等[12]基于分子生物學(xué)對奧地利維也納水庫仔稚魚物種特異性漂移現(xiàn)象進(jìn)行了研究。較之傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法，分子生物學(xué)鑒定技術(shù)擁有操作簡單，對鑒定人員要求相對較低等優(yōu)點(diǎn)[13-14]。KO等[21]進(jìn)行的形態(tài)學(xué)-分子生物學(xué)仔稚魚鑒定方法對比實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果準(zhǔn)確率遠(yuǎn)低于分子生物學(xué)方法，且形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果存在較高的主觀性影響。

利用Cytb基因測序比對可以較準(zhǔn)確地鑒定出雅魯藏布江中游仔稚魚的種類。本研究中，基于Cytb基因測序比對實(shí)現(xiàn)了種級水平上87.9%(157尾識別出138尾)的鑒定成功率，科級水平100%的鑒定成功率。這表明在缺乏必要的仔稚魚形態(tài)學(xué)鑒定特征背景參考的前提下，依靠分子生物學(xué)鑒定方法進(jìn)行種類鑒定是可行的。有類似研究也表明，裂腹魚類物種鑒定使用Cytb基因在分子鑒定研究中具有很大的潛力[22]。但需要注意的是，由于遺傳距離等原因，存在分子生物學(xué)鑒定方法成功率對高原魚類鑒定效果較差的情況[23，24]。針對這種情況，應(yīng)結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定方法，并可嘗試選取其他DNA作進(jìn)一步研究。另外，分子生物學(xué)鑒定方法雖然可以快速進(jìn)行物種鑒定，但仍需可靠的DNA數(shù)據(jù)庫作為支撐。作為開放數(shù)據(jù)庫，GenBank擁有著足夠龐大的基因數(shù)據(jù)，然而其質(zhì)量存在良莠不齊的問題[25]，因此傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法仍然是鑒定仔稚魚必要的程序。

3.2 雅魯藏布江中游仔稚魚的種類組成及分布范圍

本研究顯示，雅魯藏布江中游仔稚魚種類組成與近年來的雅魯藏布江漁業(yè)資源調(diào)查結(jié)果基本一致，主要為裂腹魚類和高原鰍類。本研究未發(fā)現(xiàn)鮡類仔稚魚，可能與本研究選擇的采樣點(diǎn)和時間有關(guān)。本研究一般選擇白天在沿江沙洲、洄水灣處采樣，而鮡類產(chǎn)卵場一般為卵石堆、石底處，且其一般存在較強(qiáng)的夜間活動習(xí)性[26]。本研究鑒定出的仔稚魚除裸腹葉須魚和怒江高原鰍外，均為雅魯藏布江土著魚類[27]。裸腹葉須魚自然分布于金沙江、瀾滄江、怒江等水系，怒江高原鰍僅分布于怒江水系，但沒有分布于雅魯藏布江的報(bào)道?？紤]到上述兩種魚類均只有單個樣本，因此它們可能是從其他水域偶然被帶入雅魯藏布江，在雅魯藏布江中游建群的可能性較小。

本研究中，兩年間分布最廣的仔稚魚均為細(xì)尾高原鰍和拉薩裸裂尻魚，與李雷等[28]的研究結(jié)果相似。細(xì)尾高原鰍在青藏高原地區(qū)廣泛分布，而拉薩裸裂尻魚在雅魯藏布江流域歷來也是分布最為廣泛的魚類，這可能與他們的種群維持需求不甚嚴(yán)格有關(guān)。

由于缺少雅魯藏布江仔稚魚的歷史數(shù)據(jù)，因此選擇將雅魯藏布江成魚的歷史分布記錄與本研究進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，雅魯藏布江中游仔稚魚的分布與成魚的分布存在一定的差異。本研究發(fā)現(xiàn)在海拔3 000 m左右處有尖裸鯉仔稚魚分布，同時進(jìn)行的成魚分布調(diào)查結(jié)果則顯示[29]，2015年雅魯藏布江出現(xiàn)的裂腹魚類中，尖裸鯉成魚僅分布于雅魯藏布江仁布以上江段(海拔3 770 m以上)?？梢哉J(rèn)為雅魯藏布江中下游存在尖裸鯉小規(guī)模群落，或至少存在尖裸鯉親魚在此繁殖。仔稚魚群落規(guī)模與成魚可能存在不成比例的情況在其他水域也是較為常見的。例如，葛成岡等[30]對長江口鰻苗定置網(wǎng)兼捕的研究顯示，長江資源量嚴(yán)重衰退的刀鱭(Coilianasus)，其仔稚魚在定置網(wǎng)中的漁獲量顯示為最優(yōu)勢種，高達(dá)31.99%。另外，游泳能力較差的仔稚魚分布主要取決于水流、親魚產(chǎn)卵場等[31，32]，與成魚分布位置可能存在差別。

3.3 環(huán)境因子對雅魯藏布江中游仔稚魚分布的影響

一般而言，環(huán)境因子會對物種的分布產(chǎn)生重大影響。仔稚魚由于其運(yùn)動能力較弱，其分布易受環(huán)境因子影響，如溫度可以影響仔稚魚代謝、運(yùn)動、基因表達(dá)及親魚繁殖生態(tài)，適當(dāng)?shù)臐岫瓤蔀樽兄婶~提供隱蔽等[32，33]。但本研究中仔稚魚的分布與其余環(huán)境因子的關(guān)系并不明顯，而與劉明典等[34]的研究結(jié)果相似，仔稚魚種類分布呈現(xiàn)沿海拔上升先增加而后減少的狀態(tài)。本研究仔稚魚分布結(jié)果受環(huán)境影響較少的原因可能是由于受交通條件限制，僅選擇了環(huán)境相對同質(zhì)化較高的沙洲、洄水灣作為采樣點(diǎn)，導(dǎo)致各采樣點(diǎn)間除海拔以外的環(huán)境因子差異較小。

3.4 雅魯藏布江中游魚類早期資源保護(hù)建議

本研究中，雅魯藏布江中游各采樣點(diǎn)均有仔稚魚分布，表明整個區(qū)域內(nèi)廣泛分布有符合魚類棲息條件的場所。其中，裂腹魚類仔稚魚種類數(shù)分布主要集中在海拔3 000 m～3 500 m的仲達(dá)-甲格江段、貢嘎-伊岡江段。高原鰍類仔稚魚則主要集中分布于海拔3 000 m以下的派鎮(zhèn)-尼洋河口江段以及4 400 m左右的拉孜-薩嘎江段。仔稚魚運(yùn)動、感知、攝食、反捕食能力均相對較弱[30]，是整個生活史中死亡率最高的階段，因此必須給予必要的保護(hù)。建議在魚類繁殖育幼季節(jié)，盡可能減少雅魯藏布江中游兩岸淺水沙洲、洄水灣等水域的人為干擾，特別是采砂等直接破壞河床的活動。