李靜亞,蔡素霞,張廣裕

(洛陽市婦幼保健院 a.病理科;b.產(chǎn)房,河南 洛陽 471099)

子癇前期為妊娠期特發(fā)的高血壓疾病,以妊娠20周后新發(fā)高血壓及蛋白尿為主要特點,病情可持續(xù)進展,甚至引起凝血功能障礙和終末器官功能障礙[1]。研究表明,血管內(nèi)皮細胞受損、子宮-胎盤血管結(jié)構(gòu)異常及炎癥免疫的過度激活均可能與子癇前期的發(fā)生有關(guān)[2-3]。胎盤組織中的血管可給予胎兒足夠的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣,若血管生成存在異常,會導(dǎo)致胎兒無法正常發(fā)育。因此,需要分析與胎盤組織血管生成有關(guān)的指標(biāo),根據(jù)相關(guān)指標(biāo)對子癇前期患者作出治療的指導(dǎo)干預(yù),從而促進良性妊娠結(jié)局。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)為介導(dǎo)細胞參與缺氧反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,通過對下游多種靶基因調(diào)控可參與細胞增殖和遷移、機體血管生成及細胞凋亡等過程[4]。因此,推測胎盤組織中HIF-1α的表達可能與子癇前期血管生成有關(guān)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取2019年1月至2023年1月于洛陽市婦幼保健院接受治療并成功分娩的80例子癇前期患者,另外選取50例同期健康孕婦為對照組。所有孕婦及其家屬均簽署知情同意書,本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

參照第9版《婦產(chǎn)科學(xué)》[5]中重度子癇前期的相關(guān)內(nèi)容:(1)血小板減少,血小板<100×109·L-1;(2)收縮壓≥160 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)或舒張壓≥110 mmHg;(3)腎功能損害;(4)出現(xiàn)持續(xù)性上腹或右上腹嚴重疼痛,肝功能損害,無法用其他疾病解釋或二者均存在;(5)新發(fā)生的視覺障礙或中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常;(6)肺水腫。將符合上述任何一種表現(xiàn)的患者納入重癥組,其余患者納入輕癥組。

輕癥組共納入48例患者,年齡25～35歲,平均(30.15±2.36)歲;體重51～73 kg,平均(62.43±5.74)kg;確診孕周24～32周,平均(28.47±1.95)周。重癥組共納入32例患者,年齡23～34歲,平均(29.05±2.17)歲;體重50～72 kg,平均(62.51±4.84)kg;確診孕周25～33周,平均(29.36±2.04)周。對照組年齡26～33歲,平均(29.54±2.44)歲;體重52～74 kg,平均(63.54±5.83)kg;確診孕周 25～31周,平均(28.37±2.13)周。3組一般資料比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

納入標(biāo)準(zhǔn):子癇前期孕婦符合子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)[6];單胎妊娠;交流能力正常;依從性良好,可配合完成此次研究。排除標(biāo)準(zhǔn):患有其他妊娠并發(fā)癥,如異位妊娠、妊娠急性脂肪肝等;患有傳染性疾病;患有精神病或交流障礙;患有心臟病。

1.2 胎盤組織標(biāo)本準(zhǔn)備

于孕婦分娩后,避開梗死和鈣化區(qū),在胎盤中心母體面取約2 cm×2 cm×2 cm全層胎盤組織為標(biāo)本,標(biāo)本獲取后用生理鹽水沖洗分為2份,其中一份使用體積分數(shù)為4%的甲醛水溶液固定,用免疫組化檢測,并通過CD34雙標(biāo)法檢測胎盤組織的微血管密度。另一份置于RNA酶滅活凍存管中,使用液氮速凍,隨后保存在-80 ℃的密閉環(huán)境。

1.3 免疫組化檢測

用石蠟將體積分數(shù)為4%的甲醛水溶液固定的胎盤組織標(biāo)本脫水后包埋并切片,行免疫組化染色,檢測HIF-1α水平(鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法),試劑盒由上海酶聯(lián)生物科技公司提供。應(yīng)用不同高倍視野分別觀察組織切片,陽性標(biāo)準(zhǔn)為細胞中出現(xiàn)較清晰的棕黃色顆粒。判定染色強度分值:3分為細胞中出現(xiàn)大量棕黃色顆粒,2分為細胞中出現(xiàn)較多棕黃色顆粒,1分為細胞中出現(xiàn)少量棕黃色顆粒,0分為細胞中未出現(xiàn)棕黃色顆粒。判定觀察到的陽性細胞占比分值:4分為占比>80%,3分為占比60%～80%,2分為占比40%～60%,1分為占比20%～40%,0分為占比<20%。將染色強度分值與陽性細胞占比分值相乘,陰性記0分,弱陽性記1～4分,陽性記5～8分,強陽性記9～12分。強陽性和一般陽性為HIF-1α高表達,弱陽性和陰性為HIF-1α低表達。

1.4 RT-PCR檢測

將RNA酶滅活凍存管中的胎盤組織標(biāo)本取出,采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)擴增引物,使用總RNA抽提試劑TRIZOL提取胎盤組織總RNA,將β-actin作為參照物,取5 μL PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電游,檢測胎盤組織中的HIF-1αmRNA,HIF-1α基因引物序列見表1。

表1 HIF-1α基因引物序列

1.5 凝血指標(biāo)檢測

3組孕婦入組后,采集空腹靜脈血5 mL放置在抗凝管內(nèi),使用鴻恩H1203全自動凝血分析儀檢測血漿凝血酶原時間(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time,APTT)、纖維蛋白原(fibrinogen,Fib)指標(biāo)水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 微血管密度

對照組孕婦胎盤組織的微血管密度最高,輕癥組次之,重癥組最低,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組孕婦胎盤組織微血管密度對比

2.2 HIF-1α mRNA和凝血指標(biāo)

重癥組HIF-1αmRNA、Fib水平高于輕癥組和對照組,且輕癥組高于對照組;重癥組APTT、PT低于輕癥組和對照組,且輕癥組低于對照組,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組胎盤組織HIF-1α mRNA和凝血指標(biāo)對比

2.3 HIF-1α蛋白免疫組化表達

3組胎盤組織中均有HIF-1α陽性表達,重癥組HIF-1α總陽性表達率高于輕癥組與對照組,輕癥組高于對照組,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 3組胎盤組織中HIF-1α陽性檢出情況比較(n,%)

2.4 胎盤組織中HIF-1α表達與血管生成的相關(guān)性分析

經(jīng)雙變量相關(guān)性分析檢驗結(jié)果顯示,子癇前期患者胎盤組織中HIF-1α相對表達量與血管生成(微血管密度)呈負相關(guān)(r=-0.938,P<0.001)。

3 討論

子癇前期屬于妊娠期高血壓疾病的一種,目前,疾病病因和具體發(fā)病機制尚未完全明確,通常認為是多因素、多機制及多通路導(dǎo)致的疾病[7]。妊娠期孕婦血壓升高導(dǎo)致血管阻力變大,胎盤血流變少,容易引起孕婦血管病變和內(nèi)皮功能障礙,增加胎盤病變和發(fā)生子癇前期的風(fēng)險[8]。子癇前期患者的胎盤組織中血管生成呈現(xiàn)異常狀態(tài),容易引起胎盤缺血、缺氧,并釋放多種誘發(fā)炎癥反應(yīng)的胎盤因子[9-10]。

本研究結(jié)果顯示,重癥組孕婦胎盤組織中的微血管密度低于輕癥組和對照組,且輕癥組孕婦低于對照組,表明子癇前期患者病情越重,胎盤組織中血管生成情況越差。因胎盤的血管是為胎兒提供營養(yǎng)物質(zhì)的關(guān)鍵介質(zhì),因此分析可能與血管生成有關(guān)的指標(biāo)較為關(guān)鍵。APTT、PT、Fib 凝血指標(biāo)是判斷機體凝血功能狀態(tài)和凝血酶活性的標(biāo)準(zhǔn),可反映患者體內(nèi)凝血因子和纖維蛋白原釋放量[11]。子癇前期患者的凝血功能障礙,會增加胎盤組織中血管被堵塞的分險,不利于血管生成[12]。本研究結(jié)果顯示,重癥組孕婦APTT、PT水平低于輕癥組和對照組,輕癥組低于對照組,而重癥組孕婦Fib水平高于輕癥組和對照組,輕癥組高于對照組,表明子癇前期患者體內(nèi)凝血-抗凝血系統(tǒng)存在紊亂現(xiàn)象,血液處于高凝狀態(tài)。但由于患者體內(nèi)凝血因子的水平還受到飲食、藥物、自身免疫力等多種因素的影響,若單純將其用于子癇前期患者胎盤組織中血管生成的評價可能準(zhǔn)確性不高,所以本研究未將其作為主要的指標(biāo)進行研究。

HIF-1α參與了體內(nèi)細胞代謝、血管功能調(diào)節(jié)的過程,是機體適應(yīng)缺氧環(huán)境的主要調(diào)節(jié)因子[13]。HIF-1α異常過表達時,會控制組織內(nèi)的細胞增殖,抑制胎盤滋養(yǎng)細胞的發(fā)育[14]。因此,推測HIF-1α表達可能與胎盤組織中的血管生成有關(guān)。本次研究發(fā)現(xiàn),重癥組HIF-1αmRNA表達水平高于輕癥組和對照組,輕癥組孕婦高于對照組,同時重癥組孕婦HIF-1α總陽性表達率高于輕癥組和對照組,輕癥組孕婦高于對照組。這表明在子癇前期患者中,HIF-1α呈現(xiàn)異常過表達,且隨著患者病情加重,這種過表達的情況更為明顯。分析原因,HIF-1α作為介導(dǎo)細胞參與缺氧反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,能夠和細胞中穩(wěn)定表達的HIF-1β結(jié)合成具有高度活性的二聚體,參與胎盤組織中缺氧反應(yīng)的表達,穩(wěn)定缺氧環(huán)境,造成胎盤缺血情況更加嚴重[15]。HIF-1α還能夠控制細胞因子分泌,對胎盤滋養(yǎng)細胞功能產(chǎn)生影響,子癇前期患者體內(nèi)的胎盤因子有可能是受到HIF-1α刺激而釋放出來,導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷加劇,從而嚴重影響胎盤組織中的血管生成,加重了子癇前期患者的病情[16]。為進一步明確HIF-1α相對表達量與胎盤組織中微血管密度的關(guān)系,本研究進行了雙變量相關(guān)性分析檢驗,結(jié)果顯示,子癇前期患者胎盤組織中HIF-1α相對表達量與微血管密度呈負相關(guān),證明在胎盤組織中高表達水平的HIF-1α與血管生成有關(guān),或可通過導(dǎo)致胎盤組織缺氧缺血,引起胎盤缺血和血管損傷,繼而誘發(fā)血管生成異常。

4 結(jié)論

HIF-1α在子癇前期患者的胎盤組織中高表達,且表達水平和血管生成呈負相關(guān),與患者子癇前期病情嚴重程度有關(guān)。