王心玥,徐曉峰

(1.上海財(cái)經(jīng)大學(xué)附屬北郊高級中學(xué),上海 200081;2.上海師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,上海 200234)

草莓是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物,具有豐富的營養(yǎng)價值和藥用價值。然而,在草莓種植過程中,常常會遇到病蟲害的侵襲和環(huán)境脅迫的影響,導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降。因此,尋找一種有效的方法來促進(jìn)草莓的生長和提高其品質(zhì),對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。我國具有豐富的中草藥資源,種類多達(dá)12 807種[1]。于是,人們開始探索使用中草藥制劑來提高草莓的生長和抗逆能力。中草藥一直以來被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究中。研究表明,利用天然中草藥等的提取物對黑皮果蔗進(jìn)行處理,可以顯著提高其保鮮效果[2];謝晶等研究發(fā)現(xiàn),利用川芎提取液對柑橘的病原菌進(jìn)行處理后的抑菌效果可以達(dá)到100%[3];此外,石琳等人利用乙醇對艾草、桔皮提取物進(jìn)行復(fù)合配比,發(fā)現(xiàn),其對植物病原菌有明顯的抗性[4]。目前國內(nèi)學(xué)者對中藥制劑作用于植物的生長的影響,特別是針對設(shè)施草莓的研究鮮有報(bào)道。本研究主要利用甘草、生姜和桔皮等常見的中草藥材料,按照不同質(zhì)量比復(fù)配對設(shè)施草莓進(jìn)行處理,以探討不同中草藥制劑復(fù)配對設(shè)施草莓的生長、葉綠素含量、光合特性及抗氧化酶相關(guān)的基因(SOD、CAT、PPO和PAL6)的影響,旨在篩選最適宜設(shè)施草莓栽培的中草藥制劑復(fù)合配方,以期為草莓種植中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試草莓品種為“紅顏”草莓(Fragaria×ananassa‘Red Face’)。試驗(yàn)用的中草藥主要包括甘草、生姜和桔皮,來自慶余堂中藥材粉批發(fā)店,將其分別研磨成粉末,并按一定比例混合制成中草藥制劑?；|(zhì)與珍珠巖為市場購買。

1.2 試驗(yàn)處理

將草莓植株分為對照組和中草藥制劑處理組,每組重復(fù)3次。試驗(yàn)共設(shè)置8個處理,處理1(T1):蒸餾水;處理2(T2):m(甘草)∶m(生姜)∶m(桔皮)=1∶0∶0;處理3(T3):m(甘草)∶m(生姜)∶m(桔皮)=0∶1∶0;處理4(T4):m(甘草)∶m(生姜)∶m(桔皮)=0∶0∶1;處理5(T5):m(甘草)∶m(生姜)∶m(桔皮)=1∶1∶0;處理6(T6):m(甘草)∶m(生姜)∶m(桔皮)=1∶0∶1;處理7(T7):m(甘草)∶m(生姜)∶m(桔皮)=0∶1∶1;處理8(T8):m(甘草)∶m(生姜)∶m(桔皮)=1∶1∶1。按照上述中草藥制劑配比對生長狀態(tài)相近的草莓幼苗連續(xù)噴施5 d,以噴施蒸餾水作為對照。

1.3 測定指標(biāo)及其方法

1.3.1 草莓幼苗的形態(tài)指標(biāo)測定

利用上述不同處理組處理草莓幼苗20 d后,分別對其葉面積、株高、植株鮮質(zhì)量、根長等指標(biāo)進(jìn)行測定。

1.3.2 草莓幼苗葉片葉綠素含量的測定

取不同處理組后的草莓苗的葉片進(jìn)行葉綠素含量的測定,測定方法采用丙酮提取比色法[5]。取0.03 g草莓葉片,將其放入棕色離心管中,并加入1 mL 80%丙酮,每個處理設(shè)置三組重復(fù),用錫箔紙包好并在黑暗條件下過夜,第二天利用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測量,在OD663和OD645處測量樣品的吸光度值,最后根據(jù)吸光度值計(jì)算相應(yīng)的葉綠素a和b的含量。此外,凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)及胞間 CO2濃度(Ci)采用LI-6400XT光合作用測量儀測定。

1.3.3 草莓幼苗葉片抗性相關(guān)基因的實(shí)時熒光定量PCR

采用Trizol法[6]提取草莓葉片總RNA,并通過TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板,隨后利用SYBR Premix ExTaq II試劑盒進(jìn)行qRT-PCR。使用18S rRNA作為內(nèi)參基因,將其表達(dá)水平設(shè)為1,其余基因表達(dá)水平與其相比較,相對表達(dá)水平計(jì)算方法按照2-△△Ct法[7]進(jìn)行計(jì)算。qRT-PCR引物見表1,反應(yīng)體系及條件參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

表1 用于草莓基因表達(dá)的引物序列

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0數(shù)據(jù)處理軟件中的單因素方差分析(one-way anova)進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05);利用Image J對草莓葉片的葉面積進(jìn)行計(jì)算;利用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同中草藥制劑對草莓苗生長的影響

由表2可以看出,中草藥制劑處理組的株高、根長均高于對照組(T1),以T8處理的株高、根長最大,分別比T1處理顯著提高約31.17%,30.18%。對植物葉面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn),T6、T7和T8處理均顯著高于T1組,以T8處理的最大。相較于T1組,處理組的植株鮮質(zhì)量也有較為明顯的提高,其中T8處理相較于對照而言,提高了大約50.82%。在這些處理組中,兩種混合中草藥制劑處理T5、T6和T7比單一中草藥制劑處理T2、T3、T4的根長更長,葉面積更大;而三種混合中草藥制劑處理組T8比單一的和兩種混合的中草藥制劑處理的根長更長,葉面積更大。

表2 中草藥制劑處理對草莓苗生長的影響

2.2 不同中草藥制劑對草莓苗葉綠素含量的影響

由表3可以看出,用中草藥制劑處理后的草莓葉片中葉綠素a和葉綠素b的含量比對照處理有著顯著的提高,且以T8處理增大的最為明顯。其中,單一中草藥制劑處理T2、T3、T4,相較于T1而言,葉綠素a+b的含量提高了約20.46%,26.46%和35.66%;兩種混合中草藥制劑處理T5、T6和T7相較于T1而言,葉綠素a+b的含量提高了約35.56%,40.43%和41.88%;三種混合中草藥制劑處理組T8相較于T1而言,葉綠素a+b的含量提高得最高,提高了約50.46%。在處理組的比較中,三種混合中草藥制劑處理組T8比單一的和兩種混合的中草藥制劑處理的葉綠素a+b的含量更高。

表3 中草藥制劑處理對草莓苗葉綠素含量的影響

2.3 不同中草藥制劑對草莓苗光合作用的影響

由表4可知,T2、T4、T5、T6、T7和T8處理的氣孔導(dǎo)度(Gs)與對照T1相比,均無顯著差異,但以T8的氣孔導(dǎo)度值最高。此外,T8處理在凈光合速率(Pn)及蒸騰速率(Tr)中,與對照相比,均顯著增加,分別增加了約7.03%和13.27%,而T8處理的胞間CO2濃度(Ci)則明顯降低,降低了約8.37%。此外,在處理組的比較中,三種混合中草藥制劑處理組T8比單一的和兩種混合的中草藥制劑處理的凈光合速率、蒸騰速率及氣孔導(dǎo)度更高;而胞間CO2濃度則較低。

表4 中草藥制劑處理對草莓苗光合作用的影響

2.4 不同中草藥制劑對草莓苗抗氧化酶相關(guān)基因的影響

基于上述結(jié)果,發(fā)現(xiàn)三種混合中草藥制劑處理組T8對草莓苗的作用更大,于是,對T8處理組與對照組T1中的與抗氧化酶相關(guān)的基因,包括SOD、CAT、PPO和PAL6等,進(jìn)行了定量PCR檢測,如圖1所示。結(jié)果表明:相較于對照組T1而言,SOD、CAT、PPO和PAL6的基因表達(dá)水平均明顯被誘導(dǎo)上調(diào)。其中,SOD和PPO分別上調(diào)了約2.1和2.9倍;PAL6上調(diào)了約3.6倍;CAT上調(diào)較為明顯,與對照相比,上調(diào)了約5.9倍。

圖1 T8與T1處理對草莓苗抗氧化酶相關(guān)基因的影響

3 討論與結(jié)論

目前,由于科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,越來越多的研究集中于將中草藥制劑與農(nóng)業(yè)領(lǐng)域相互結(jié)合,優(yōu)勢互補(bǔ)。而中草藥制劑本身來源于植物,其具有安全性高、傳導(dǎo)性好、作用廣譜等優(yōu)點(diǎn)[8],也被廣泛應(yīng)用于作物生產(chǎn)中。由表2可知,不同的中草藥制劑處理對于草莓生長的影響不同。多種混合中草藥制劑處理的效果比單一處理對草莓苗的根長、株高、葉面積及植株鮮質(zhì)量影響更大,特別是三種混合中草藥制劑處理組T8,且相較于對照組T1而言,中草藥制劑處理組均對草莓的生長有了顯著的提高,這與孫天霞等人在研究中藥復(fù)方提取液處理植物時,發(fā)現(xiàn)其能夠顯著提高植物生長狀態(tài)的研究基本一致[9]。

葉綠素是綠色植物進(jìn)行光合作用所必需的主要色素之一。葉綠素的含量與植物的光合作用密切相關(guān),葉綠素含量的高低可以反映葉片的光合能力和健康狀況,因此被廣泛應(yīng)用于評估植物的生理狀態(tài)和光合效率[10]。如表3所示,相較于對照而言,利用中草藥制劑處理草莓苗,可以顯著提高其葉綠素a+b的含量,這與用中(草)藥制劑處理后的獼猴桃葉片中葉綠素a和葉綠素b的含量比未處理的提高了近一倍的研究結(jié)果類似,說明使用中(草)藥制劑,可以通過提高植物葉片中葉綠素的含量、增加光合作用等途徑,來起到營養(yǎng)復(fù)壯的效果。而且,利用中藥復(fù)方提取液處理擬南芥時,發(fā)現(xiàn)其能夠顯著提高植物的葉綠素含量[9]。此外,通過對光合作用指標(biāo)的測定結(jié)果表明,這種復(fù)配的中草藥制劑處理T8對于提高凈光合作用速率、氣孔導(dǎo)度等方面,也具有積極促進(jìn)作用。

抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)也是判定植物防御能力是否提高的關(guān)鍵因素[11-12]。物體內(nèi)存在一系列抗氧化酶組成的抗氧化系統(tǒng),從而抵御活性氧對植物造成的傷害,這些抗氧化酶系統(tǒng)主要包括PAL、PPO、SOD及CAT等[13-14]。如圖1所示,對三種中草藥復(fù)配制劑與對照處理后的草莓苗的抗氧化酶相關(guān)基因的定量PCR結(jié)果表明,利用三種中草藥復(fù)配制劑處理后的草莓苗的抗氧化酶相關(guān)基因SOD、CAT、PPO和PAL6,均呈現(xiàn)顯著的上調(diào)表達(dá),這說明中草藥制劑處理可能極大地提高了植物的抗氧化能力。

通過比較中草藥制劑對草莓根長、株高、葉面積、植物鮮質(zhì)量、葉綠素含量、凈光合速率,氣孔導(dǎo)度及抗氧化酶相關(guān)基因的影響,從而確定三種中草藥復(fù)配制劑處理對草莓的生長較好,各項(xiàng)指標(biāo)的值均最大。