郭 昊，烏東高娃，趙洪哲，劉春羽，侯麗娜，王鳳雪，溫永俊

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起，以繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)疾病為主，可造成免疫抑制[1-2]。通常伴有胃腸炎樣癥狀，如腹瀉和出血，可垂直傳播，嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)[3-5]。PRRS最早發(fā)現(xiàn)于美洲，1995年左右出現(xiàn)在中國(guó)[6]。因其高度遺傳和抗原異質(zhì)性而擁有復(fù)雜的致病機(jī)制[7-8]。PRRS只感染豬，對(duì)于妊娠母豬和仔豬危害極大。PRRSV通過(guò)入侵肺泡巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)而進(jìn)入血液和淋巴循環(huán)，造成器官損傷及病毒血癥[9]。有研究表明，PRRSV通過(guò)激活NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)誘導(dǎo)腸炎癥細(xì)胞因子的釋放，導(dǎo)致腸道炎癥和粘蛋白的分泌[10]。由于沒(méi)有針對(duì)這種豬病的有效治療手段，盡管采取各種措施，但該病仍然在全球范圍內(nèi)廣泛流行。為有效預(yù)防該病，應(yīng)建立快速準(zhǔn)確的診斷方法，科學(xué)結(jié)合其流行病學(xué)及遺傳特點(diǎn)制定防控策略，改進(jìn)研發(fā)更加安全有效的疫苗進(jìn)行免疫接種[11]。

PRRSV屬動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬，單股正鏈RNA病毒[12-13]。按照基因型分為歐洲型（PRRSV-1）和北美型（PRRSV-2），兩者只有55%～70%的核苷酸和50%～80%的氨基酸相似性[14]。在中國(guó)的分離株為Ⅱ型[15]。病毒基因組全長(zhǎng)約15.5 kb，包含11個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frame,ORF），編碼14個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白和7個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白[16-17]。ORF4編碼的結(jié)構(gòu)蛋白GP4參與病毒感染，高度糖基化，帶有4個(gè)N連接糖基化位點(diǎn)。GP4在Ⅰ型和Ⅱ型PRRSV中大小分別為187和183個(gè)氨基酸，其中Ⅰ型PRRSV的GP4具有位于高度可變區(qū)的線性中和表位，誘導(dǎo)針對(duì)同源毒株的中和抗體[18]。有研究表明，GP4與靶細(xì)胞膜上主要受體的分化簇163（CD163）共定位，以介導(dǎo)內(nèi)化和分解，其中GP4和GP2a之間的特定相互作用可以作為病毒附著蛋白，負(fù)責(zé)介導(dǎo)病毒進(jìn)入易感宿主細(xì)胞時(shí)與CD163的相互作用[19-20]。GP4還可與GP2和GP3相互作用，嵌合形成多聚蛋白復(fù)合體，參與病毒粒子形成[21]。因此GP4蛋白無(wú)論是應(yīng)用于檢測(cè)、機(jī)理研究還是疫苗研發(fā)都有著舉足輕重的作用。

本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)BL21（DE3）截短表達(dá)PRRSV GP4蛋白，利用His標(biāo)簽純化并免疫小鼠，進(jìn)行單克隆抗體的篩選與制備，驗(yàn)證單克隆抗體的親和力和特異性，為PRRSV診斷方法的建立、GP4蛋白的后續(xù)生物學(xué)研究以及PRRSV診斷試劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞、質(zhì)粒及試驗(yàn)動(dòng)物 豬繁殖與呼吸綜合征病毒（NM2021）、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞、Trans5α感受態(tài)細(xì)胞、SP2/0骨髓瘤細(xì)胞、Marc-145細(xì)胞、pET-32a載體均保存于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病實(shí)驗(yàn)室；SPF Balb/c小鼠購(gòu)自內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ、T4 DNA Ligase購(gòu)自NEB公司；Plasmid Mini Kit、Gel Extraction Kit購(gòu)自O(shè)MEGA公司；6×His標(biāo)簽抗體購(gòu)自艾美捷科技有限公司；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購(gòu)自Abcam公司；PVDF膜購(gòu)自北京碧云天生物有限公司；1 mL Ni純化柱購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；PierceTMBCA Protein Assay Kit、Pierce Rapid Antibody Isotyping Kit-Mouse試劑盒購(gòu)自Thermo公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT選擇培養(yǎng)基、TritonX-100購(gòu)自SIGMA公司。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 PRRSV ORF4序列參照J(rèn)Xwn06株（GenBank登錄號(hào)：EF641008.1），通過(guò)生物信息學(xué)軟件對(duì)GP4蛋白跨膜區(qū)、信號(hào)肽、二級(jí)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)以及抗原決定簇進(jìn)行預(yù)測(cè)，選取優(yōu)勢(shì)截短序列送往華大蛋白進(jìn)行基因優(yōu)化合成，并引入限制性酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和XhoⅠ。合成序列連接到pET-32a表達(dá)載體，獲得重組質(zhì)粒pET-32a-ORF4。提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，反應(yīng)體系（50 μL）為：質(zhì)粒1 μg，EcoRⅠ 1 μL，XhoⅠ 1 μL，10× NEB Buffer 5 μL，ddH2O至50 μL，酶切產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 重組蛋白的原核表達(dá)及純化 將鑒定成功的陽(yáng)性菌液1∶100接種氨芐抗性LB液體培養(yǎng)基中，37℃條件下200 r/min搖床培養(yǎng)OD600值為0.6～0.8，加入0.5 mmol/L的IPTG，16℃過(guò)夜誘導(dǎo)。12000 ×g條件下離心10 min，收集誘導(dǎo)表達(dá)后菌體。pH8.0的10 mmol/L Tris-HCl溶液重懸沉淀，加入終濃度為1 mmol/L的PMSF，冰上超聲破碎菌體，4℃、12 000 ×g條件下15 min，吸出上清液，沉淀用Tris-HCl重懸。上清液和沉淀重懸液中分別加入5× Loading buffer，100℃孵育10 min制備樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。采用Ni SepharoseTM6 Fast Flow試劑盒純化成功表達(dá)的目的蛋白，參照PierceTMBCA Protein Assay Kit說(shuō)明書測(cè)定純化蛋白濃度，同時(shí)進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.5 重組蛋白的Western blot鑒定 SDS-PAGE電泳完成后，將SDS-PAGE膠半干轉(zhuǎn)置PVDF膜，5%脫脂乳室溫封閉4 h，PBST洗滌3次，每次15 min；將鼠源抗His標(biāo)簽抗體1∶4000稀釋，4℃孵育過(guò)夜，PBST洗滌3次，每次15 min；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 1∶5000稀釋，室溫孵育2 h，PBST洗滌3次，每次15 min；將ECL顯色液1∶1混合，用凝膠成像系統(tǒng)曝光并分析結(jié)果。

1.6 雜交瘤細(xì)胞的制備與篩選 將純化后的GP4蛋白按照60 μg/只，與弗氏完全佐劑按照1∶1比例免疫SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠4只，編號(hào)分別為ORF4-1、ORF4-2、ORF4-3、ORF4-4，間隔兩周進(jìn)行3次加強(qiáng)免疫，劑量為30 μg/只，同時(shí)換為弗氏不完全佐劑。采小鼠血液分離血清，間接ELISA檢測(cè)其抗體效價(jià)。包被液稀釋GP4蛋白至終濃度為2 μg/mL，100 μL/孔，4℃過(guò)夜，洗滌3次；2%脫脂乳37℃孵育2 h，洗滌3次；一抗血清自200倍稀釋度開(kāi)始2倍梯度稀釋，共稀釋10次，同時(shí)設(shè)置陰性與空白對(duì)照，37℃孵育1 h，洗滌3次；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 1∶20 000稀釋，37℃孵育1 h，洗滌3次；加入終止液，測(cè)其吸光值。選取血清滴度高于25 600的小鼠脾臟制備脾細(xì)胞，并采用PEG法與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合試驗(yàn)，融合后細(xì)胞于半固體HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時(shí)采用間接ELISA篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)。采用Thermo公司Pierce Rapid Antibody Isotyping Kit-Mouse試劑盒對(duì)擴(kuò)大培養(yǎng)的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞類鑒定。

1.7 單克隆抗體的制備與純化 石蠟油提前一周注射進(jìn)SPF級(jí)BALB/c小鼠腹腔，將鑒定成功培養(yǎng)好的雜交瘤細(xì)胞注射小鼠腹腔，7 d左右收集腹腔明顯腫大小鼠的腹水。采用辛酸-硫酸銨法純化腹水抗體。參照PierceTMBCA Protein Assay Kit說(shuō)明書檢測(cè)抗體 濃度，SDS-PAGE檢測(cè)抗體純度。

1.8 單克隆抗體的鑒定 采用間接免疫熒光（indirect immunofluorescence assay, IFA）及Western blot方法鑒定單克隆抗體。將Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中，待匯合度90%時(shí)將本實(shí)驗(yàn)室鑒定分離的PRRSV按MOI為1感染Marc-145細(xì)胞，感作2 h，換維持液培養(yǎng)48 h后棄上清液，PBS清洗3次，用4%的多聚甲醛4℃固定1 h，PBS清洗3次，每次5 min；0.3% Triton X-100通透30 min，PBS清洗3次，每次5 min；5% BSA、37℃封閉1 h；純化單克隆抗體1∶100稀釋，37℃孵育1 h，PBS清洗5次，每次5 min；FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 1∶8000稀釋，37℃孵育1 h，PBS清洗5次，每次5 min。倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果表明，優(yōu)化后ORF4片段約為288 bp，與預(yù)期相符（圖1）。

圖1 pET-32a-ORF4 重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證Fig.1 Double restriction digestion verif ication of pET-32a-ORF4 recombinant plasmid

2.2 重組蛋白的原核表達(dá)與純化 對(duì)破碎后的上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)（圖2），結(jié)果表明，誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白大小為30 kDa，與預(yù)期相符，且為上清液表達(dá)。將蛋白原樣、流穿液、及不同濃度咪唑的洗脫液制樣，SDS-PAGE檢測(cè)蛋白純化效果（圖3），結(jié)果表明，在300 mmol/L咪唑洗脫液二次洗脫樣品中目的蛋白含量及純度較高，可以進(jìn)行小鼠免疫。

圖2 GP4 蛋白的原核表達(dá)Fig.2 Prokaryotic expression of GP4 protein

圖3 GP4 蛋白的純化Fig.3 Purif ication of GP4 protein

2.3 重組蛋白的Western blot鑒定 將純化后的目的蛋白電泳后進(jìn)行Western blot驗(yàn)證，一抗為鼠源抗His標(biāo)簽抗體，二抗為HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，結(jié)果表明，目的蛋白與His抗體成功結(jié)合，目的條帶大小為30 kDa（圖4）。

圖4 GP4 蛋白的Western blot 驗(yàn)證Fig.4 Western blot verif ication of GP4 protein

2.4 小鼠血清免疫效價(jià)的測(cè)定 重組蛋白免疫小鼠后，采取小鼠血液分離血清，通過(guò)間接ELISA方法測(cè)定其效價(jià)（圖5），結(jié)果顯示，4只小鼠血清滴度均高于25 600，皆可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖5 小鼠血清效價(jià)的ELISA 檢測(cè)Fig.5 ELISA detection of mouse serum titer

2.5 雜交瘤細(xì)胞亞類鑒定 采用Thermo公司Pierce Rapid Antibody Isotyping Kit-Mouse試劑盒對(duì)擴(kuò)大培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞類鑒定，結(jié)果顯示，共獲得4株IgG亞型陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株（表1），分別為6、21、60、70號(hào)，選擇70號(hào)雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行單克隆抗體的制備，將其命名為Anti-A-ORF4-70。

表1 雜交瘤細(xì)胞亞類鑒定Table1 Identif ication of hybridoma cell subclasses

2.6 單克隆抗體的純化與鑒定 參照PierceTMBCA Protein Assay Kit說(shuō)明書測(cè)定純化后的小鼠腹水濃度并進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果顯示，該抗體濃度純度高，在約55 kDa和25 kDa處出現(xiàn)條帶，分別為重鏈和輕鏈（圖6）。采用IFA及Western blot方法鑒定Anti-A-ORF4-70。IFA結(jié)果顯示，單克隆抗體可以與抗原特異性結(jié)合（圖7）；Western blot結(jié)果顯示，單克隆抗體可以與GP4蛋白特異性結(jié)合，出現(xiàn)大小為30 kDa的條帶（圖8）。

圖6 Anti-A-ORF4-70 的純化Fig.6 Purif ication of Anti-A-ORF4-70

圖7 Anti-A-ORF4-70 IFA 驗(yàn)證Fig.7 IFA verif ication of Anti-A-ORF4-70

圖8 Anti-A-ORF4-70 Western blot 驗(yàn)證Fig.8 Western blot verif ication of Anti-A-ORF4-70

3 討論

單克隆抗體作為疾病的診斷工具，因其成本低廉，特異性高，擁有廣泛的應(yīng)用前景。GP4蛋白是參與PRRSV致病的主要結(jié)構(gòu)蛋白[22]。作為典型的Ⅰ類跨膜蛋白，GP4在C-末端區(qū)域沒(méi)有包質(zhì)尾區(qū)，N末端的前22 aa包含獨(dú)特疏水區(qū)，因此為了最大化GP4蛋白的表達(dá)效率及保證其抗原性，本研究在對(duì)GP4基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，采取了截短序列并進(jìn)行密碼子優(yōu)化。Costers等[23]發(fā)現(xiàn)GP4中的中和表位在體外對(duì)抗體具有高度敏感的選擇性，而其產(chǎn)生的特異性中和抗體可能是PRRSV進(jìn)化的驅(qū)動(dòng)力[24]，由此本研究所制備的GP4單克隆抗體可為后續(xù)中和表位的研究奠定基礎(chǔ)。于潔等[25]原核表達(dá)并純化PRRSV N蛋白免疫小鼠，制備獲得4株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，均能與PRRSV特異性反應(yīng)。周艷君等[26]利用PRRSV CH-1a株濃縮的病毒抗原免疫小鼠，取脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，共篩選到16株能穩(wěn)定分泌抗體的單細(xì)胞克隆株，且都是針對(duì)PRRSV的特異性抗體。劉夢(mèng)瑩等[27]利用PRRSV SD53株超離病毒免疫小鼠，采用PRRSV SD53株和真核表達(dá)的PRRSV各結(jié)構(gòu)蛋白作為檢測(cè)抗原，篩選到1株穩(wěn)定分泌抗SD53株GP4蛋白的雜交瘤細(xì)胞株（LM26)，并鑒定出LM26識(shí)別的抗原表位，且該抗原表位在美洲型PRRSV中相對(duì)保守。Chen等[28]表達(dá)并純化重組GP4蛋白，經(jīng)過(guò)噬菌體展示和篩選，可進(jìn)行PRRSV與其他病毒的鑒別診斷，同時(shí)在篩選噬菌體上展示的外源肽顯示出對(duì)GP4蛋白的高親和力，并在體外對(duì)PRRSV滲透具有顯著的抑制作用。GP4單克隆抗體不僅可以用于抗原的檢測(cè)，對(duì)于PRRSV相關(guān)的機(jī)理研究也有著重要作用。

本研究將PRRSV ORF4序列合成后克隆入pET-32a原核表達(dá)載體，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)獲得了大小為30 kDa的GP4蛋白，該蛋白為可溶表達(dá)且表達(dá)量高。純化后免疫小鼠制備單克隆抗體，共篩選出4株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，分別為6、21、60、70號(hào)，并選擇70號(hào)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行單克隆抗體的制備。IFA及Western blot結(jié)果表明，所制備單克隆抗體特異性強(qiáng)，可用于PRRSV的檢測(cè)及診斷試劑的研制。