常軍帥，趙 玉，段付霜，屈勇剛，梁 晏，李 娜

（1. 石河子大學(xué)動物科技學(xué)院 石河子 832003；2.動物疾病防控兵團(tuán)重點實驗室 石河子 832003）

糞腸球菌（Enterococcusfaecalis）是腸球菌屬一種寄生于胃腸道的革蘭陽性菌，它作為一種機(jī)會致病菌，在免疫功能低下的宿主中引起系統(tǒng)性感染，如敗血癥、心內(nèi)膜炎或腦膜炎[1-3]。在牛群中，腸球菌與犢牛腹瀉和奶牛乳腺炎有關(guān)，有實驗證明它們的致病性可能會導(dǎo)致不同階段的乳腺感染[4]，奶牛乳房皮膚上存在的腸球菌，也可能污染相應(yīng)的牛奶樣本[5]。除了它們在導(dǎo)致動物發(fā)生疾病中的重要性外，攜帶抗生素耐藥性基因的能力方面也值得重視[6]。致病性和耐抗生素的腸球菌可能通過受亞臨床或潛伏性乳腺炎感染的生奶制品傳播給人類[7-8]?？股啬退幮悦磕陮?dǎo)致全球70萬人死亡[9-10]，耐多藥細(xì)菌的高流行率和現(xiàn)有抗生素治療的低效率激發(fā)了人們尋找可行的替代方案。

噬菌體廣泛存在于自然界，凡是有細(xì)菌存在的地方就會有相應(yīng)的噬菌體，噬菌體作為一種感染細(xì)菌的病毒，在微生態(tài)系統(tǒng)中，具有著重要的地位[11-13]。噬菌體在不同環(huán)境壓力下都可存活，作為載體，在毒力基因、耐藥基因傳播過程中發(fā)揮著重要作用[11,14]。噬菌體通常攜帶一些非必要的毒力基因，且與噬菌體的進(jìn)化存在著連續(xù)性[13]。Mazaheri等[15]的一項研究表明，噬菌體EFRM31能夠有效地將慶大霉素耐藥性轉(zhuǎn)導(dǎo)到多種腸球菌。目前，對于奶牛乳房炎的研究主要集中在病原菌的多樣性，而忽視了對噬菌體多樣的研究[16-18]。因此本研究中，我們以糞腸球菌SL22作為宿主菌，從臨床型奶牛乳房炎乳樣中分離糞腸球菌噬菌體，并鑒定其生物學(xué)特性及毒力基因、耐藥基因存在情況，為進(jìn)一步研究臨床型乳房炎奶牛乳房中的噬菌體多樣性、微生態(tài)關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品來源及菌株準(zhǔn)備 47份臨床型乳房炎乳樣（通過CMT及SCC進(jìn)行檢測）采自北疆某規(guī)?；膛觯?周齡SPF級小鼠24只（雌雄對半），體重約25 g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心；試驗用菌株均由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院傳染病實驗室分離鑒定。

1.2 主要培養(yǎng)基和試劑 BHI培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；瓊脂粉、PEG8000、2%磷鎢酸負(fù)染液購自北京索萊寶科技有限公司；病毒基因 DNA/RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；DNase I、RNase A和Mung Bean Nuclease 購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；SM緩沖液購自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 噬菌體的分離與純化 以糞腸球菌SL22為宿主菌，加1 mL對數(shù)生長期的菌液進(jìn)入200 mL的BHI培養(yǎng)基后，再與47份臨床型乳房炎乳樣組成的200 mL樣品混勻，在37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)180 r/min培養(yǎng)。從第12 h開始，每隔2 h取樣10 mL，直到第24 h結(jié)束。取出的樣品在4℃、10 000×g離心15 min，取中間較為清亮的液體過0.22 μm濾膜，之后參考文獻(xiàn)[19]，用點滴法及雙層瓊脂平板法檢測是否有噬菌體。

采用雙層瓊脂平板法進(jìn)行純化噬菌體，挑取噬菌斑大而透亮的反復(fù)純化5次以上，直到一個平板上噬菌斑大小均勻一致。

1.4 噬菌體的濃縮及電鏡觀察 參考文獻(xiàn)[20]，使用PEG8000對噬菌體進(jìn)行濃縮。濃縮液用氯仿去除雜質(zhì)后，滴加20 μL于銅網(wǎng)上吸附5 min，用濾紙吸干多余水分，置銅網(wǎng)于2%磷鎢酸負(fù)染液內(nèi)作用3 min，干燥后即可在電鏡下進(jìn)行觀察。

1.5 噬菌體的基因組鑒定 按照病毒基因 DNA/RNA提取試劑盒說明書對噬菌體進(jìn)行核酸提取，測定核酸濃度后，分為4組，其中3組分別根據(jù)核酸濃度加入一定量的DNase I、RNase A和Mung Bean Nuclease，在37℃水浴鍋內(nèi)作用1 h。作用后的樣品加入適量loading buffer，采用瓊脂糖（0.7%）凝膠電泳法對消化產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

1.6 噬菌體的生物學(xué)特性研究

1.6.1 宿主譜的測定 將100 μL對數(shù)期菌液與100 μL噬菌體液混勻吸附15 min，利用雙層瓊脂平板法測定其裂解譜。測定菌株包括SL22、實驗室保存的牛源糞腸球菌、雞源糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及無乳鏈球菌。

1.6.2 最佳感染復(fù)數(shù)測定（multiplicity of infection，MOI） 參考文獻(xiàn)[21]，略有修改。將已知滴度的噬菌體液與等體積不同濃度的對數(shù)生長期宿主菌，按照不同MOI（MOI=100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001）的比例混勻吸附10 min，加入5 mL的BHI培養(yǎng)基后在37℃恒溫振蕩器內(nèi)培養(yǎng)5 h。利用雙層瓊脂平板法測定不同組的噬菌體效價，單位為PFU/mL。重復(fù)3次，取平均值（噬菌斑30～300為有效數(shù)據(jù)），滴度最高的組為最佳MOI。

1.6.3 一步生長曲線的測定 按照最佳MOI的比例在200 mL的BHI培養(yǎng)基內(nèi)加入噬菌體及其宿主菌，在不同時間內(nèi)取5 mL液體，離心后測噬菌體滴度。重復(fù)3次，每次2個平行，取平均值繪制一步生長曲線圖。

1.6.4 熱穩(wěn)定性的測定 取50 mL已知滴度的噬菌體液，平均分裝在30個1.5 mL的無菌EP管內(nèi)。30個樣品根據(jù)不同溫度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）分為5個組，各組每隔10 min取1個樣品測其滴度，直到取完為止。重復(fù)3次，取平均值繪制折線圖。

1.6.5 酸堿耐受性的測定 在12個1.5 mL的無菌EP管內(nèi)，各加入100 μL高滴度的噬菌體液。取900 μL不同pH的無菌BHI培養(yǎng)基加入混勻，在37℃水浴鍋內(nèi)作用1 h，測不同組的噬菌體效價。重復(fù)3次，取平均值繪制曲線圖。

1.6.6 紫外耐受性的測定 取5 mL噬菌體增殖液置于直徑為90 mm的一次性平皿內(nèi)，開蓋放于超凈臺內(nèi)的紫外燈（18 W）下15 cm進(jìn)行照射2 h，期間每隔20 min取100 μL測定噬菌體效價。重復(fù)3次，取平均值。

1.6.7 有機(jī)溶劑耐受性的測定 在5個1.5 mL的無菌EP管內(nèi)，各加入500 μL高滴度的噬菌體液，再取500 μL不同的有機(jī)溶劑（過氧乙酸、氯仿、異戊醇、甲醇、乙醇）分別加入混勻。在室溫下作用1 h，測不同組的噬菌體效價。重復(fù)3次，取平均值。

1.7 小鼠治療試驗 參考文獻(xiàn)[22]，將小鼠隨機(jī)分為4組，每組6只。第1組每只小鼠腹腔注射1倍LD100的菌液量；第2組每只小鼠腹腔注射1倍LD100的菌液量，2 h后再次注射一定量的噬菌體液（按照最佳MOI的比例）；第3組每只小鼠腹腔注射與第2組等體積等滴度的噬菌體液；第4組每只小鼠腹腔注射與1組等體積的生理鹽水溶液。觀察72 h內(nèi)小鼠精神狀態(tài)及死亡情況。

1.8 毒力基因與耐藥基因檢測 糞腸球菌毒力基因參考文獻(xiàn)[23]，耐藥基因參考文獻(xiàn)[24-26]。由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，根據(jù)參考文獻(xiàn)中的合成體系及退火溫度，對病毒基因DNA/RNA提取試劑盒提取出的糞腸球菌噬菌體核酸進(jìn)行PCR鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 噬菌體的純化及電鏡觀察 分離純化出了1株糞腸球菌噬菌體，暫命名為vB_EcoT_PSL22（簡稱PSL22）。在雙層瓊脂平板上，PSL22的噬菌斑呈透明的針尖狀（圖1）。在電鏡下噬菌體PSL22形態(tài)呈對稱性多面體，直徑約66 nm，無尾部（圖2）。依據(jù)《病毒分類—國際病毒分類委員會第9次報告》中對噬菌體階元的劃分及噬菌體常規(guī)命名方法，PSL22為無尾噬菌體，與復(fù)層病毒科噬菌體極為相似，進(jìn)一步鑒定可通過全基因組測序[27-28]。據(jù)以往報道，在副溶血弧菌噬菌體、雞源沙門菌噬菌體中也發(fā)現(xiàn)了復(fù)層病毒科噬菌體；在奶牛乳房中有長尾噬菌體的存在，這表明可能隨著引起奶牛乳房炎的病原菌的不同，乳房內(nèi)的噬菌體也呈現(xiàn)出多樣性[20,29-30]。

圖1 噬菌體PSL22 的噬菌斑形態(tài)Fig.1 Plaques morphology of phage PSL22

圖2 噬菌體PSL22 的透射電鏡觀察Fig.2 TEM observation of phage PSL22

圖3 噬菌體PSL22 基因組的鑒定Fig.3 Identif ication of the phage PSL22 Genomes

2.2 PSL22的基因組鑒定 噬菌體PSL22的基因經(jīng)過不同的核酸消除酶（RNase I、DNase A、 Mung Bean Nuclease）作用后，鑒定出噬菌體PSL22的基因組為雙鏈DNA（Double-stranded DNA，dsDNA）。這與宋增福等[29-30]對復(fù)層病毒科噬菌體的核酸類型研究結(jié)果一致。

2.3 噬菌體的生物學(xué)特性研究 在宿主譜的測定中（表1），PSL22只能裂解其宿主菌，可能受實驗室糞腸球菌數(shù)量少所影響，后期發(fā)現(xiàn)新的菌株可補(bǔ)充測定；對其他糞腸球菌及大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌未發(fā)現(xiàn)有裂解現(xiàn)象，這與目前報道的絕大多數(shù)噬菌體一樣，無跨種裂解能力。在其他生物學(xué)測定中，PSL22最佳MOI為0.1（圖4A），在奶牛乳房中可裂解大量宿主菌；一步生長曲線中（圖4B），確定出了PSL22的感潛伏期約20 min，爆發(fā)期約130 min（20～150min ），裂解量約為52 PFU/cell（裂解量＝裂解爆發(fā)末期噬菌體滴度/初期感染宿主菌濃度），說明該株噬菌體可對宿主菌進(jìn)行長時間裂解。在熱穩(wěn)定性的測定（圖4C）、酸堿耐受性的測定（圖4D）、紫外耐受性的測定（圖4E）、有機(jī)溶劑耐受性的測定（圖4F）中，發(fā)現(xiàn)PSL22在70℃溫度下，40 min就可使PSL22完全失活；對酸不耐受；紫外下2 h就可徹底失活。研究結(jié)果說明PSL22生存空間較廣泛，對處于不同環(huán)境中的宿主菌都能裂解。

表1 噬菌體PSL22 的宿主范圍Table 1 Host range of phage PSL22

圖4 噬菌體PSL22 生物學(xué)特性Fig.4 Biological properties of the phage PSL22

2.4 小鼠治療試驗 通過之前對SL22的測定記錄，LD100為5.6×1010CFU/只。為了解PSL22在奶牛乳房內(nèi)是否有效裂解宿主菌，通過對小鼠分組注射不同的樣品（表2），得出PSL22對小鼠的治愈率為33.33%（2/6），說明PSL22在奶牛乳房內(nèi)可對宿主菌起到裂解作用，進(jìn)而減少乳房炎的發(fā)生。趙影等[29]得出經(jīng)過噬菌體治療后，小鼠臟器的病理變化較攻毒組減輕，與本研究結(jié)果相同。

表2 PSL22 對小鼠治療試驗Table 2 PSL22 treatment trial for mice

2.5 毒力基因與耐藥基因檢測 通過PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)PSL22含有2個耐藥基因，為Acc和aac(3)-IV（圖5A）。噬菌體結(jié)構(gòu)簡單，作為最佳載體之一，在抗生素耐藥基因（ARGs）轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用。據(jù)報道某些ARGs可通過噬菌體在微生態(tài)環(huán)境中自由傳遞，進(jìn)而推動生物的多樣性[31]。PSL22含有4種毒力基因，分別為gelE、cylA、ace和efaA（圖5B）。噬菌體通常會攜帶部分病毒非必要基因，宿主菌可通過轉(zhuǎn)化噬菌體編碼的毒力基因，來使宿主菌更快適應(yīng)環(huán)境。通過本次檢測PSL22存在的潛在風(fēng)險，將不會考慮將其作為治療性噬菌體在臨床中使用。考慮其科研方面的價值，將來可進(jìn)一步研究其耐藥基因、毒力基因傳播的機(jī)理。

圖5 PSL22 部分基因擴(kuò)增結(jié)果Figure 5 Results of gene amplif ication in PSL22

奶牛乳房微生態(tài)系統(tǒng)中，噬菌體與宿主菌的相互利用，促進(jìn)了微生態(tài)的多樣性。未來，可通過更先進(jìn)的方法和手段去了解噬菌體與宿主菌的進(jìn)化機(jī)制，以便全面的解釋奶牛乳房中噬菌體與細(xì)菌的相互關(guān)系。