高 晗,李 妍,田 方,李雪利

(1.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司,河北 石家莊 051430;2.云南神威施普瑞藥業(yè)有限公司,云南 楚雄 675000;3.唐山學(xué)院外國(guó)語(yǔ)學(xué)院,河北 唐山 063000)

連翹為木樨科植物連翹的干燥果實(shí),根據(jù)采收季節(jié)及炮制方式不同分為“青翹”和“老翹”[1],其味苦、性微寒,歸肺、心、小腸經(jīng),具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱的功效。有研究結(jié)果顯示,連翹具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、抗病毒、抗過(guò)敏、神經(jīng)保護(hù)等作用[2-7]。目前,在連翹的提取物中共發(fā)現(xiàn)237種化合物,其中包括46種木脂素,31種苯乙醇糖苷,11種黃酮類(lèi)化合物,80種萜類(lèi),20種環(huán)己醇衍生物,6種生物堿,4種類(lèi)固醇和39種其他化合物[8]。其中,揮發(fā)性成分主要有α-松油烯、α-蒎烯、莰烯檜烯、β-蒎烯、α-水芹烯、α-松油烯、檸檬烯、β-水芹烯、γ-萜品烯、萜品油烯、β-月桂烯、β-羅勒烯、(+)-蒈烯、α-羅勒烯、芳樟醇、松油烯-4-醇、α-松油醇、反式香芹醇、樟腦[9-13]。

氣相色譜-離子遷移譜法(GC-IMS)將GC和IMS技術(shù)進(jìn)行結(jié)合,使得GC分析得到的化學(xué)信息更豐富,克服了IMS技術(shù)分離度差的問(wèn)題。相較于GC-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等常用的揮發(fā)性成分檢測(cè)方法,GC-IMS具有快速、靈敏、無(wú)需前處理的優(yōu)勢(shì)[14],已應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品、藥品測(cè)定等多個(gè)領(lǐng)域[15]。本研究依托GC-IMS技術(shù)對(duì)連翹飲片及其標(biāo)準(zhǔn)湯劑、揮發(fā)油包合物中揮發(fā)性成分進(jìn)行差異分析,在明確揮發(fā)性成分種類(lèi)的基礎(chǔ)上,明確了在連翹藥材提取、制備成標(biāo)準(zhǔn)湯劑過(guò)程中揮發(fā)性成分的傳遞情況。同時(shí),本研究還分析了連翹揮發(fā)油包合物與標(biāo)準(zhǔn)湯劑中揮發(fā)性成分的組成,旨在為連翹配方顆粒生產(chǎn)、質(zhì)量控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1材料 FlavourSpec?型氣相離子遷移譜聯(lián)用儀(濟(jì)南海能儀器股份有限公司),十萬(wàn)分之一CPA225D 電子分析天平(德國(guó)賽多利斯股份公司),高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司),養(yǎng)生藥膳壺(合肥榮事達(dá)小家電有限公司),R502B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司),2 L圓底燒瓶,MH-2000調(diào)溫型電熱套(北京科偉永興儀器有限公司),β-環(huán)糊精(安徽山河藥用輔料股份有限公司),95%乙醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,分析純)。水為純化水,其余試劑均為分析純。連翹藥材(產(chǎn)地:陜西商洛;批號(hào):2012231;揮發(fā)油含量:0.025%),經(jīng)原河北省藥品檢驗(yàn)所鑒定為木樨科植物連翹Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl的干燥果實(shí)。

1.2方法

1.2.1樣品前處理 (1)連翹飲片供試品制備:取連翹藥材,除去雜質(zhì)及異物,即得連翹飲片[16]。稱取連翹飲片1.0 g(過(guò)四號(hào)篩),精密稱定,置20 mL頂空瓶中。(2)連翹揮發(fā)油供試品制備:取連翹飲片20 g(批號(hào):2012231),按2020年版《中國(guó)藥典》2204揮發(fā)油測(cè)定法中甲法[17]進(jìn)行揮發(fā)油提取。將冷凝后的揮發(fā)油由活塞口放出,加入無(wú)水硫酸鈉適量,靜置脫水20 min,精密量取連翹揮發(fā)油0.025 mL,置20 mL頂空瓶中。(3)連翹標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品制備:取連翹飲片100 g,加水煎煮2次,一煎加8倍水,浸泡30 min,煮沸,保持微沸煎煮20 min,120目篩網(wǎng)過(guò)濾,立即冷卻至室溫;二煎加6倍水,煮沸,保持微沸煎煮15 min,120目篩網(wǎng)過(guò)濾,立即冷卻至室溫;合并2次煎液,低溫真空濃縮(濃縮溫度小于或等于60 ℃)至生藥比1∶3(g/mL),即得連翹標(biāo)準(zhǔn)湯劑[18-19]。分別精密量取連翹第1次提取液(4 mL)、第2次提取液(6 mL)、總提取液(14 mL)、標(biāo)準(zhǔn)湯劑(8 mL)、旋出液(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)出的液體,11 mL),置20 mL頂空瓶中。(4)連翹揮發(fā)油包合物供試品制備:按1 mL∶15 g(連翹揮發(fā)油∶β-環(huán)糊精)比例稱取β-環(huán)糊精,加入6倍量水?dāng)嚢杈鶆?。取連翹揮發(fā)油適量,按連翹揮發(fā)油與乙醇1∶1比例加入乙醇,攪拌均勻。向β-環(huán)糊精水溶液中緩慢滴入揮發(fā)油乙醇溶液,設(shè)定包合溫度50 ℃,包合時(shí)間2 h,真空干燥。精密稱定連翹揮發(fā)油包合物0.375 g,置20 mL頂空瓶中。

1.2.2測(cè)定條件 將上述供試品于75 ℃孵化20 min,頂空進(jìn)樣,使用GC-IMS進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定條件:FS-SE-54-CB-1色譜柱(0.53 mm×15 m,1 μm),載氣/飄移氣為氮?dú)?氣流量150 mL/min,探測(cè)器溫度45 ℃,載氣流量程序設(shè)定(0～2 min,2 mL/min;2～15 min,2 mL/min→10 mL/min;15～30 min,10 mL/min→150 mL/min;30～40 min,150 mL/min),柱溫75 ℃,進(jìn)樣針溫度85 ℃,進(jìn)樣量200 μL。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用儀器配套分析軟件,包括實(shí)驗(yàn)室分析查看器(LAV)、GC-IMS Library Search。LAV可用于查看分析譜圖,圖中每1個(gè)點(diǎn)代表1種揮發(fā)性有機(jī)物,對(duì)其建立標(biāo)準(zhǔn)曲線后進(jìn)行定量分析。其中,Reporter插件直接對(duì)比樣品之間的譜圖差異(二維俯視圖和三維譜圖);Gallery Plot插件可進(jìn)行指紋圖譜對(duì)比,直觀且定量地比較不同樣品之間揮發(fā)性有機(jī)物的差異。GC-IMS Library Search軟件內(nèi)置的NIST數(shù)據(jù)庫(kù)和IMS數(shù)據(jù)庫(kù)可對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析。

表1 連翹飲片揮發(fā)性成分匯總

2 結(jié) 果

2.1GC-IMS二維圖譜分析 不同供試品中均含多種揮發(fā)油性成分,且揮發(fā)油含量存在明顯差異。連翹飲片與連翹揮發(fā)油中揮發(fā)性成分基本一致;而連翹第1次提取液、第2次提取液、總提取液則明顯與連翹飲片不同,在氣相色譜保留時(shí)間600～800 s缺少相應(yīng)的揮發(fā)油成分;提取液濃縮過(guò)程中揮發(fā)性成分仍然在損失,800～1 000 s揮發(fā)性成分轉(zhuǎn)移至旋出液中。由連翹揮發(fā)油與連翹揮發(fā)油包合物比較可知,包合過(guò)程中,揮發(fā)性成分損失嚴(yán)重,部分揮發(fā)性成分未與β-環(huán)糊精形成包合而損失,僅部分揮發(fā)油形成穩(wěn)定的包合物。但連翹揮發(fā)油包合物與連翹標(biāo)準(zhǔn)湯劑中揮發(fā)性成分基本保持一致。見(jiàn)圖1。

圖1 GC-IMS二維圖譜

2.2GC-IMS指紋圖譜分析 以GC-IMS二維圖譜中的所有成分峰為分析對(duì)象,自動(dòng)生成指紋圖譜,見(jiàn)圖2。連翹提取液中仍然含有大量揮發(fā)油,包括α-蒎烯、檸檬烯及1、2、4、5、9、10、11物質(zhì)。連翹標(biāo)準(zhǔn)湯劑中主要含有的揮發(fā)油包括α-蒎烯、檸檬烯及1、2、4、5物質(zhì),且濃度和提取液中的基本一致,都是保留時(shí)間相對(duì)較小的物質(zhì)。而旋出液中則主要含有9、10、11物質(zhì),且濃度和提取液中的基本一致,都是保留時(shí)間相對(duì)較大的物質(zhì)。

注:每行代表1個(gè)樣品中全部的揮發(fā)性成分峰,每列代表同一種類(lèi)成分在不同供試品中的信號(hào)峰1～11未知成分。

連翹揮發(fā)油中的萜烯類(lèi)物質(zhì)濃度非常高,但做成連翹揮發(fā)油包合物后,揮發(fā)油濃度大幅降低,物質(zhì)的種類(lèi)則和連翹標(biāo)準(zhǔn)湯劑一致,濃度也相差不大,可以通過(guò)添加該包合物到連翹顆粒中來(lái)還原標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的揮發(fā)油。

2.3連翹樣品中揮發(fā)性成分定性分析 應(yīng)用GC-IMS Library Search軟件內(nèi)置的NIST數(shù)據(jù)庫(kù)和IMS數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)連翹揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析,結(jié)果見(jiàn)圖3、表1。連翹揮發(fā)油含有14種成分,其中12種為未知成分,3種已知成分分別為α-蒎烯、檸檬烯、芳樟醇。

圖3 連翹飲片揮發(fā)性成分定性分析

3 討 論

FlavourSpec?型氣相離子遷移譜聯(lián)用儀在非真空且無(wú)樣品前處理前提下,經(jīng)頂空進(jìn)樣后可快速檢測(cè)連翹飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、揮發(fā)油包合物中的揮發(fā)性成分,其根據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)GC保留時(shí)間和離子遷移時(shí)間進(jìn)行定性分析。本研究共檢測(cè)出14種揮發(fā)性化合物成分,并通過(guò)NIST2014氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)與IMS數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),確定了3種揮發(fā)性物質(zhì)。對(duì)連翹飲片、連翹標(biāo)準(zhǔn)湯劑、連翹揮發(fā)油包合物的揮發(fā)性成分進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析,可對(duì)連翹配方顆粒生產(chǎn)具有一定指導(dǎo)意義。

連翹中萜烯類(lèi)揮發(fā)油在GC-IMS圖譜中的出峰形狀非常有特點(diǎn),在同一保留指數(shù)下有很多不同遷移時(shí)間的樣品峰,形成一條橫向的條帶,容易識(shí)別。從GC-IMS圖譜中條帶數(shù)目及亮度可以看出,連翹飲片的第1次提取液、第2次提取液及混合液中揮發(fā)油成分基本一致。連翹藥材和揮發(fā)油中的萜烯類(lèi)物質(zhì)非常豐富,而提取液中主要含有α-蒎烯、檸檬烯及1、2、4、5、9、10、11物質(zhì)。連翹標(biāo)準(zhǔn)湯劑中含有較低保留指數(shù)的揮發(fā)油,包括α-蒎烯、檸檬烯及1、2、4、5物質(zhì);而保留指數(shù)相對(duì)高的揮發(fā)油(9、10、11物質(zhì))則進(jìn)入旋出液中。揮發(fā)油在包埋過(guò)程中大量損失,包合物中含有的萜烯類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)和連翹標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的一致,且濃度相似,因此可以直接添加到連翹顆粒中用于還原標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的揮發(fā)油。本研究通過(guò)對(duì)連翹飲片、連翹標(biāo)準(zhǔn)湯劑、連翹揮發(fā)油包合物的揮發(fā)性成分進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析,最大限度地還原了標(biāo)準(zhǔn)湯劑中揮發(fā)油類(lèi)成分,為后續(xù)配方顆粒生產(chǎn)過(guò)程中揮發(fā)油的控制提供了保證。

綜上所述,連翹揮發(fā)油包合物與連翹揮發(fā)油成分存在差異,但與連翹標(biāo)準(zhǔn)湯劑基本一致,可為連翹配方顆粒生產(chǎn)、質(zhì)量控制提供參考。本研究豐富了連翹標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備過(guò)程中揮發(fā)油類(lèi)成分轉(zhuǎn)移的研究,但僅鑒定出3種成分,可能為標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備過(guò)程中揮發(fā)油類(lèi)成分的組分發(fā)生一定變化所致,因此下一步將繼續(xù)進(jìn)行深入研究。