超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定羅非魚中甲基睪酮?dú)埩?/h1>
2024-05-10 07:34張楊張兵李凱華徐媛原張微肖曼吳丹張玲
中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn) 2024年1期
張楊,張兵,李凱華,徐媛原,張微,肖曼,吳丹,張玲
(深圳市質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測研究院,廣東 深圳518055)
羅非魚(Oreochromsmossambcus)隸屬于硬骨魚綱(Osteichthyes)、鱸形目(Perciformes)、慈鯛科(Cichlidae)、羅非魚屬(Tilapia),原產(chǎn)自非洲,又名非洲鯽魚,有600多個品種。羅非魚是雜食性的魚類,對環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng),其肌肉間無刺,而且肉質(zhì)細(xì)膩,是世界性的水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類,也是全球推廣的蛋白質(zhì)來源品種[1-2]。在羅非魚的生長發(fā)育過程中,雄性羅非魚的生長速率更快。雌性羅非魚自然繁殖周期短,每隔12至25天可繁殖一次,大量的能量消耗影響其生長速度、養(yǎng)殖密度和成魚規(guī)格[3]。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中,為了提高養(yǎng)殖產(chǎn)量和效益,常采用單雄性的養(yǎng)殖方法。通過羅非魚苗種性別調(diào)控來獲得全雄性苗種的方法主要有種間雜交、性激素誘導(dǎo)和三系配套技術(shù)。種間雜交法,受親本純度和環(huán)境因素影響大,雜交后代均勻度低;三系配套技術(shù)受限于超雄魚的育種而影響推廣;性激素誘導(dǎo)羅非魚育苗雄性化在養(yǎng)殖生產(chǎn)中被廣泛采用[3-4]。用甲基睪酮來提高雄性率的處理方法包括注射、伴餌投喂和養(yǎng)殖水加藥浸泡等,其中投喂和浸泡是生產(chǎn)上使用較多的方法[5]。除了用于育苗增產(chǎn),也可通過甲基睪酮進(jìn)行性逆轉(zhuǎn)來避免魚塘中羅非魚的過度繁殖[5]。
甲基睪酮(17α-Methyltestosterone)化學(xué)式為C20H30O2,是一種合成類固醇,也稱為甲睪酮、甲基睪丸酮等,屬于雄激素和蛋白同化激素,兼具雄性化與促進(jìn)肌肉生長的作用,在水產(chǎn)育種和養(yǎng)殖過程中常被使用[6-8]。由于同化激素能改善飼料轉(zhuǎn)化效率,提高經(jīng)濟(jì)效益,上世紀(jì)50年代開始被大量使用在食品動物養(yǎng)殖中,而殘留在動物體內(nèi)的外源性激素會通過食物鏈進(jìn)入人體,長期食用含有同化激素的動物組織會給人體帶來健康風(fēng)險。甲基睪酮?dú)埩魧θ梭w的影響是慢性可累積的,長期積累會影響人體內(nèi)自然激素平衡,可能造成激素調(diào)節(jié)的相關(guān)身體機(jī)能發(fā)生紊亂[9-11],如女性出現(xiàn)多毛、閉經(jīng)等癥狀。有研究表明,在養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中羅非魚停用甲基睪酮后,其代謝周期符合指數(shù)遞減規(guī)律,但是在一定代謝周期內(nèi),其殘留仍能被檢測到[12]。歐盟在上世紀(jì)90年代針對出口到歐盟的動物源性產(chǎn)品發(fā)布相關(guān)指令,規(guī)定禁止使用雄激素、孕激素、促甲狀腺素和beta-激動劑等藥物飼養(yǎng)動物或養(yǎng)殖水產(chǎn)品。中國發(fā)布的NY 5071—2002《無公害食品 漁用藥物使用準(zhǔn)則》中也早已規(guī)定不得在水產(chǎn)品養(yǎng)殖中使用甲基睪酮等激素。為了更好地規(guī)范水產(chǎn)養(yǎng)殖中的藥物使用,保障食品安全,現(xiàn)行的《中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告 第250號》也明確規(guī)定食品動物中禁止使用甲基睪酮,并不得在所有可食性組織中檢出。
中國羅非魚的養(yǎng)殖產(chǎn)量約占全球總產(chǎn)量的一半[9]。羅非魚是中國優(yōu)勢出口水產(chǎn)品,也是居民日常消費(fèi)的重要水產(chǎn)品,其質(zhì)量安全受到高度關(guān)注。外源性激素殘留水平高可能對消費(fèi)者造成潛在危害,對羅非魚中甲基睪酮?dú)埩袅康臋z測非常必要[13]。目前,國內(nèi)甲基睪酮檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法有GB 31656.14—2022[14]、GB/T 21981—2008[15]、農(nóng)業(yè)部1031號公告—1—2008[16]、SN/T 3235—2012[17]、SN/T 2443—2010[18]、SC/T 3029—2006[19]等。羅非魚中甲基睪酮的測定一般采用液相色譜法或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。在日常檢測中發(fā)現(xiàn),甲基睪酮?dú)埩袅康臋z測受基質(zhì)影響較大、檢測結(jié)果重復(fù)性差,且前處理提取和凈化過程均耗時較長、試劑消耗大。本研究在標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上,優(yōu)化了前處理過程、質(zhì)譜和色譜儀器條件、對比了不同成分QuEChERS分散吸附劑的凈化提取效果,經(jīng)陽性質(zhì)控樣品驗(yàn)證,建立了快速靈敏的檢測方法,大幅縮短了檢測時長,適用于大批量實(shí)際樣品的檢測,以期節(jié)省人力物力成本,更為簡便、高效地定量檢測甲基睪酮?dú)埩袅俊?/p>
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
甲基睪酮(17-alpha-Methyltestosterone,純度(97.41±0.41)%,CAS No. 58-18-4,德國Dr. Ehernstorfer公司);甲基睪酮-D3(Methyltestosterone-D3,純度(99.0±0.2)%,CAS No. 96425-03-5,WITEGA 公司)。
試驗(yàn)用水為符合GB/T 6682—2008規(guī)定的一級水;甲醇、乙腈(色譜純,德國MERCK公司);乙酸銨(色譜級,≥99.0%,Aladdin上海公司);甲酸[色譜純97%,阿法埃莎(中國)化學(xué)有限公司];有機(jī)濾膜(0.22 μm,PTFE,上海安譜公司);色譜柱(BEH C181.7 μm,ACQUITY UPLC,Waters 公司);QuEChERS凈化提取劑組分(PSA、石墨化炭、C18、MgSO4,Agilent Technologies公司)。
實(shí)驗(yàn)用羅非魚來源于深圳市水產(chǎn)品零售市場。陽性質(zhì)控樣品分別購自壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心、河南標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)中心。
1.2 儀器與設(shè)備
Agilent 1290 超高效液相色譜儀、配有電噴霧(ESI)離子源的AB Sciex Triple Quad TM 5500 質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司);OA-SYS 24位自動水浴氮吹儀(Organomation公司);BSA2202S-CW型電子天平(Sartorius科學(xué)儀器(北京)有限公司);Bead Ruptor Elite多功能生物樣品均質(zhì)器(美國OMNI公司);MTV-100型多管旋渦混合儀(杭州奧盛儀器有限公司);3-30ks冷凍高速離心機(jī)(Sigma公司)。
1.3 樣品前處理方法
1.3.1 制樣
試樣制備過程參照GB/T 21981—2008《動物源食品中激素多殘留檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》進(jìn)行優(yōu)化,將羅非魚去頭、骨、內(nèi)臟,取肌肉等可食部分,切成不大于1 cm×1 cm×1 cm的小塊,絞碎混勻再充分勻漿,制成試樣備用。
1.3.2 提取
準(zhǔn)確稱取羅非魚勻漿試樣2.50 g(精確至0.01 g)于30 mL研磨管中,準(zhǔn)確加入0.1 μg/mL甲基睪酮-D3內(nèi)標(biāo)工作溶液50 μL,渦旋混合60 s,加入5 g 規(guī)格為2.8 mm的陶瓷研磨珠和10 mL 1%甲酸-乙腈溶液(甲酸/乙腈,1∶99,V/V),用Bead Ruptor Elite多功能生物樣品均質(zhì)器以3 m/s的均質(zhì)速度,均質(zhì)震蕩30 s,以6 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min,轉(zhuǎn)移全部的上清提取液于另一潔凈的帶蓋聚丙烯離心管中,待凈化。
1.3.3 凈化
將QuEChERS凈化劑以下簡稱Q1(100 mg PSA、50 mg C18、50 mg石墨化炭,600 mg MgSO4)加入上述提取液中,旋緊螺旋蓋,用多管旋渦混合儀以2 000 r/min,渦旋混合1 min,以9 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min。吸取4 mL上清有機(jī)相溶液,于45 ℃水浴氮吹至近干。準(zhǔn)確加入1.0 mL 10%乙腈-水溶液(乙腈/水,10∶90,V/V)溶解殘?jiān)?渦旋振蕩溶解殘留物,0.22 μm濾膜過濾至1 mL玻璃進(jìn)樣瓶,待測。
1.4 儀器條件
1.4.1 液相色譜條件
色譜柱:BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:5.0 μL;流速:0.30 mL/min;流動相A為0.1%甲酸水溶液;流動相B為甲醇。流動相梯度洗脫程序見表1。
表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient Elution Conditions
1.4.2 質(zhì)譜條件
電離方式:電噴霧離子源(ESI),正離子模式;掃描檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(Multiple reaction monitoring, MRM);電噴霧電壓:5 500 V;離子源溫度:550 ℃;氣簾氣壓力:35.0 psi;碰撞氣壓力:9 psi;霧化器壓力:55.0 psi;輔助加熱器壓力:55.0 psi。定性離子對、定量離子對、去簇電壓及碰撞能量參數(shù)見表2。
表2 MRM掃描模式的參數(shù)Tab.2 Parameters of MRM
1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線
分別取10、20、50、100、200、500 μL濃度0.1 μg/mL的甲基睪酮外標(biāo)工作溶液于玻璃離心管中,分別加入0.1 μg/mL甲基睪酮-D3內(nèi)標(biāo)工作溶液50 μL,氮?dú)獯蹈?加入步驟1.3處理所得的基質(zhì)空白溶液1mL,混合1min,配制成濃度為1～50 ng/mL系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液,經(jīng)超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定,以甲基睪酮特征離子色譜峰的峰面積與內(nèi)標(biāo)物甲基睪酮-D3特征色譜峰的峰面積比值為縱坐標(biāo)、相應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
1.6 方法驗(yàn)證
按照SN/T 5326.2—2020《進(jìn)出口食品化妝品專業(yè)分析方法驗(yàn)證指南 第2部分 化學(xué)方法》中5.2方法性能參數(shù)的驗(yàn)證章節(jié)中的方法,評估方法靈敏度[20]。驗(yàn)證程序采用概率統(tǒng)計(jì)法,當(dāng)被檢測目標(biāo)物質(zhì)甲基睪酮在羅非魚樣品基質(zhì)中被可靠檢出的概率達(dá)到95%以上時的濃度水平做為檢測方法對于該樣品基質(zhì)的檢出限。方法定量限滿足大于3倍檢出限或其信噪比大于等于10。
取已知陰性羅非魚肉樣品2.50 g,分別添加25、50、250 μL濃度為0.1 μg/mL甲基睪酮外標(biāo)工作液和50 μL濃度為0.1 μg/mL甲基睪酮-D3內(nèi)標(biāo)工作溶液,制得含量分別為1.00、2.00和10.00 μg/kg的3個濃度水平的加標(biāo)樣品,每個濃度進(jìn)行6個平行樣品的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),按1.3的方法進(jìn)行處理并定量分析,根據(jù)檢測結(jié)果計(jì)算加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。
將魚粉中甲基睪酮的質(zhì)控樣品的接受參考值作為約定真值,按照本實(shí)驗(yàn)方法處理過程進(jìn)行定量測定,分別檢測10個平行樣品,對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,檢測結(jié)果用于方法的驗(yàn)證。
2 結(jié)果與分析
2.1 方法優(yōu)化
2.1.1 檢測方法的選擇
液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是類固醇激素檢測的常用分析方法[21-22]。但氣質(zhì)法的前處理過程常需要進(jìn)行衍生化,過程復(fù)雜且耗時。超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的選擇性、特異性和靈敏度比液相色譜法更高,并減少了溶劑消耗、縮短了分析時間,被越來越多地使用于檢測復(fù)雜基質(zhì)中的痕量物質(zhì)[22]。國家標(biāo)準(zhǔn)方法中激素殘留的檢測也多采用液質(zhì)法。
2.1.2 提取劑的選擇
液質(zhì)法檢測激素殘留常用的試劑有甲醇、乙腈、乙酸乙酯等。GB 31656.14—2022[14]采用乙酸乙酯提取;GB/T 21981—2008[15]采用酶解后甲醇提取;農(nóng)業(yè)部1031號公告—1—2008[16]采用叔丁基甲醚提取;SN/T 3235—2012[17]和SN/T 2443—2010[18]采用乙腈提取。本研究在空白羅非魚試樣中添加內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)工作液制成10.0 μg/kg的甲基睪酮添加樣品,用于方法的優(yōu)化。對甲醇、乙酸乙酯、乙腈、1%甲酸-乙腈溶液和5%甲酸-乙腈溶液5種提取溶劑進(jìn)行對比試驗(yàn),結(jié)果表明這5種溶劑提取甲基睪酮的平均回收率相近,提取效率均較高(圖1),試驗(yàn)結(jié)果與聶建榮等[23]甲基睪酮?dú)埩籼崛〉难芯拷Y(jié)果一致。
圖1 不同提取劑對目標(biāo)物的回收率影響Fig.1 The effect of different extractants on the recovery rate of the target substance
不同溶劑對不同激素的提取效率不同,甲醇對多種雌激素的提取回收好,乙酸乙酯對部分雄激素和孕激素的提取效率高[24-26],乙腈對部分雄激素、孕激素和雌激素的提取回收率都較高[24]。在多類激素同時提取時,也有使用這3種提取劑的組合來達(dá)到更高的綜合提取效率[25]。試驗(yàn)結(jié)果表明,在使用乙酸乙酯作為提取劑時,甲基睪酮的平均回收率略低于其他提取劑,提取過程中較多的油脂被一同提取出來,氮吹后管內(nèi)有大量黃色的油脂殘存。甲醇提取的平均回收率偏高,為107.5%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差2.5%。上機(jī)檢測發(fā)現(xiàn)甲醇和乙酸乙酯在提取過程中出現(xiàn)了較多的基質(zhì)干擾成分,相鄰的雜峰較多,基質(zhì)干擾峰面積大(圖2)。使用乙腈或不同濃度酸化乙腈提取時的基質(zhì)干擾小,回收率相近,1%酸化乙腈的內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)的離子相應(yīng)值高于乙腈和5%酸化乙腈提取的甲基睪酮內(nèi)外標(biāo)離子響應(yīng)值,所以選擇1%酸化乙腈作為本方法的提取試劑。
圖2 不同提取劑的甲基睪酮定量離子色譜圖Fig.2 Quantitative ion chromatograms of methyltestosterone using different extractants
2.1.3 凈化方式的選擇
在激素殘留的檢測中,常通過比較不同的提取凈化方式來優(yōu)化前處理方法,減小基質(zhì)干擾的影響[27-28]。激素殘留常用有機(jī)溶劑渦旋或超聲的方式提取,液液萃取、分散固相萃取或固相萃取的方法來凈化除雜[22]。固相萃取法需要的有機(jī)溶劑量也較少,可以在過柱的過程中清理去除大部分雜質(zhì),從而減少基質(zhì)干擾。但使用固相萃取柱凈化的步驟,通常需要進(jìn)行活化、淋洗、洗脫等操作[29-30]。GB 31656.14—2022和GB/T 21981—2008都是經(jīng)過大量溶劑提取后,進(jìn)一步經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮再溶解,而后過柱凈化,整個前處理過程耗時長,且旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀能同時處理樣品的數(shù)量少,不能滿足多批量樣品的檢測需求。
利用溶劑渦旋提取和QuEChERS法的研究可以高效率的完成激素殘留處理。QuEChERS法采用在鹽溶液的存在下以水溶性溶劑萃取,促進(jìn)液相分離,再以分散性吸附劑與提取物混合來促進(jìn)清除基質(zhì)干擾。本研究對比了Q1(100 mg PSA、50 mg C18、50 mg石墨化炭,600 mg MgSO4),Q2(100 mg PSA、600 mg MgSO4),Q3(150 mg PSA、900 mg MgSO4),Q4(100 mg C18),Q5(100 mg 石墨化炭)這5種吸附劑組合對甲基睪酮的回收提取效果(圖3)。多組分的分散性吸附劑Q1與不同含量PSA的Q2和Q3凈化回收率相近,高于C18和石墨化炭的凈化回收率。Q2與Q3的色譜圖上的基質(zhì)干擾峰相同,并沒有隨著PSA含量的增加而減小基質(zhì)干擾。C18和石墨化炭色譜圖的離子響應(yīng)值都低于其他吸附劑,約為6.0×104(圖4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,單一的分散性吸附劑的凈化效果不充分,多種分散吸附劑組合可以達(dá)到更好的凈化效果。所以選擇Q1組分的QuEChERS吸附劑用于凈化除雜。
圖3 不同吸附劑對目標(biāo)物的回收率影響Fig.3 The effect of different adsorbents on the recovery rate of the target substance
圖4 不同吸附劑的甲基睪酮定量離子色譜圖Fig.4 Quantitative ion chromatograms of methyltestosterone using different adsorbents
2.1.4 其他因素
魚肉中激素的測定多受基質(zhì)干擾影響[31-32]。SN/T 3235—2012和SN/T 2443—2010標(biāo)準(zhǔn)方法中的甲基睪酮定量方法采用外標(biāo)法。為了不受實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定性變化影響,本方法使用內(nèi)標(biāo)法定量。同時,方法也對氮吹溫度35、40和45 ℃進(jìn)行對比,測得加標(biāo)回收率相近,精密度相似,結(jié)果表明甲基睪酮在這3種溫度下較穩(wěn)定,皆可用于氮吹,45 ℃時氮吹所用的時間最少。
2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線
按照1.5的方法繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)(圖5),表明在1～50 ng/mL的線性范圍內(nèi),待測物甲基睪酮的線性關(guān)系良好。
圖5 甲基睪酮標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.5 Standard working curve of methyltestosterone
2.3 方法檢出限與定量限
按照1.6進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。采用標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行檢測,得到0.30 μg/kg作為參考濃度,以1倍該濃度為參考檢出限(LODR)的6個標(biāo)準(zhǔn)添加樣品經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢測結(jié)果并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差SD為0.05,以LODR-3SD、LODR、LODR+3SD三個濃度水平分別檢測20個標(biāo)準(zhǔn)添加樣品,剛好有19個樣品能被有效檢出的濃度作為方法的檢出限。經(jīng)驗(yàn)證,確定甲基睪酮?dú)埩魴z測方法的檢出限為0.30 μg/kg,定量限大于3倍檢出限為1.0 μg/kg。方法檢出限驗(yàn)證數(shù)據(jù)見表3。
表3 方法檢出限驗(yàn)證數(shù)據(jù)Tab.3 Validation data for the detection limit in method n=20
2.4 回收率和精密度
向空白羅非魚樣品中添加3個濃度水平甲基睪酮的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(n=6),按照前面的處理的方法和條件進(jìn)行測定,計(jì)算每個濃度水平的平均回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。本方法的平均回收率為98.3%～103.0%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2%～8.8%。
表4 加標(biāo)回收和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Standard recovery rate and precision test results n=6
2.5 陽性樣品驗(yàn)證
將魚粉中甲基睪酮質(zhì)控樣品用于本方法的驗(yàn)證。按照魚粉質(zhì)控樣品分析證書中的說明,在空氣濕度≤40%,室溫約25 ℃的環(huán)境下準(zhǔn)確稱量質(zhì)控干粉0.5 g(精確至0.000 1 g),加入蒸餾水2.0 mL使其恢復(fù)為2.5 g的魚肉濕樣進(jìn)行檢測。2種陽性質(zhì)控分析魚粉均稱取10個平行樣品用于測定,檢測結(jié)果見表5。試驗(yàn)表明,本方法的檢測結(jié)果符合魚粉中甲基睪酮質(zhì)控樣品分析證書中給出的標(biāo)準(zhǔn)值擴(kuò)展不確定度范圍,檢測結(jié)果可靠,本方法可用于魚肉中甲基睪酮?dú)埩袅康臏y定。
表5 陽性樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab. 5 Positive sample test results n=10
3 結(jié)論
本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定羅非魚中甲基睪酮?dú)埩袅康姆椒?。對樣品制備、質(zhì)譜條件、提取溶劑、凈化方式等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,采用基質(zhì)加標(biāo)的方法建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,內(nèi)標(biāo)法定量數(shù)據(jù)分析。經(jīng)測定,甲基睪酮濃度在1～50 ng/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)為0.999 5。方法檢出限為0.30 μg/kg,定量限為1.0 μg/kg。方法的前處理步驟操作簡單,大大縮短了前處理所需時長,提高了檢測效率,且方法檢出限低、準(zhǔn)確度和精密度高,能滿足羅非魚中甲基睪酮?dú)埩袅繖z測要求,為相關(guān)部門開展針對羅非魚中甲基睪酮?dú)埩袅康谋O(jiān)測提供參考方法。
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張楊,張兵,李凱華,徐媛原,張微,肖曼,吳丹,張玲
(深圳市質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測研究院,廣東 深圳518055)
羅非魚(Oreochromsmossambcus)隸屬于硬骨魚綱(Osteichthyes)、鱸形目(Perciformes)、慈鯛科(Cichlidae)、羅非魚屬(Tilapia),原產(chǎn)自非洲,又名非洲鯽魚,有600多個品種。羅非魚是雜食性的魚類,對環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng),其肌肉間無刺,而且肉質(zhì)細(xì)膩,是世界性的水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類,也是全球推廣的蛋白質(zhì)來源品種[1-2]。在羅非魚的生長發(fā)育過程中,雄性羅非魚的生長速率更快。雌性羅非魚自然繁殖周期短,每隔12至25天可繁殖一次,大量的能量消耗影響其生長速度、養(yǎng)殖密度和成魚規(guī)格[3]。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中,為了提高養(yǎng)殖產(chǎn)量和效益,常采用單雄性的養(yǎng)殖方法。通過羅非魚苗種性別調(diào)控來獲得全雄性苗種的方法主要有種間雜交、性激素誘導(dǎo)和三系配套技術(shù)。種間雜交法,受親本純度和環(huán)境因素影響大,雜交后代均勻度低;三系配套技術(shù)受限于超雄魚的育種而影響推廣;性激素誘導(dǎo)羅非魚育苗雄性化在養(yǎng)殖生產(chǎn)中被廣泛采用[3-4]。用甲基睪酮來提高雄性率的處理方法包括注射、伴餌投喂和養(yǎng)殖水加藥浸泡等,其中投喂和浸泡是生產(chǎn)上使用較多的方法[5]。除了用于育苗增產(chǎn),也可通過甲基睪酮進(jìn)行性逆轉(zhuǎn)來避免魚塘中羅非魚的過度繁殖[5]。
甲基睪酮(17α-Methyltestosterone)化學(xué)式為C20H30O2,是一種合成類固醇,也稱為甲睪酮、甲基睪丸酮等,屬于雄激素和蛋白同化激素,兼具雄性化與促進(jìn)肌肉生長的作用,在水產(chǎn)育種和養(yǎng)殖過程中常被使用[6-8]。由于同化激素能改善飼料轉(zhuǎn)化效率,提高經(jīng)濟(jì)效益,上世紀(jì)50年代開始被大量使用在食品動物養(yǎng)殖中,而殘留在動物體內(nèi)的外源性激素會通過食物鏈進(jìn)入人體,長期食用含有同化激素的動物組織會給人體帶來健康風(fēng)險。甲基睪酮?dú)埩魧θ梭w的影響是慢性可累積的,長期積累會影響人體內(nèi)自然激素平衡,可能造成激素調(diào)節(jié)的相關(guān)身體機(jī)能發(fā)生紊亂[9-11],如女性出現(xiàn)多毛、閉經(jīng)等癥狀。有研究表明,在養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中羅非魚停用甲基睪酮后,其代謝周期符合指數(shù)遞減規(guī)律,但是在一定代謝周期內(nèi),其殘留仍能被檢測到[12]。歐盟在上世紀(jì)90年代針對出口到歐盟的動物源性產(chǎn)品發(fā)布相關(guān)指令,規(guī)定禁止使用雄激素、孕激素、促甲狀腺素和beta-激動劑等藥物飼養(yǎng)動物或養(yǎng)殖水產(chǎn)品。中國發(fā)布的NY 5071—2002《無公害食品 漁用藥物使用準(zhǔn)則》中也早已規(guī)定不得在水產(chǎn)品養(yǎng)殖中使用甲基睪酮等激素。為了更好地規(guī)范水產(chǎn)養(yǎng)殖中的藥物使用,保障食品安全,現(xiàn)行的《中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告 第250號》也明確規(guī)定食品動物中禁止使用甲基睪酮,并不得在所有可食性組織中檢出。
中國羅非魚的養(yǎng)殖產(chǎn)量約占全球總產(chǎn)量的一半[9]。羅非魚是中國優(yōu)勢出口水產(chǎn)品,也是居民日常消費(fèi)的重要水產(chǎn)品,其質(zhì)量安全受到高度關(guān)注。外源性激素殘留水平高可能對消費(fèi)者造成潛在危害,對羅非魚中甲基睪酮?dú)埩袅康臋z測非常必要[13]。目前,國內(nèi)甲基睪酮檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法有GB 31656.14—2022[14]、GB/T 21981—2008[15]、農(nóng)業(yè)部1031號公告—1—2008[16]、SN/T 3235—2012[17]、SN/T 2443—2010[18]、SC/T 3029—2006[19]等。羅非魚中甲基睪酮的測定一般采用液相色譜法或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。在日常檢測中發(fā)現(xiàn),甲基睪酮?dú)埩袅康臋z測受基質(zhì)影響較大、檢測結(jié)果重復(fù)性差,且前處理提取和凈化過程均耗時較長、試劑消耗大。本研究在標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上,優(yōu)化了前處理過程、質(zhì)譜和色譜儀器條件、對比了不同成分QuEChERS分散吸附劑的凈化提取效果,經(jīng)陽性質(zhì)控樣品驗(yàn)證,建立了快速靈敏的檢測方法,大幅縮短了檢測時長,適用于大批量實(shí)際樣品的檢測,以期節(jié)省人力物力成本,更為簡便、高效地定量檢測甲基睪酮?dú)埩袅俊?/p>
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
甲基睪酮(17-alpha-Methyltestosterone,純度(97.41±0.41)%,CAS No. 58-18-4,德國Dr. Ehernstorfer公司);甲基睪酮-D3(Methyltestosterone-D3,純度(99.0±0.2)%,CAS No. 96425-03-5,WITEGA 公司)。
試驗(yàn)用水為符合GB/T 6682—2008規(guī)定的一級水;甲醇、乙腈(色譜純,德國MERCK公司);乙酸銨(色譜級,≥99.0%,Aladdin上海公司);甲酸[色譜純97%,阿法埃莎(中國)化學(xué)有限公司];有機(jī)濾膜(0.22 μm,PTFE,上海安譜公司);色譜柱(BEH C181.7 μm,ACQUITY UPLC,Waters 公司);QuEChERS凈化提取劑組分(PSA、石墨化炭、C18、MgSO4,Agilent Technologies公司)。
實(shí)驗(yàn)用羅非魚來源于深圳市水產(chǎn)品零售市場。陽性質(zhì)控樣品分別購自壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心、河南標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)中心。
1.2 儀器與設(shè)備
Agilent 1290 超高效液相色譜儀、配有電噴霧(ESI)離子源的AB Sciex Triple Quad TM 5500 質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司);OA-SYS 24位自動水浴氮吹儀(Organomation公司);BSA2202S-CW型電子天平(Sartorius科學(xué)儀器(北京)有限公司);Bead Ruptor Elite多功能生物樣品均質(zhì)器(美國OMNI公司);MTV-100型多管旋渦混合儀(杭州奧盛儀器有限公司);3-30ks冷凍高速離心機(jī)(Sigma公司)。
1.3 樣品前處理方法
1.3.1 制樣
試樣制備過程參照GB/T 21981—2008《動物源食品中激素多殘留檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》進(jìn)行優(yōu)化,將羅非魚去頭、骨、內(nèi)臟,取肌肉等可食部分,切成不大于1 cm×1 cm×1 cm的小塊,絞碎混勻再充分勻漿,制成試樣備用。
1.3.2 提取
準(zhǔn)確稱取羅非魚勻漿試樣2.50 g(精確至0.01 g)于30 mL研磨管中,準(zhǔn)確加入0.1 μg/mL甲基睪酮-D3內(nèi)標(biāo)工作溶液50 μL,渦旋混合60 s,加入5 g 規(guī)格為2.8 mm的陶瓷研磨珠和10 mL 1%甲酸-乙腈溶液(甲酸/乙腈,1∶99,V/V),用Bead Ruptor Elite多功能生物樣品均質(zhì)器以3 m/s的均質(zhì)速度,均質(zhì)震蕩30 s,以6 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min,轉(zhuǎn)移全部的上清提取液于另一潔凈的帶蓋聚丙烯離心管中,待凈化。
1.3.3 凈化
將QuEChERS凈化劑以下簡稱Q1(100 mg PSA、50 mg C18、50 mg石墨化炭,600 mg MgSO4)加入上述提取液中,旋緊螺旋蓋,用多管旋渦混合儀以2 000 r/min,渦旋混合1 min,以9 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min。吸取4 mL上清有機(jī)相溶液,于45 ℃水浴氮吹至近干。準(zhǔn)確加入1.0 mL 10%乙腈-水溶液(乙腈/水,10∶90,V/V)溶解殘?jiān)?渦旋振蕩溶解殘留物,0.22 μm濾膜過濾至1 mL玻璃進(jìn)樣瓶,待測。
1.4 儀器條件
1.4.1 液相色譜條件
色譜柱:BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:5.0 μL;流速:0.30 mL/min;流動相A為0.1%甲酸水溶液;流動相B為甲醇。流動相梯度洗脫程序見表1。
表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient Elution Conditions
1.4.2 質(zhì)譜條件
電離方式:電噴霧離子源(ESI),正離子模式;掃描檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(Multiple reaction monitoring, MRM);電噴霧電壓:5 500 V;離子源溫度:550 ℃;氣簾氣壓力:35.0 psi;碰撞氣壓力:9 psi;霧化器壓力:55.0 psi;輔助加熱器壓力:55.0 psi。定性離子對、定量離子對、去簇電壓及碰撞能量參數(shù)見表2。
表2 MRM掃描模式的參數(shù)Tab.2 Parameters of MRM
1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線
分別取10、20、50、100、200、500 μL濃度0.1 μg/mL的甲基睪酮外標(biāo)工作溶液于玻璃離心管中,分別加入0.1 μg/mL甲基睪酮-D3內(nèi)標(biāo)工作溶液50 μL,氮?dú)獯蹈?加入步驟1.3處理所得的基質(zhì)空白溶液1mL,混合1min,配制成濃度為1～50 ng/mL系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液,經(jīng)超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定,以甲基睪酮特征離子色譜峰的峰面積與內(nèi)標(biāo)物甲基睪酮-D3特征色譜峰的峰面積比值為縱坐標(biāo)、相應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
1.6 方法驗(yàn)證
按照SN/T 5326.2—2020《進(jìn)出口食品化妝品專業(yè)分析方法驗(yàn)證指南 第2部分 化學(xué)方法》中5.2方法性能參數(shù)的驗(yàn)證章節(jié)中的方法,評估方法靈敏度[20]。驗(yàn)證程序采用概率統(tǒng)計(jì)法,當(dāng)被檢測目標(biāo)物質(zhì)甲基睪酮在羅非魚樣品基質(zhì)中被可靠檢出的概率達(dá)到95%以上時的濃度水平做為檢測方法對于該樣品基質(zhì)的檢出限。方法定量限滿足大于3倍檢出限或其信噪比大于等于10。
取已知陰性羅非魚肉樣品2.50 g,分別添加25、50、250 μL濃度為0.1 μg/mL甲基睪酮外標(biāo)工作液和50 μL濃度為0.1 μg/mL甲基睪酮-D3內(nèi)標(biāo)工作溶液,制得含量分別為1.00、2.00和10.00 μg/kg的3個濃度水平的加標(biāo)樣品,每個濃度進(jìn)行6個平行樣品的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),按1.3的方法進(jìn)行處理并定量分析,根據(jù)檢測結(jié)果計(jì)算加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。
將魚粉中甲基睪酮的質(zhì)控樣品的接受參考值作為約定真值,按照本實(shí)驗(yàn)方法處理過程進(jìn)行定量測定,分別檢測10個平行樣品,對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,檢測結(jié)果用于方法的驗(yàn)證。
2 結(jié)果與分析
2.1 方法優(yōu)化
2.1.1 檢測方法的選擇
液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是類固醇激素檢測的常用分析方法[21-22]。但氣質(zhì)法的前處理過程常需要進(jìn)行衍生化,過程復(fù)雜且耗時。超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的選擇性、特異性和靈敏度比液相色譜法更高,并減少了溶劑消耗、縮短了分析時間,被越來越多地使用于檢測復(fù)雜基質(zhì)中的痕量物質(zhì)[22]。國家標(biāo)準(zhǔn)方法中激素殘留的檢測也多采用液質(zhì)法。
2.1.2 提取劑的選擇
液質(zhì)法檢測激素殘留常用的試劑有甲醇、乙腈、乙酸乙酯等。GB 31656.14—2022[14]采用乙酸乙酯提取;GB/T 21981—2008[15]采用酶解后甲醇提取;農(nóng)業(yè)部1031號公告—1—2008[16]采用叔丁基甲醚提取;SN/T 3235—2012[17]和SN/T 2443—2010[18]采用乙腈提取。本研究在空白羅非魚試樣中添加內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)工作液制成10.0 μg/kg的甲基睪酮添加樣品,用于方法的優(yōu)化。對甲醇、乙酸乙酯、乙腈、1%甲酸-乙腈溶液和5%甲酸-乙腈溶液5種提取溶劑進(jìn)行對比試驗(yàn),結(jié)果表明這5種溶劑提取甲基睪酮的平均回收率相近,提取效率均較高(圖1),試驗(yàn)結(jié)果與聶建榮等[23]甲基睪酮?dú)埩籼崛〉难芯拷Y(jié)果一致。
圖1 不同提取劑對目標(biāo)物的回收率影響Fig.1 The effect of different extractants on the recovery rate of the target substance
不同溶劑對不同激素的提取效率不同,甲醇對多種雌激素的提取回收好,乙酸乙酯對部分雄激素和孕激素的提取效率高[24-26],乙腈對部分雄激素、孕激素和雌激素的提取回收率都較高[24]。在多類激素同時提取時,也有使用這3種提取劑的組合來達(dá)到更高的綜合提取效率[25]。試驗(yàn)結(jié)果表明,在使用乙酸乙酯作為提取劑時,甲基睪酮的平均回收率略低于其他提取劑,提取過程中較多的油脂被一同提取出來,氮吹后管內(nèi)有大量黃色的油脂殘存。甲醇提取的平均回收率偏高,為107.5%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差2.5%。上機(jī)檢測發(fā)現(xiàn)甲醇和乙酸乙酯在提取過程中出現(xiàn)了較多的基質(zhì)干擾成分,相鄰的雜峰較多,基質(zhì)干擾峰面積大(圖2)。使用乙腈或不同濃度酸化乙腈提取時的基質(zhì)干擾小,回收率相近,1%酸化乙腈的內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)的離子相應(yīng)值高于乙腈和5%酸化乙腈提取的甲基睪酮內(nèi)外標(biāo)離子響應(yīng)值,所以選擇1%酸化乙腈作為本方法的提取試劑。
圖2 不同提取劑的甲基睪酮定量離子色譜圖Fig.2 Quantitative ion chromatograms of methyltestosterone using different extractants
2.1.3 凈化方式的選擇
在激素殘留的檢測中,常通過比較不同的提取凈化方式來優(yōu)化前處理方法,減小基質(zhì)干擾的影響[27-28]。激素殘留常用有機(jī)溶劑渦旋或超聲的方式提取,液液萃取、分散固相萃取或固相萃取的方法來凈化除雜[22]。固相萃取法需要的有機(jī)溶劑量也較少,可以在過柱的過程中清理去除大部分雜質(zhì),從而減少基質(zhì)干擾。但使用固相萃取柱凈化的步驟,通常需要進(jìn)行活化、淋洗、洗脫等操作[29-30]。GB 31656.14—2022和GB/T 21981—2008都是經(jīng)過大量溶劑提取后,進(jìn)一步經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮再溶解,而后過柱凈化,整個前處理過程耗時長,且旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀能同時處理樣品的數(shù)量少,不能滿足多批量樣品的檢測需求。
利用溶劑渦旋提取和QuEChERS法的研究可以高效率的完成激素殘留處理。QuEChERS法采用在鹽溶液的存在下以水溶性溶劑萃取,促進(jìn)液相分離,再以分散性吸附劑與提取物混合來促進(jìn)清除基質(zhì)干擾。本研究對比了Q1(100 mg PSA、50 mg C18、50 mg石墨化炭,600 mg MgSO4),Q2(100 mg PSA、600 mg MgSO4),Q3(150 mg PSA、900 mg MgSO4),Q4(100 mg C18),Q5(100 mg 石墨化炭)這5種吸附劑組合對甲基睪酮的回收提取效果(圖3)。多組分的分散性吸附劑Q1與不同含量PSA的Q2和Q3凈化回收率相近,高于C18和石墨化炭的凈化回收率。Q2與Q3的色譜圖上的基質(zhì)干擾峰相同,并沒有隨著PSA含量的增加而減小基質(zhì)干擾。C18和石墨化炭色譜圖的離子響應(yīng)值都低于其他吸附劑,約為6.0×104(圖4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,單一的分散性吸附劑的凈化效果不充分,多種分散吸附劑組合可以達(dá)到更好的凈化效果。所以選擇Q1組分的QuEChERS吸附劑用于凈化除雜。
圖3 不同吸附劑對目標(biāo)物的回收率影響Fig.3 The effect of different adsorbents on the recovery rate of the target substance
圖4 不同吸附劑的甲基睪酮定量離子色譜圖Fig.4 Quantitative ion chromatograms of methyltestosterone using different adsorbents
2.1.4 其他因素
魚肉中激素的測定多受基質(zhì)干擾影響[31-32]。SN/T 3235—2012和SN/T 2443—2010標(biāo)準(zhǔn)方法中的甲基睪酮定量方法采用外標(biāo)法。為了不受實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定性變化影響,本方法使用內(nèi)標(biāo)法定量。同時,方法也對氮吹溫度35、40和45 ℃進(jìn)行對比,測得加標(biāo)回收率相近,精密度相似,結(jié)果表明甲基睪酮在這3種溫度下較穩(wěn)定,皆可用于氮吹,45 ℃時氮吹所用的時間最少。
2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線
按照1.5的方法繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)(圖5),表明在1～50 ng/mL的線性范圍內(nèi),待測物甲基睪酮的線性關(guān)系良好。
圖5 甲基睪酮標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.5 Standard working curve of methyltestosterone
2.3 方法檢出限與定量限
按照1.6進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。采用標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行檢測,得到0.30 μg/kg作為參考濃度,以1倍該濃度為參考檢出限(LODR)的6個標(biāo)準(zhǔn)添加樣品經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢測結(jié)果并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差SD為0.05,以LODR-3SD、LODR、LODR+3SD三個濃度水平分別檢測20個標(biāo)準(zhǔn)添加樣品,剛好有19個樣品能被有效檢出的濃度作為方法的檢出限。經(jīng)驗(yàn)證,確定甲基睪酮?dú)埩魴z測方法的檢出限為0.30 μg/kg,定量限大于3倍檢出限為1.0 μg/kg。方法檢出限驗(yàn)證數(shù)據(jù)見表3。
表3 方法檢出限驗(yàn)證數(shù)據(jù)Tab.3 Validation data for the detection limit in method n=20
2.4 回收率和精密度
向空白羅非魚樣品中添加3個濃度水平甲基睪酮的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(n=6),按照前面的處理的方法和條件進(jìn)行測定,計(jì)算每個濃度水平的平均回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。本方法的平均回收率為98.3%～103.0%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2%～8.8%。
表4 加標(biāo)回收和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Standard recovery rate and precision test results n=6
2.5 陽性樣品驗(yàn)證
將魚粉中甲基睪酮質(zhì)控樣品用于本方法的驗(yàn)證。按照魚粉質(zhì)控樣品分析證書中的說明,在空氣濕度≤40%,室溫約25 ℃的環(huán)境下準(zhǔn)確稱量質(zhì)控干粉0.5 g(精確至0.000 1 g),加入蒸餾水2.0 mL使其恢復(fù)為2.5 g的魚肉濕樣進(jìn)行檢測。2種陽性質(zhì)控分析魚粉均稱取10個平行樣品用于測定,檢測結(jié)果見表5。試驗(yàn)表明,本方法的檢測結(jié)果符合魚粉中甲基睪酮質(zhì)控樣品分析證書中給出的標(biāo)準(zhǔn)值擴(kuò)展不確定度范圍,檢測結(jié)果可靠,本方法可用于魚肉中甲基睪酮?dú)埩袅康臏y定。
表5 陽性樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab. 5 Positive sample test results n=10
3 結(jié)論
本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定羅非魚中甲基睪酮?dú)埩袅康姆椒?。對樣品制備、質(zhì)譜條件、提取溶劑、凈化方式等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,采用基質(zhì)加標(biāo)的方法建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,內(nèi)標(biāo)法定量數(shù)據(jù)分析。經(jīng)測定,甲基睪酮濃度在1～50 ng/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)為0.999 5。方法檢出限為0.30 μg/kg,定量限為1.0 μg/kg。方法的前處理步驟操作簡單,大大縮短了前處理所需時長,提高了檢測效率,且方法檢出限低、準(zhǔn)確度和精密度高,能滿足羅非魚中甲基睪酮?dú)埩袅繖z測要求,為相關(guān)部門開展針對羅非魚中甲基睪酮?dú)埩袅康谋O(jiān)測提供參考方法。
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