董錚,韓楠楠,徐新月

(山東省青島市即墨區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,山東 青島 266200)

大黃魚(PseudosciaenaCrocea)為廣溫廣鹽性集群洄游魚類,是中國在國際市場上有較高知名度和競爭力的6大類名優(yōu)水產(chǎn)品之一。大黃魚肉質(zhì)鮮嫩,營養(yǎng)豐富,具有健脾開胃、安神止痢等保健功效,深受消費者喜愛[1]。但是大黃魚在內(nèi)源性酶降解、脂肪氧化以及微生物作用下極易發(fā)生腐敗變質(zhì),目前大多以冷凍方式貯藏,但冷凍-解凍會對魚體的組織結(jié)構(gòu)及營養(yǎng)品質(zhì)造成一定損傷[2]。因此,探究一種能在冷藏條件下對大黃魚等水產(chǎn)品進行有效貯藏的食品保鮮技術成為眾多學者的研究熱點。

緩釋型活性包裝是通過改變食品包裝的環(huán)境條件,以包裝材料為載體,通過某種緩釋手段不斷向包裝環(huán)境釋放和擴散抗菌劑、抗氧化劑或酶類等活性物質(zhì),從而能夠在特定時間內(nèi)維持最佳的保鮮濃度,達到保持食品品質(zhì)和延長貨架期的一類包裝技術[3,4]。目前,緩釋型活性包裝技術在國外已經(jīng)普遍用于生鮮食品加工領域[5,6],而國內(nèi)對緩釋活性包裝技術的研究還不多,已有的研究大多集中在農(nóng)產(chǎn)品領域[7,8],對水產(chǎn)品方面應用的報道還比較少。因此,緩釋活性包裝技術作為一種新型保鮮技術具有廣闊的研究前景,對其應用于水產(chǎn)品保鮮的研究也是十分有必要的。

本研究所采用的緩釋劑凹凸棒土,簡稱凹土(Attapulgite, AT),又名坡縷石,在中國南方多地如安徽、江蘇、貴州等儲量較為豐富。凹土是一種層鏈狀過渡結(jié)構(gòu)的含水鋁鎂硅酸鹽礦物質(zhì),無味、無刺激、無毒性、化學性質(zhì)穩(wěn)定,是一種理想的食品加工助劑和食品添加劑,其物化性能與蒙脫石相類似[9]。目前,凹土已在化工、石油、食品、造紙、印染及環(huán)保領域中有所應用[9-11]。

大蒜精油具有廣譜抗菌、抗氧化等生理功能,其是由大蒜素及多種烯丙基和甲基組成的硫醚類化合物,其中二烯丙基二硫醚(DADS,相對分子量146)和二烯丙基三硫醚(DATS,相對分子量178)是天然大蒜精油中較為穩(wěn)定的存在形式[12-14]。因此,在一般情況下,其他精油在使用過程中遇到高溫揮發(fā)性較大,主要活性成分大部分失去作用,大蒜素在高溫下(吹膜需加熱)雖然不穩(wěn)定,但分解后可以轉(zhuǎn)化為更加穩(wěn)定的烯丙基硫醚類化合物,進一步發(fā)揮作用,從而使得大蒜精油的使用更為廣泛,比其他精油更具優(yōu)勢[13]。

目前,國內(nèi)外已有關于大蒜精油保鮮食品的相關研究。劉書成等[15]研究表明大蒜精油適合運用于脂肪酸含量高的食品;王磊[16]將大蒜精油應用于生豬肉的保鮮,其對于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率高達85%;Sung 等[17]利用大蒜精油制備了抗菌薄膜包裝應用于熟牛肉的保鮮,大大抑制了李斯特菌的增長率,取得了較為理想的保鮮效果。因此,大蒜精油在食品保鮮方面具有廣闊的應用前景。

因此,本研究以大黃魚魚片為保鮮對象,將微生物指標、化學指標(K值、TVB-N、TBA)作為鮮度指標,以此探究大蒜精油緩釋型活性包裝薄膜對(4±1)℃冷藏條件下大黃魚魚片的保鮮效果,旨在延長冷藏條件下大黃魚的貨架期,并為其他水產(chǎn)品的冷藏保鮮提供方法參考和理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要材料與試劑

大黃魚:冰鮮大黃魚購買于青島市某水產(chǎn)品市場(平均大小約為400 g/條);聚乙烯(LDPE/Bycolene?Q/3201-BYC-01):巴斯夫中國(南京)有限公司;聚丙烯(PP/SINOPEC?PPB-M02-G K8003):揚子石化(南京)有限公司;乙烯-醋酸乙烯共聚物(EVA):北京索萊寶有限公司;凹凸棒土(BT-ATTAG-50):江蘇盱眙凹凸棒土有限公司;脫臭大蒜精油(AEO):上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

共擠復合吹膜試驗機:JFG-30型,廣州金中機械有限公司;紫外分光光度計:UV1101型,杭州艾普儀器設備有限公司;超凈工作臺:SW-CJ-2FD型,蘇州安泰空氣技術有限公司;真空包裝機:DZT-260,深圳晟楓包裝機械有限公司;高壓滅菌器:MSL-3781L-PC型,松下集團;電熱恒溫培養(yǎng)箱:DNP-9052BS-III型,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;高效液相色譜儀:Agilent 1260型,安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 凹土(AT)改性及凹土/大蒜精油混合物(AT/AEO)的制備

AT改性:參照田振華等[18]的方法利用鹽酸和無水乙醇對AT進行酸化,并利用水解后的硅烷偶聯(lián)劑KH550(濃度為1%,w/w)對AT進行偶聯(lián),通過酸化和偶聯(lián)完成對AT的改性。

AT/AEO混合物的制備:以溶解度為參考指標,經(jīng)過前期的試驗探究,得到了改性凹土和大蒜精油的最佳質(zhì)量配比為1∶25,通過攪拌制備得到AT/AEO混合物。

1.2.2 活性薄膜的制備

本研究制備了4種不同配方的雙層活性薄膜,以低密度聚乙烯(LDPE)、聚丙烯(PP)為基材,并添加成膜輔助劑乙烯-醋酸乙烯共聚物(EVA)以及不同質(zhì)量分數(shù)的AEO或AT/AEO混合物。4組薄膜的配方分別如表1所示,其中表1中90% (w/w)、10% (w/w)和1% (w/w)的配比是根據(jù)前期預實驗所確定的最佳配比。

表1 不同薄膜的配方Tab.1 Formulations of different films

吹膜工藝:采用雙層共擠復合吹膜方法進行吹膜。吹膜機的溫度設定為:膜體區(qū)250 ℃;分流器區(qū)245 ℃;螺桿區(qū)(LDPE): 175 ℃;螺桿區(qū)(PP):200 ℃。同時,為防止精油的揮發(fā)擴散,將制備好的薄膜用鋁箔進行包裹保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 大黃魚包裝前處理

將大黃魚置于超凈工作臺中,去頭、尾、磷和內(nèi)臟,預冷無菌水清洗干凈后去皮。參考Hernández等[19]的方法,對魚肉進行分割,不同部位用于不同指標的測定。將4種不同的保鮮薄膜裁剪成大小為30.0 cm × 20.0 cm的規(guī)格并用真空包裝機進行封口操作。每種保鮮薄膜做成4個包裝袋,每個包裝袋中放入待測的魚肉,然后抽真空封口置于(4±1)℃條件下貯藏(并預留一部分魚肉用于第0 d鮮魚的各種指標的測定)。取樣時間分別為:0、2、4、6、8、10 d,其中K值的測定連續(xù)取樣,周期為10 d。

1.2.4 微生物評價

大黃魚魚肉菌落總數(shù)(TVC)的測定參照GB 4789.2—2016[20]采用平板計數(shù)培養(yǎng)基(PCA)傾注法計數(shù)測定。另外,選取了大黃魚的3種優(yōu)勢腐敗菌進行測定,分別是腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)、假單胞菌(Pseudomonas)和腸桿菌(Enterobacteriaceae),在貯藏過程中采用選擇性培養(yǎng)基對3種優(yōu)勢腐敗菌進行平板計數(shù)[21]。

稱取魚肉10 g(精確到0.01 g)置于無菌均質(zhì)袋中,加入9倍的生理鹽水(w/v,魚肉質(zhì)量與生理鹽水體積比),使用無菌均質(zhì)機拍打成10倍稀釋液。用滅菌移液器吸取稀釋液1 mL,注入含有9 mL滅菌生理鹽水的EP管,振搖混合均勻,制成1∶100的稀釋液。按上面的操作順序依次形成10倍遞增稀釋液。然后選取2～3個適宜濃度的稀釋液并分別取1 mL注入滅菌平板,傾注不同的選擇性培養(yǎng)基,搖勻,靜置冷卻。將平板倒置,放入生化培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件如表2所示。

表2 不同微生物的培養(yǎng)條件Tab.2 Culture conditions of different microorganism

1.2.5 K值測定

參照張佳琪等[22]的方法對魚肉進行前處理。HPLC檢測條件:色譜柱:Zorbax Eclipse Plus C18(250 mm × 4.6 mm,5 μm);流動相:A:0.05 mol/L pH 6.68的磷酸鹽緩沖液(KH2PO4與K2HPO4的摩爾比為1∶1),B:100%甲醇溶液;設置比例為:A∶B=95∶5;檢測波長:254 nm;流速:1.0 mL/min;進樣量:10 μL;柱溫:30 ℃。

K值的計算按照下列公式(1)進行:

式(1)

式中,ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx分別代表三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、腺苷酸、肌苷酸、次黃嘌呤核苷、次黃嘌呤,濃度采用(μmol/g,濕基)

1.2.6 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)含量測定

參照GB/T 5009.228—2016[23],按微量擴散法測定TVB-N,每組樣品做3個平行,取平均值作為每組樣品的TVB-N含量。

1.2.7 硫代巴比妥酸(TBA)值的測定

參考Siu等[24]的方法并稍作修改。稱取10.0 g魚肉于均質(zhì)袋中,并加入25 mL超純水,勻漿,再加入25 mL三氯乙酸(5%),充分攪拌均勻后靜置30 min,然后使用中性濾紙過濾。取5 mL上清液于具塞試管中,加入5 mL TBA溶液(0.02 mo1/L)。將上述混合液置于(80±1) ℃的恒溫水浴加熱40 min,冷卻至室溫后,在532 nm測定吸光值A。每組樣品做3個平行,結(jié)果求取平均值。TBA值用丙二醛(MDA)的質(zhì)量分數(shù)表示,單位為mg MDA/kg樣品。

TBA值計算公式(2)如下:

TBA(mg MDA/kg)=A532×7.8

式(2)

1.3 數(shù)據(jù)分析

本研究中所有數(shù)據(jù)均設置3組平行,數(shù)據(jù)用“平均值±標準差”表示。采用OriginPro 2016軟件作圖,并利用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析,以P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物評價

大黃魚魚片在不同保鮮膜真空包裝下的微生物變化如圖1所示。由圖1A可知,大黃魚魚片的初始菌落總數(shù)(TVC)為4.76 lg CFU/g,隨著貯藏時間的延長,4組樣品的TVC值均呈顯著增加的趨勢(P<0.05),且組間存在顯著性差異(P<0.05)。ICMSF[25]規(guī)定了水產(chǎn)品微生物的腐敗臨界值為7 lg CFU/g。依據(jù)微生物的判定標準,大黃魚魚片在4種薄膜包裝下的貨架期分別為4、4、7和9 d,由此可見,與前2組未添加活性物質(zhì)的對照組相比,添加精油的2組薄膜(PP/LDPE+AEO和PP/LDPE+AT+AEO)可分別延長大黃魚的貨架期3 d和5 d,且與只添加精油的PP/LDPE+AEO薄膜相比,添加凹土/精油混合體系的PP/LDPE+AT+AEO薄膜可進一步延長大黃魚魚片貨架期2 d。這說明大蒜精油對微生物的生長起到了明顯的抑制作用,大蒜精油中含有的有機硫化合物分子對蛋白質(zhì)分子中的巰基具有氧化作用,使微生物生長代謝所必須的酶滅活,從而可以抑制微生物的生長和繁殖[26]。在此基礎上,凹土的緩釋在一定程度上可達到持續(xù)抑菌的效果,進一步延長大黃魚魚片的貨架期。

圖1 不同薄膜真空包裝的大黃魚魚片在(4±1)℃冷藏條件下(A)菌落總數(shù)、(B)腐敗希瓦氏菌、(C)假單胞菌和(D)腸桿菌的變化Fig.1 The variation of (A) Total viable count, (B) Shewanella putrefaciens, (C) Pseudomonas, and (D) Enterobacteriaceae in large yellow croaker fillets with different active packaging of vacuum condition at (4±1)℃

在大黃魚魚片貯藏過程中,腐敗希瓦氏菌、假單胞菌和腸桿菌的生長變化如圖1B-D所示。初始時大黃魚魚片的腐敗希瓦氏菌、假單胞菌和腸桿菌分別是4.38、3.18、3.00 lg CFU/g,這說明大黃魚魚片初始優(yōu)勢腐敗菌是腐敗希瓦氏菌。隨著貯藏時間的延長,腐敗希瓦氏菌、假單胞菌和腸桿菌的數(shù)量在不同貯藏時間的變化趨勢基本與菌落總數(shù)變化相一致,均表現(xiàn)逐漸上升趨勢(P<0.05),且添加活性物質(zhì)的PP/LDPE+AEO薄膜和PP/LDPE+AT+AEO薄膜顯著低于前兩組對照組(LDPE/LDPE和PP/LDPE)(P<0.05)。這可能是由于大蒜精油中的有機硫分子對革蘭氏陰性菌的細胞膜包埋蛋白更為敏感,導致細胞膜通透性的改變,從而更有效的殺死革蘭氏陰性細菌[27]。同時,從圖中也觀察到,從貯藏時間的第4 d開始,添加凹土/精油混合體系的PP/LDPE+AT+AEO薄膜組的優(yōu)勢腐敗菌的增長速率要顯著低于只添加精油的PP/LDPE+AEO薄膜組(P<0.05)。由此表明凹土可以更有效地控制精油的釋放速率,使精油緩慢釋放,一方面,能夠?qū)崿F(xiàn)濃度的積累,與微生物的生長速率相一致,從而能夠有效抑制微生物的生長;另一方面,精油能夠逐漸從魚體表面滲入魚肉當中,起到持續(xù)抑菌的作用。Efrati等[28]的研究也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果,在線性低密度聚乙烯(LLDPE)和蒙脫石(MMT)的基礎上結(jié)合百里香酚環(huán)氧乙烷制備抗菌活性膜,與對照組相比,抗菌活性延長,進一步證實了MMT的緩釋功能。

2.2 K值的變化

Saito等[29]研究指出K值低于20%為一級鮮度,低于50%為二級鮮度,高于70%為腐敗不可食用。大黃魚魚片在不同保鮮膜真空包裝下K值的變化如圖2所示。由圖可知,大黃魚魚片的初始K值為(7.00±0.35)%,處于一級鮮度。在貯藏期間,4組均呈現(xiàn)上升趨勢。由于K值主要表征魚片貯藏前期的新鮮度,因此,以一級鮮度(≤20%)作為評判標準,未添加活性物質(zhì)的對照組LDPE/LDPE和PP/LDPE薄膜組的貯藏時間都為4.5 d,而PP/LDPE+AEO和PP/LDPE+AT+AEO薄膜組可分別延長至第6 d和第6.5 d。Huang等[30]證實了桂皮油能有效抑制ATP降解,從而使草魚 (Ctenopharyngodonidellus)魚片保持較高的品質(zhì)。因此,凹土控制的大蒜精油的持續(xù)釋放可能延緩了ATP的降解,使大黃魚魚片保持良好的新鮮度狀態(tài)。

圖2 不同薄膜真空包裝的大黃魚魚片在(4±1)℃冷藏條件下K值的變化Fig.2 The variation in K value of large yellow croaker fillets with different active packaging of vacuum condition at (4±1)℃

2.3 TVB-N含量的變化

根據(jù)GB/T 18108—2008[31]的規(guī)定,TVB-N值低于15 mg/100 g為一級鮮度,低于20 mg/100 g為二級鮮度,低于30 mg/100 g為三級鮮度,同時30 mg/100 g也被認為是水產(chǎn)品品質(zhì)可被消費者接受的TVB-N值上限。

大黃魚魚片在不同保鮮膜真空包裝下的TVB-N值的變化如圖3所示。由圖可知,新鮮大黃魚魚片的TVB-N的初始值為8.93 mg/100 g,一般而言,剛捕獲的大黃魚的初始TVB-N值的范圍在5～20 mg/100 g之間,該測定值與李婷婷[32]測定的新鮮大黃魚的初始TVB-N值(9.20 mg/100g)較為接近。貯藏初期,魚片的TVB-N值較低,隨著貯藏時間的延長,4個組別的TVB-N值均呈現(xiàn)上升趨勢,尤其是第6天之后呈現(xiàn)顯著上升趨勢(P<0.05),這與微生物的數(shù)量及代謝活動規(guī)律密切相關。以30 mg/100 g為標準,當貯藏期為第6 d時,未添加活性物質(zhì)的PP/LDPE薄膜和LDPE/LDPE薄膜組已基本達到可食用上限,而PP/LDPE+AEO薄膜和PP/LDPE+AT+AEO薄膜組可分別延長至第7、第9 d。這說明大蒜精油的添加對微生物的生長代謝起到了一定程度的抑制作用,由于精油組未添加緩釋劑,因此擴散速度較快,在較短的時間內(nèi)就達到了平衡狀態(tài),不再隨時間的延長而向外釋放,而添加了緩釋劑的薄膜組在控制精油釋放速率方面發(fā)揮了一定的作用,呈現(xiàn)一種“緩慢但持久”的釋放狀態(tài),隨著時間的推移,精油從薄膜中緩慢釋放,對細菌的生長產(chǎn)生持續(xù)抑制,進而顯著降低揮發(fā)性鹽基氮的產(chǎn)生水平[33]。

圖3 不同薄膜真空包裝的大黃魚魚片在(4±1) ℃冷藏條件下?lián)]發(fā)性鹽基氮含量的變化Fig.3 The variation in volatile basic nitrogen (TVB-N) content of large yellow croaker fillets with different active packaging of vacuum condition at (4±1)℃

2.4 TBA值的變化

大黃魚魚片在不同保鮮薄膜真空包裝下TBA值的變化如圖4所示。由圖觀察可知,大黃魚魚片的初始TBA值為0.46 mg MDA/kg,貯藏期間所有樣品的TBA值都顯著增加(P<0.05)。當?shù)竭_貯藏末期時,前2組未添加活性物質(zhì)的對照組(LDPE/LDPE和PP/LDPE)的TBA值分別達到了6.48和5.99 mg MDA/kg,同時,只添加了大蒜精油的對照組(PP/LDPE+AEO)略有降低,而添加凹土/精油混合體系的實驗組(PP/LDPE+AT+AEO)則顯著降低(P<0.05),二者的TBA值分別為5.56和5.08 mg MDA/kg。從貯藏前期(0～4 d)來看,只添加了大蒜精油的對照組(PP/LDPE+AEO)的TBA值比添加凹土/精油混合體系的實驗組(PP/LDPE+AT+AEO)要略低,而第4 d之后,實驗組(PP/LDPE+AT+AEO)逐漸發(fā)揮優(yōu)勢,產(chǎn)生這種變化的主要原因可能跟凹土的緩釋有關,精油的釋放速率受到凹土的控制,通過緩釋作用實現(xiàn)精油濃度的逐漸積累,且達到持久釋放的效果,從而可以對魚肉的脂質(zhì)氧化起到一定的抑制作用[34]。楊輝[35]的研究證實了葡萄籽精油與EVOH薄膜結(jié)合后可有效抑制脂肪的氧化,降低草魚的TBA值。

3 結(jié)論

本試驗是以微生物指標(菌落總數(shù)、腐敗希瓦氏菌、假單胞菌、腸桿菌)和化學指標(K值、TVB-N、和TBA)作為鮮度指標,以此評估含有凹土/精油混合體系的緩釋型活性包裝(PP/LDPE+AT+AEO)對大黃魚魚片在冷藏狀態(tài)下的保鮮效果。各鮮度指標表明,與對照組相比,PP/LDPE+AT+AEO薄膜所包裝的大黃魚魚片呈現(xiàn)出了最理想的鮮度狀態(tài)。以菌落總數(shù)小于7 lg CFU/g作為消費者可食用標準并結(jié)合TVB-N(30 mg/100 g)等指標,與市場對照組(LDPE/LDPE)相比,PP/LDPE+AT+AEO薄膜能夠有效延長大黃魚魚片貨架期約3～5 d,同時,與只添加精油的對照組(PP/LDPE+AEO)相比,同樣能夠延長貨架期約2 d,達到了預期的試驗目的。由此表明,本試驗研制的大蒜精油緩釋型活性薄膜能夠有效延長大黃魚魚片的貨架期,在水產(chǎn)品保鮮領域具有廣闊的應用前景。同時也為今后研究活性包裝中抗菌劑和抗氧化劑的釋放方式和優(yōu)化薄膜的控釋手段奠定了基礎。