樊霏霏 楊明夏

肺是一個復(fù)雜的器官,由高度分支的氣道和肺泡兩部分組成,參與重要的生理過程,其細(xì)胞及組織的復(fù)雜性保證了肺的免疫防御和氣體交換功能[1]。肺泡主要由肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞(alveolar type Ⅰ cells,ATⅠ)和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(alveolar type Ⅱ cells,ATⅡ)構(gòu)成。ATⅠ參與構(gòu)成氣-血屏障,ATⅡ的主要功能是分泌表面活性物質(zhì),降低肺泡表面張力,以維持肺泡的正常形態(tài)[2]。肺的發(fā)育過程十分復(fù)雜,任何階段的發(fā)育失敗或缺陷都可能導(dǎo)致疾病甚至死亡[3]。在肺發(fā)育成熟后,內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定時,細(xì)胞的更新率很低,呼吸道祖細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài),在面對各種損傷性刺激時祖細(xì)胞可增殖分化以應(yīng)對環(huán)境的變化[4],這種能力引起了研究者的關(guān)注,為肺部疾病的研究及治療提供了新思路。

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種以持續(xù)存在的氣流受限為特征的慢性疾病,可進(jìn)一步發(fā)展為肺心病和呼吸衰竭,氣流受限呈進(jìn)行性發(fā)展[5],與氣道對有毒顆?；驓怏w的炎性反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)[6]。慢阻肺的致殘率和病死率逐年上升,根據(jù)2022年的慢性阻塞性肺疾病全球倡議指南,慢阻肺是目前全球三大死亡原因之一,是未來慢性病的主要經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[7]。慢阻肺具有進(jìn)行性、不可逆的特征,患者長期咳嗽、喘息,可逐漸演變?yōu)榉涡牟?最后累及全身各個系統(tǒng)[8]。臨床上的治療方法主要包括非藥物治療、藥物治療、氧療等來改善患者的生活質(zhì)量[9]。然而,這些治療方式并不能解決根本問題,肺泡類器官的出現(xiàn)為慢阻肺的精準(zhǔn)治療提供了新思路。本文對肺泡類器官近年來的發(fā)展及其在慢阻肺相關(guān)研究中的應(yīng)用進(jìn)行總結(jié),為今后的研究提供理論依據(jù)。

一、類器官

類器官來源于干細(xì)胞,是指細(xì)胞在體外通過3D培養(yǎng)生長形成的高度模擬體內(nèi)生理病理狀態(tài)的組織培養(yǎng)物,可分化為特定的器官結(jié)構(gòu)[10]。以胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)和組織特異性干細(xì)胞在特定三維空間中構(gòu)建出的類器官最常被用于體外的研究[11]。目前已經(jīng)有包括肝臟、腎臟、乳腺、前列腺和腫瘤等多種人體組織和器官成功構(gòu)建了類器官[12-14],這些類器官具有與原始器官相似的組織結(jié)構(gòu)和生理功能,近年來逐漸用于疾病建模[15]、再生醫(yī)學(xué)[16]和發(fā)育過程[17]的研究,也可以作為藥物篩選[18]的工具,并為不可逆病變或損傷的替代治療[19]提供了可能。

二、肺泡類器官的構(gòu)建及優(yōu)越性

人類肺臟由氣管、支氣管和細(xì)支氣管構(gòu)成氣道,進(jìn)行氣體交換的肺泡由Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞以及血管系統(tǒng)構(gòu)成。肺泡類器官培養(yǎng)的基礎(chǔ)源自于Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞具有多能干細(xì)胞特性[20]。在慢阻肺的發(fā)展過程中,肺泡結(jié)構(gòu)會發(fā)生不同程度的病變,ATⅡ能增殖、分化修復(fù)受損的ATⅠ,維持肺泡上皮細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和功能[21]。肺泡類器官是指肺干細(xì)胞在3D培養(yǎng)下形成的類似于肺泡結(jié)構(gòu)的組織培養(yǎng)物,表達(dá)肺泡上皮細(xì)胞標(biāo)志物并包含部分肺間充質(zhì)細(xì)胞[22]。目前肺泡類器官已應(yīng)用于多種肺泡病變的疾病并取得研究進(jìn)展[23-25]。肺泡類器官培養(yǎng)體系除了包含具有干細(xì)胞特性的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞,還需要添加其他共培養(yǎng)的細(xì)胞及細(xì)胞因子。目前肺泡類器官的培養(yǎng)常在DMEM/F12等基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加有利于干細(xì)胞增殖分化的細(xì)胞因子如成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)等[26],研究者需要根據(jù)培養(yǎng)目的確定細(xì)胞因子的種類和用量。此外,類器官3D結(jié)構(gòu)的形成嚴(yán)重依賴于細(xì)胞外基質(zhì),目前最為廣泛使用的是基質(zhì)膠,這種基質(zhì)通?；瘜W(xué)成分定義不清,并且可調(diào)性和可重復(fù)性有限[27],近期發(fā)現(xiàn)的一種基質(zhì)透明質(zhì)酸水凝膠,其物理和生化性質(zhì)可精確調(diào)整,并且可以有效改善肺泡類器官的不均一性[28],為肺泡類器官發(fā)育成熟提供了更多的可能。近期有文獻(xiàn)報道運用支架材料有望解決肺類器官結(jié)構(gòu)大小不一的問題[29],進(jìn)一步完善類器官的培養(yǎng)體系是亟待解決的問題。

在進(jìn)行疾病研究時,研究者以往常常通過體外培養(yǎng)細(xì)胞并施加一定的刺激或構(gòu)建動物模型模擬人體來展開研究,但體外培養(yǎng)環(huán)境和人體內(nèi)環(huán)境存在差異,且不能準(zhǔn)確反應(yīng)各因素在組織和器官水平上對疾病的影響。構(gòu)建動物疾病模型可以在一定程度上模擬疾病作用于人體的癥狀和機(jī)制,但動物與人的器官結(jié)構(gòu)上存在差異[30]。構(gòu)建類器官疾病模型可以彌補上述不足,來源細(xì)胞可通過多種方式從人體分離獲取,如AT2細(xì)胞可以通過流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)(fluorescence activated cell sorting,FACS)或磁珠分選技術(shù)(magnetic bead sorting,MACS)經(jīng)過單克隆抗體HTII280進(jìn)行分離[31],可快速高效培養(yǎng)出大量的類器官疾病模型。與構(gòu)建完整的肺部類器官相比,肺泡類器官肺泡的結(jié)構(gòu)更為精細(xì),更加適用于慢阻肺、肺纖維化等肺泡病變的肺部疾病,且在特異性藥物篩選方面具有優(yōu)勢。肺泡類器官幫助我們進(jìn)一步了解人體肺泡結(jié)構(gòu)及發(fā)育過程中的變化,而肺泡重建是我們研究肺再生中的重要一步,研究各個危險因素作用于肺泡造成的損傷有助于我們發(fā)現(xiàn)疾病治療的潛在靶點,因此,肺泡類器官作為新型疾病模型在肺泡病變的疾病研究中具有優(yōu)越性。

三、肺泡類器官在慢阻肺相關(guān)機(jī)制研究中的應(yīng)用

慢性阻塞性肺疾病的特征是慢性氣道炎癥、氣道重塑以及肺泡組織的損傷,即肺氣腫[32]。慢阻肺的發(fā)生發(fā)展與各種遺傳因素和環(huán)境因素有關(guān),吸煙是最主要的危險因素之一[33]。長期暴露于香煙煙霧(cigarette smoke,CS)會導(dǎo)致肺出現(xiàn)慢性炎癥、氧化應(yīng)激失衡和上皮細(xì)胞受損,肺不能修復(fù)這些損傷,從而導(dǎo)致肺氣腫,受損的肺組織修復(fù),特別是受損的肺泡上皮細(xì)胞修復(fù)過程進(jìn)一步促進(jìn)了肺氣腫的發(fā)展和進(jìn)展[34],但其機(jī)制尚不清楚。

研究者常用香煙煙霧以及香煙提取物(cigarette smoke extract,CSE)刺激構(gòu)建慢阻肺疾病模型。已有研究證實,COPD患者發(fā)生肺氣腫時肺上皮細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路表達(dá)受到抑制[35],一項研究使用GSK-3β抑制劑氯化鋰激活Wnt/β-catenin信號通路,可使肺氣腫逆轉(zhuǎn)[36],更為重要的是,該抑制劑可使COPD患者來源的肺泡類器官中的肺泡上皮細(xì)胞激活[37]。另一項研究在體外3D原代培養(yǎng)AT2細(xì)胞并構(gòu)建肺泡類器官,研究香煙煙霧對WNT信號下游的特異性受體卷曲蛋白-4(FZD4)、Wnt/β-catenin信號通路和肺彈性成分的影響,通過上調(diào)和下調(diào)FZD4的表達(dá)研究FZD4的表達(dá)對肺泡上皮細(xì)胞傷口愈合、修復(fù)及彈性成分表達(dá)的影響,該研究顯示香煙煙霧可下調(diào)FZD4,從而降低Wnt/β-catenin信號通路的表達(dá),阻止COPD中的肺泡組織修復(fù)[38]。這些數(shù)據(jù)表明,通過靶向作用于肺組織中的Wnt受體促進(jìn)Wnt信號通路的表達(dá),可能會改善肺泡上皮細(xì)胞功能,從而為COPD患者的組織修復(fù)提供了一種潛在的方法。NgBlichfeldt等[39]人的研究發(fā)現(xiàn)慢阻肺疾病患者WNT5A、WNT5B表達(dá)增加、FZD4表達(dá)降低與肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞有關(guān),肌成纖維細(xì)胞不僅能抑制Wnt信號通路,還能下調(diào)HGF、FGF7的表達(dá),兩者協(xié)同進(jìn)一步加重上皮損害。因此,一些研究者將治療靶點聚焦于激活Wnt信號通路。一項研究合成非選擇性Rho卷曲螺旋形成相關(guān)蛋白激酶抑制劑,發(fā)現(xiàn)能有效逆轉(zhuǎn)上述情況,促進(jìn)肺泡類器官的形成[40]。目前還沒有針對慢阻肺發(fā)病機(jī)制的治療方法,因此發(fā)現(xiàn)新的治療靶點對誘導(dǎo)慢阻肺患者肺損傷修復(fù)十分重要,肺泡類器官的發(fā)展為相關(guān)研究提供了新平臺。

一項研究將小鼠長期暴露于CS構(gòu)建慢阻肺模型,分離細(xì)胞培養(yǎng)肺泡類器官來探索序列相似成員13A家族(family with sequence similarity 13 member A,FAM13A)基因的表達(dá)對慢阻肺的作用。結(jié)果顯示暴露于香煙煙霧時FAM13A表達(dá)缺失,AT2細(xì)胞中WNT通路激活,相比于FAM13A表達(dá)增加的小鼠肺細(xì)胞發(fā)育出更多肺泡類器官[41]。Lin等[42]通過體外 培養(yǎng)小鼠原代AT2細(xì)胞構(gòu)建肺泡類器官,并給予不同濃度CSE刺激,發(fā)現(xiàn)在達(dá)到毒性濃度之前,增加CSE的濃度可促進(jìn)ATⅡ增殖分化,并抵抗凋亡,促進(jìn)類器官的形成?？諝馕廴臼锹璺蔚闹匾ｋU因素,一些研究者構(gòu)建肺泡類器官并引入污染氣體研究其對肺泡的損傷機(jī)制。一項研究在肺泡類器官的培養(yǎng)基中加入PM2.5引起肺泡損傷,研究發(fā)現(xiàn)AT2增殖能力增強(qiáng)但修復(fù)能力受損,且ATⅠ與ATⅡ細(xì)胞數(shù)量的比值明顯下降,結(jié)果表明抑制了ATⅡ細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[43]。使用柴油廢氣處理肺泡類器官2周,發(fā)現(xiàn)類器官明顯減少,并與Wnt信號通路抑制有關(guān)[44]。隨著慢阻肺病情進(jìn)展,患者肺泡上皮細(xì)胞的修復(fù)功能進(jìn)行性損傷促進(jìn)了肺氣腫的發(fā)生發(fā)展,利用肺泡類器官研究肺泡上皮細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)分化機(jī)制為肺再生的進(jìn)一步發(fā)展帶來了希望。

四、慢阻肺治療藥物的篩選

藥物治療是慢阻肺治療中極為重要的一環(huán),在傳統(tǒng)的藥物實驗中,研究者大多在體外培養(yǎng)細(xì)胞系或動物模型中,但這兩種模型都具有局限性。而類器官在藥物篩查及研究方面具備高特異性的特點[45],與其他模型相比具有獨特的組織同源性,能更真實反映疾病狀態(tài)并檢測藥物效應(yīng)。NgBlichfeldt[46]等人在體外原代培養(yǎng)小鼠和人的肺泡上皮細(xì)胞并構(gòu)建肺泡類器官,研究維甲酸對肺部疾病的作用機(jī)制,維甲酸在臨床上廣泛應(yīng)用于肺部疾病,但治療效果并不理想。這項研究發(fā)現(xiàn),維甲酸抑制劑能激活YAP信號通路及上皮-間質(zhì)細(xì)胞間的FGF信號通路,上調(diào)AT2,而激活維甲酸相關(guān)通路能促進(jìn)AT2分化為AT1,這一研究提示暫時性抑制維甲酸信號通路可能促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞的修復(fù)。另一項研究構(gòu)建肺泡類器官進(jìn)行藥物篩選發(fā)現(xiàn)氨來占諾可作為Wnt/β-catenin通路激活劑促進(jìn)肺泡類器官生成,同時可改善肺氣腫小鼠的肺功能[47],對臨床用藥的發(fā)展具有指導(dǎo)意義。根據(jù)美國食品藥品監(jiān)督管理局的數(shù)據(jù)顯示,有高達(dá)90%的藥物經(jīng)動物實驗檢測被認(rèn)為安全有效后在臨床試驗中失敗,其原因主要是具有毒性或未實現(xiàn)預(yù)期的效果[48]。因此,構(gòu)建能夠直接預(yù)測人類反應(yīng)的模型十分重要,可更為準(zhǔn)確的評估藥效及毒性。在體外構(gòu)建人類肺泡類器官,可彌補細(xì)胞模型和動物模型的缺陷,為快速有效篩選慢性阻塞性肺疾病的治療藥物提供新思路。

五、肺泡類器官在慢阻肺中的應(yīng)用前景

類器官是構(gòu)建疾病模型及研究器官再生的有利工具,相比與傳統(tǒng)的細(xì)胞模型和動物模型具有優(yōu)越性,可以減少動物在疾病研究中的使用。肺泡類器官在慢阻肺發(fā)病機(jī)制研究、尋找新的治療靶點及藥物篩選等方面具有巨大的應(yīng)用潛力,但也具有局限性。目前構(gòu)建的人肺泡類器官包含多種肺泡上皮細(xì)胞,缺乏血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及免疫細(xì)胞,未重視微環(huán)境對其發(fā)生發(fā)展的影響[49],不能完全模擬肺臟,該模型體外培養(yǎng)需要較長的時間,且細(xì)胞并未完全分化,需要在體內(nèi)進(jìn)一步生長、分化。另外,肺泡類器官目前尚無標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)方案,使用化學(xué)成分不明的細(xì)胞外基質(zhì)會影響細(xì)胞的生長發(fā)育,最新的研究發(fā)現(xiàn)添加其他種類的外源性細(xì)胞可提高類器官模型的準(zhǔn)確性[50],未來仍需進(jìn)一步探索。

類器官的發(fā)展極大推動了疾病的研究,隨著類器官培養(yǎng)技術(shù)的完善,研究者可以構(gòu)建更為準(zhǔn)確的人類器官模型,也可以對正常狀態(tài)的類器官施加刺激,模擬致病因素對器官結(jié)構(gòu)、功能的影響。肺泡類器官為疾病在肺泡結(jié)構(gòu)層面的病理生理變化、發(fā)病機(jī)制和相關(guān)信號通路提供了新的研究方法,有助于針對各疾病的相應(yīng)靶點篩選有效藥物從而進(jìn)一步推進(jìn)臨床試驗研究。隨著各種類器官的培養(yǎng)技術(shù)不斷標(biāo)準(zhǔn)化,這種模型將被更多的運用在基礎(chǔ)研究中,未來技術(shù)成熟后,可對不同患者提取病變部位的干細(xì)胞,培養(yǎng)對應(yīng)的類器官而后制定個性化治療方案,為研究個體對治療的反應(yīng)和個性化用藥開辟新途徑。