陳燕云，平 華，高 媛，杜遠(yuǎn)芳，劉 靜，張麗珍,*

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原 030006；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100097）

黍稷（Panicum miliaceumL.）又稱糜子、黍子，禾本科黍?qū)僖荒晟荼局参?，廣泛種植于山西、陜西等中國北方地區(qū)，含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪及鉀、鎂、鈣、磷等大量元素和鐵、銅、鋅、硒等微量元素，具有消炎、抗氧化和預(yù)防心腦血管疾病等功效[1]。黍稷磨米去除皮殼后稱黃米，麩皮作為加工副產(chǎn)物，除用作動物飼料外，大部分被丟棄，開發(fā)利用程度低[2]。所以黍稷麩皮中活性物質(zhì)的提取與生物活性研究極其重要。

多糖是由十個以上的單糖聚合在一起形成的碳水化合物?，F(xiàn)已從小麥、藜麥等禾本科植物中提取純化出多糖，并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，發(fā)現(xiàn)每種植物多糖具有不同的分子量與單糖組成[3-4]。研究表明多糖具有多種生物活性，如抗氧化[4]、降血糖[5]、降血脂[6]、免疫調(diào)節(jié)[7]等作用，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。如今具有抑菌活性的天然多糖也被發(fā)現(xiàn)，研究表明多糖類物質(zhì)對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌均具有不同程度的抑制效果[8]，其對革蘭氏陽性菌的抑制能力高于革蘭氏陰性菌[9]。多糖生物活性高、安全性高、毒副作用小，且從麩皮中提取多糖價格低廉，具有極高的應(yīng)用價值。

目前關(guān)于黍稷麩皮多糖的抑菌活性研究未見報道，金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、大腸桿菌Escherichia coli作為常見食源性致病菌對人類生活產(chǎn)生影響，而枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis在植物生長等方面發(fā)揮作用[10]，本研究選擇這三種菌具有對比參考價值。多糖生物活性與其結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)[11]，包括單糖組成比例、官能團(tuán)類型和糖苷鍵連接方式等。因此，對黍稷麩皮多糖進(jìn)行分離，并研究其抑菌活性與結(jié)構(gòu)間的構(gòu)效關(guān)系具有重要意義。本實驗旨在通過采用堿提法提取黍稷麩皮多糖，并對其分離純化，分析多糖分子量、單糖組成及結(jié)構(gòu)特征，進(jìn)而研究其體外抗菌活性，為黍稷加工副產(chǎn)物中營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)一步利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黍稷麩皮 購自山西河曲；無水乙醇、苯酚、硫酸、正丁醇、氯仿、氫氧化鈉、氯化鈉 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；AB-8 大孔樹脂、DEAE 纖維素DE-52、葡聚糖凝膠G-100 北京索萊寶科技有限公司；金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、大腸桿菌Escherichia coli本實驗室-80 ℃密封保藏。

JHBE-50V 實驗型閃式提取器 河南盛孚生物科技有限公司；Ifinite 200 Pro 多功能微孔板檢測儀帝肯貿(mào)易有限公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；HC-2062 高速離心機(jī)安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；RV8 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 艾卡儀器設(shè)備有限公司；Alpha2-4 LD plus 真空冷凍干燥機(jī) 北京博勱行儀器有限公司；MS7-Pro 數(shù)控方盤磁力攪拌器 上海世澤生物技術(shù)有限公司；依利特液相色譜儀 大連依利特分析儀器公司；高效液相色譜1260 美國安捷倫科技有限公司；Regulus8230 掃描電鏡 日立公司；Dimension Icon 原子力顯微鏡 德國Bruker 公司；STA449F3 TGDSC 同步熱分析 德國Netzsch 公司；MiniFlex 600X-射線衍射儀 日本東京理學(xué)公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黍稷麩皮多糖的提取 參考陳樹俊等[12]的方法，稍作修改，黍稷麩皮經(jīng)提取皂苷多酚等小分子物質(zhì)后，采用堿提醇沉法對濾渣進(jìn)行多糖提取，稱取30.00 g 黍稷麩皮濾渣，料液比為1:20（m/V）加入0.16 mol/L 的NaOH 溶液，65 ℃下磁力攪拌浸提2 h，離心過濾得上清液，合并上清液，濃縮至150 mL，加入4 倍體積95%乙醇沉淀過夜，離心收集沉淀，冷凍干燥得粗多糖。

1.2.2 黍稷麩皮多糖的分離純化 將粗多糖溶液用Sevag 試劑（氯仿:正丁醇=4:1）進(jìn)行脫蛋白處理，用AB-8 大孔樹脂脫色，透析48 h（Mw=3500 Da）。將多糖溶液進(jìn)行DEAE-52 纖維素柱層析，用蒸餾水、0.1～0.3 mol/L NaCl 溶液依次洗脫，流速為1 mL/min，每5 min 收集一管，采用苯酚-硫酸法測定洗脫液中的總糖含量[12]，收集洗脫組分，凍干后得到含量較高的多糖組分，經(jīng)Sephadex G-100 凝膠柱層析，洗脫液經(jīng)測定收集凍干后得到純化多糖，并通過紫外光譜法測定其純度，測量的波長范圍為200～400 nm[12]。

1.2.3 黍稷麩皮多糖的結(jié)構(gòu)表征

1.2.3.1 分子量分布的測定 參考倪茂君等[13]的方法：采用高效凝膠滲透色譜法，稱取10 mg 的多糖樣品溶于2 mL 水中，配制己知分子量的葡聚糖系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以保留時間為橫坐標(biāo)，分子量的對數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。色譜條件：示差折光檢測器（shodex RI201-H）；色譜柱（TSKgel GMPWxl），柱溫35 ℃；流動相為超純水；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量20.0 μL。

1.2.3.2 單糖組成測定 參考Liang 等[14]的方法：多糖水解及衍生化：稱取10 mg 的多糖樣品，加入2 mol/L 三氟乙酸（TFA）6 mL 在110 ℃下水解3 h，減壓蒸干后加1 mL 甲醇，再蒸干，重復(fù)3 次后得到水解產(chǎn)物，加入0.3 mol/L NaOH 200 μL，0.5 mol/L PMP-甲醇200 μL，在70 ℃下水浴進(jìn)行衍生化1 h，冷卻后加入0.3 mol/L 的HCl 溶液200 μL，用1 mL氯仿萃取，重復(fù)萃取3 次后取上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾進(jìn)行單糖組成測定。

色譜條件：采用UltimateXB-C18色譜柱；流動相：A 為0.05 mol/L 的KH2PO4（pH6.7）；B 為乙腈；A:B=82:18；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；波長：250 nm。

1.2.3.3 傅里葉紅外光譜分析 參考劉露等[15]的方法：稱取5 mg 黍稷麩皮多糖樣品和KBr 混合研勻壓片后，在4000～650 cm-1波長范圍內(nèi)通過紅外光譜儀掃描，掃描16 次。

1.2.3.4 X-射線衍射分析 參考李占君等[16]的方法：通過XRD 衍射圖譜分析多糖的晶體結(jié)構(gòu)，操作條件：Cukα輻射，管內(nèi)電壓40 kV，管內(nèi)電流40 mA，角度4°～60°，角度梯度0.02°，掃描運行速度5 ℃/min。

1.2.3.5 掃描電鏡分析 參考楊許花等[17]的方法：將樣品粘在導(dǎo)電膠上，置于真空離子濺射儀內(nèi)鍍導(dǎo)電層，時長90 s，厚度7±2 nm，將樣品臺放入冷場掃描電鏡進(jìn)行抽真空，開啟加速電壓，選二次電子模式，電子槍加速電壓5 kV，選擇不同放大倍數(shù)進(jìn)行拍照測試。

1.2.3.6 原子力顯微鏡（AFM）分析 參考梁濤等[18]的方法：取部分多糖樣品分散到乙醇溶液中進(jìn)行超聲，然后取幾滴分散好的液體逐滴滴加在云母片上，晾干后，進(jìn)行原子力顯微鏡觀測。

1.2.3.7 TG-DSC 測定 參考馬永強(qiáng)等[19]的方法：通過同步熱分析TG-DSC 觀察多糖的量熱變化，測試條件：以氮氣為載氣，流速為20 mL/min 溫度升高速率為10 ℃/min 溫度變化范圍為30～800 ℃。

1.2.4 黍稷麩皮多糖體外抑菌活性測定

1.2.4.1 體外抑菌效果測定 采用牛津杯法測定多糖抑菌效果：將菌懸液用生理鹽水依次稀釋10-1，10-2，10-3，10-4倍，用移液槍分別移取50 μL 上述稀釋的菌懸液至凝固的培養(yǎng)皿上，用無菌的涂布棒均勻涂布，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，發(fā)現(xiàn)當(dāng)上述菌懸液稀釋10-3倍時培養(yǎng)基中細(xì)菌分布的密集度最符合實驗要求。按方法重新制備菌懸液后，稀釋10-3倍，移取50 μL，均勻涂布到無菌的固體培養(yǎng)基上。靜置10 min 后，每個培養(yǎng)皿等距離放置3 個滅菌的牛津杯，將配制好的樣品溶液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾除菌后各取200 μL 加入牛津杯中，用青霉素作為陽性對照，用無菌生理鹽水作為陰性對照。細(xì)菌置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈情況，量取各個培養(yǎng)皿中抑菌圈直徑，各組取平均值后進(jìn)行比較[20]。

1.2.4.2 最小抑菌濃度（MIC）的測定 將多糖樣品用無菌水溶解，濃度為15 mg/mL，然后用無菌LB 肉湯稀釋，達(dá)到15 mg/mL 至0.9375 mg/mL 的連續(xù)梯度濃度。將稀釋后的細(xì)菌懸液（100 μL）加入到96 孔微孔板中，然后加入不同的樣品（100 μL）。每個孔中的最終細(xì)菌濃度為1×105集落形成單位（CFU/mL）。以無多糖試劑肉湯作為空白對照。以青霉素為陽性對照，96 孔板在37 ℃下孵育24 h。觀察孔中濁度MIC 為抑制細(xì)菌生長的多糖的最低濃度[21]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究均進(jìn)行3 次重復(fù)實驗，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin8.0 和Excel 軟件作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黍稷麩皮多糖的提取、分離和純化

以葡萄糖質(zhì)量濃度和其吸光度值繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=7.314x+0.0012，R2=0.999。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用苯酚硫酸法測得黍稷麩皮多糖含量為45.7%±0.32%，如圖1 所示，經(jīng)DEAE-50 纖維素柱分級得到MBP-A（后續(xù)稱MBP），由于MBP-B和MBP-C 峰較小即含量較少，則不做后續(xù)研究。由圖2 可知，經(jīng)Sephadex G-100 洗脫后呈現(xiàn)單一對稱峰，經(jīng)測定純度達(dá)到98.40%±0.09%。從圖3 可知，在260 和280 nm 處沒有出現(xiàn)核酸和蛋白質(zhì)的特征吸收峰，說明MBP 不含核酸和蛋白質(zhì)，純度較高。

圖1 黍稷麩皮多糖的DEAE-50 洗脫曲線Fig.1 DEAE-50 elution curves of proso millet bran polysaccharide

圖2 黍稷麩皮多糖的Sephadex G-100 洗脫曲線Fig.2 Sephadex G-100 elution curve of proso millet bran polysaccharide

圖3 黍稷麩皮多糖的紫外光譜圖Fig.3 UV-VIS spectroscopy of proso millet bran polysaccharide

2.2 黍稷麩皮多糖結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 分子量分析 采用高效凝膠滲透色譜測定多糖分子量，圖4 可以看出，MBP 在色譜圖中呈現(xiàn)單一峰，保留時間8.76 min，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-1.1004x+14.181（R2=0.9984）計算，黍稷麩皮多糖MBP 分子量為3.479×104Da。

圖4 黍稷麩皮多糖凝膠滲透色譜圖Fig.4 Gel permeation chromatogram of proso millet bran polysaccharide

2.2.2 單糖組成分析 混合的單糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖5。采用PMP 衍生化HPLC 法檢測黍稷麩皮多糖的單糖組成，通過與圖5 對比，得出黍稷麩皮多糖由6 種多糖組成（見圖6），摩爾比為甘露糖:鼠李糖:葡萄糖:半乳糖:阿拉伯糖:木糖=0.11:0.13:5.86:0.62:1.00:0.52。MBP 是一種中性雜多糖，主要單糖為葡萄糖和阿拉伯糖。與其他一些麥麩等多糖相比，雖然大多數(shù)單糖組成相似，但含量最高的單糖卻有所不同，如在Shang 等[22]的研究中麥麩多糖主要由木糖與阿拉伯糖組成。

圖5 混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品高效液相圖譜Fig.5 HPLC chromatograms of mixed monosaccharide standard

圖6 黍稷麩皮多糖的單糖色譜圖Fig.6 Composition of proso millet bran polysaccharide

2.2.3 紅外光譜結(jié)果分析 采取傅里葉紅外光譜對黍稷麩皮多糖官能團(tuán)進(jìn)行分析，由圖7 可知，黍稷麩皮多糖紅外光譜中分子內(nèi)或分子間氫鍵的OH 伸縮振動在3336.3 cm-1處有一個強(qiáng)吸收峰[23]，在2927.2 cm-1左右的弱吸收帶歸因于不對稱的CH 伸縮振動，在1622.7 cm-1左右的吸收峰是糖環(huán)上的C-O 不對稱拉伸峰，這可以說明樣品在4000～650 cm-1波長區(qū)域范圍內(nèi)是具有多糖類物質(zhì)的一般性共性特征。1022.7 cm-1是吡喃環(huán)的特征吸收峰；854.5 cm-1是β型糖苷鍵吸收峰[24]；在1741.18 cm-1處未觀察到吸收峰，表明沒有大量糖醛酸[25]。由上可知，此多糖是一種含β型糖苷鍵結(jié)構(gòu)的吡喃糖。

圖7 黍稷麩皮多糖傅里葉紅外光譜圖Fig.7 FT-IR spectroscopy of proso millet bran polysaccharide

2.2.4 X-射線衍射結(jié)果分析 采用X-射線衍射法分析黍稷麩皮多糖MBP 的晶體結(jié)構(gòu)，一般來說，晶體材料呈尖銳的窄衍射峰，而非晶組分呈寬峰。如圖8 所示，MBP 在20°處有一個寬的衍射峰，在32°有少量峰值較小的峰出現(xiàn)，并無較明顯性吸收峰產(chǎn)生，呈現(xiàn)出一種無定形狀態(tài)。Ren 等[26]采用XRD 分析藜麥多糖（QP）及其分離純化得到的多糖組分的構(gòu)象，發(fā)現(xiàn)QP 未經(jīng)進(jìn)一步分離純化不能形成單晶，以無定形形式存在，而MBP 經(jīng)分離純化后仍呈現(xiàn)無定形狀態(tài)，這可能與提取方式以及分子量大小單糖組成等不同有關(guān)，水解程度增加、分子量和聚合度的降低等均會破壞多糖的內(nèi)部晶體結(jié)構(gòu)。

圖8 黍稷麩皮多糖X 射線衍射結(jié)果Fig.8 X-ray diffraction (XRD) patterns of proso millet bran polysaccharide

2.2.5 表觀形貌分析 采用掃描電鏡觀察黍稷麩皮多糖MBP 的表觀形貌，如圖9 所示，SEM 圖中多糖呈現(xiàn)不規(guī)則片狀，結(jié)構(gòu)疏松，分子間存在空隙，圖中觀察到一些光滑的球形顆粒和棒狀結(jié)構(gòu)，為多糖聚合物之間的相互連接提供機(jī)會。Shang 等[22]從小麥麩皮中提取的多糖呈光滑片狀形態(tài)，表面邊緣有褶皺。多糖的形態(tài)結(jié)構(gòu)受到原料來源或提取工藝的影響，如超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)剪切力會使多糖形態(tài)粗糙多孔。

圖9 黍稷麩皮多糖SEM 圖Fig.9 SEM images of proso millet bran polysaccharide

2.2.6 分子形貌分析 采用原子力顯微鏡觀察黍稷麩皮多糖MBP 的分子形貌，如圖10 所示，AFM 圖上出現(xiàn)了相對均勻的顆粒狀結(jié)構(gòu)，多糖分子高度最高為12.46 nm。有研究表明，多糖中的單鏈高度一般在0.1～1.0 nm 范圍內(nèi)，所以推斷圖中的線性鏈結(jié)構(gòu)是由多條鏈通過范德華力或氫鍵連接締合形成的凝聚結(jié)構(gòu)[27]。

圖10 黍稷麩皮多糖AFM 圖Fig.10 AFM images of proso millet bran polysaccharide

2.2.7 熱性能分析 采用TG-DSC 分析黍稷麩皮多糖MBP 的熱力學(xué)性質(zhì)，如圖11 所示，黍稷麩皮多糖熱重變化主要分為3 個階段：第1 階段，室溫至193.94 ℃，質(zhì)量損失率為9.17%，質(zhì)量損失主要是失去了多糖分子中的自由水和結(jié)合水；第2 階段，193.94 ℃至389.47 ℃，質(zhì)量損失率為62.89%，此階段多糖質(zhì)量損失率加快，熱降解速率和重量損失達(dá)到最大值，主要可能是高溫使多糖分子碳鏈和氫鍵被破壞，多糖分子被分解；第3 階段，389.47 ℃至800 ℃，樣品損失率較慢，質(zhì)量損失率為7.38%。這可能是由炭的熱分解引起的[28]。王鑫等[29]的研究表明小麥麩皮多糖在30～132 ℃溫度范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性，與之相比，黍稷麩皮多糖在室溫至193.94 ℃范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，說明黍稷麩皮多糖的熱穩(wěn)定性更好。差示掃描量熱分析（圖12）顯示黍稷麩皮多糖分別在63.25、257.66、291.29、354.17 ℃有吸熱反應(yīng)。這可能是由于脫水或外圍多糖鏈和脫羥基化反應(yīng)，在保護(hù)性氣體（氮氣）的保護(hù)下并無放熱峰的產(chǎn)生，說明黍稷麩皮多糖MBP 是一種無定形性多糖，這與X 射線條件下的試驗結(jié)果一致。結(jié)果表明，多糖MBP 的熱穩(wěn)定性良好，可作為添加物用于需高溫處理食品中[30]。

圖11 黍稷麩皮多糖的熱重分析結(jié)果Fig.11 Rmogravimetry analysis curves of proso millet bran polysaccharide

圖12 黍稷麩皮多糖的差示掃描量熱分析Fig.12 Scanning calorimetry curve of proso millet bran polysaccharide

2.3 黍稷麩皮多糖抑菌活性分析

由表1 可知，黍稷麩皮多糖提取物對3 種指示菌中的金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，MIC 值為2 mg/mL，對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌抑制作用不明顯。黍稷麩皮多糖提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌抑菌圈直徑分別為16.10±0.32，9.30±0.00，10.70±0.32 mm，其中大腸桿菌抑菌圈直徑高于對照青霉素組。多糖對革蘭氏陽性菌的抑菌能力高于革蘭氏陰性菌，可能是因為陽性菌的細(xì)胞膜比陰性菌敏感，這與前人關(guān)于茯苓多糖抑菌實驗結(jié)果一致[31]。周欣[20]研究結(jié)果表明香菇多糖對大腸桿菌抑菌作用最強(qiáng)，MIC 為1.25 mg/mL，這可能是由于香菇多糖和黍稷麩皮多糖在結(jié)構(gòu)方面存在差異；香菇多糖對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌MIC 均為2.5 mg/mL，黍稷麩皮多糖對金黃色葡萄球菌的抑制作用略高于香菇多糖。魏磊等[32]研究得出赤松茸多糖對金黃色葡萄球菌的MIC 為25 mg/mL。與之相比，本研究的黍稷麩皮多糖抑菌活性明顯高于赤松茸多糖，且成本更低。因此，利用黍稷麩皮生產(chǎn)飼用多糖作為一種新型、天然的抑菌劑具有良好的開發(fā)前景。

3 結(jié)論

黍稷麩皮多糖提取物經(jīng)分離純化后，MBP純度達(dá)到98.40%±0.09%，分子量為3.479×104Da，主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖等6 種單糖組成。進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，紅外光譜結(jié)果表明MBP 為β型吡喃多糖，掃描電鏡及原子力顯微鏡觀察多糖MBP 的形態(tài)學(xué)特征多為片層狀結(jié)構(gòu)且連接緊密，X-射線衍射結(jié)果表明多糖MBP 在晶體結(jié)構(gòu)方面呈現(xiàn)出無定形狀態(tài)，TGDSC 結(jié)果表明多糖MBP 具有良好的熱穩(wěn)定性。通過抑菌實驗，結(jié)果表明多糖MBP 對金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑菌活性。本研究為黍稷麩皮的開發(fā)提供了參考，為其功能性食品或醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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