何 珊，王昱蘇，張 碩，金 嫘，查恩輝

（錦州醫(yī)科大學(xué)食品與健康學(xué)院，遼寧錦州 121000）

雞肉是人類最主要的膳食蛋白質(zhì)來源之一，雞肉中的脂質(zhì)含量較低，富含多不飽和脂肪酸[1]，具有理想的營養(yǎng)特性和多種保健功能，如溫補(bǔ)氣血、補(bǔ)精補(bǔ)髓、強(qiáng)健筋骨等[2]。此外，因低膽固醇、價(jià)格低廉、沒有文化和宗教限制等特點(diǎn)，雞肉在全球范圍內(nèi)的消費(fèi)量不斷增加[3-4]。在發(fā)達(dá)國家，消費(fèi)者越發(fā)重視肉類的質(zhì)量安全和營養(yǎng)健康[5-6]。雞胸肉作為其最大的主要部位，烹飪方便快捷，有一定市場(chǎng)前景[7]。脂質(zhì)以及蛋白質(zhì)發(fā)生氧化損傷是影響肉制品保質(zhì)期和營養(yǎng)價(jià)值的主要原因[8-9]。肌肉內(nèi)脂肪含量和肌肉纖維類型是影響各類肉質(zhì)口感、嫩度和多汁性等特征的主要因素[10-11]。

在肉制品的熱處理方式中常壓蒸煮和高壓煮制是世界范圍內(nèi)廣泛使用的肉類加工技術(shù)[12]。代媛媛等[13]研究發(fā)現(xiàn)不同的煮制溫度和保溫時(shí)間對(duì)雞胸肉嫩度和蒸煮損失率均產(chǎn)生明顯的影響。劉晶晶等[14]研究表明隨著加熱的時(shí)間和溫度的增大，牛肉的剪切力值降低，蒸煮損失率增加，水分含量下降。Zielbauer 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，煮制豬肉時(shí)，蒸煮損失和煮制時(shí)間和溫度呈正相關(guān)，水分損失主要出現(xiàn)在240 min 內(nèi)、煮制溫度大于60 ℃時(shí)。近年來，關(guān)于高壓技術(shù)在改善肉類品質(zhì)方面的研究日益廣泛。鄭海波[16]的研究表明，對(duì)雞肉糜進(jìn)行較長時(shí)間的高壓處理能提高肉的嫩度，這是由于壓力作用下肌肉肌節(jié)結(jié)構(gòu)被破壞，肌纖維結(jié)構(gòu)也產(chǎn)生變化。雖然高壓對(duì)肉品嫩化起到優(yōu)化作用[17]，但高壓技術(shù)在工業(yè)實(shí)施中成本較高，設(shè)備成本與其經(jīng)濟(jì)產(chǎn)出不平衡，并且伴隨著強(qiáng)烈的脫色反應(yīng)[18]，而肉類顏色作為肉類新鮮度和質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，會(huì)大大減少消費(fèi)者購買欲望[19]。相比于高壓煮制，微壓煮制可以更少地?fù)p害食品營養(yǎng)和風(fēng)味，同時(shí)縮短加熱煮制時(shí)間。目前微壓煮制主要應(yīng)用在米飯、豆?jié){熟制方面，對(duì)食品品質(zhì)具有改善作用[20-21]。雞肉中的蛋白質(zhì)是人類所需的必需氨基酸和營養(yǎng)物質(zhì)的來源之一。蛋白氧化不僅會(huì)改變蛋白質(zhì)的一些功能特性和質(zhì)構(gòu)特征，還會(huì)對(duì)肉品中的蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，進(jìn)而對(duì)肉制品加工產(chǎn)生一定的影響。對(duì)比已有研究發(fā)現(xiàn)，微壓煮制對(duì)食品品質(zhì)的效果更好，但對(duì)于微壓煮制對(duì)雞肉肌原纖維蛋白的影響研究在國內(nèi)外較少且不深入。

因此，本研究的目的是對(duì)比常壓煮制、微壓煮制、高壓煮制對(duì)雞胸肉的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及氧化穩(wěn)定性的影響，找到最佳的煮制工藝參數(shù)，明確微壓煮制的特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)，為醬鹵雞肉預(yù)制產(chǎn)品的生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)參考和技術(shù)支持。以雞肉蛋白質(zhì)氧化為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)雞肉進(jìn)行評(píng)價(jià)，為更低成本、更高效率地獲得高品質(zhì)雞肉提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞胸肉（新鮮）購于錦州市比優(yōu)特超市；磷酸溶液、氯化鈉、氯化鎂、氫氧化鈉等試劑 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸胍、甲醇、溴化鉀、乙醇、尿素、十二烷基硫酸鈉（SDS）等試劑 天津博迪化工有限公司；磷酸二氫鉀、溴酚藍(lán)、2,4-二硝基苯肼、磷酸氫二鉀、乙酸乙酯、三氯乙酸、乙二胺四乙酸（EDTA）等試劑 恒興化學(xué)試劑制造有限公司；所有試劑均為分析純。

FA1004 電子天平 青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司；KH20R 高速冷凍離心機(jī) 上海雙旭電子有限公司；CH6 數(shù)字顯示溫度計(jì) 廣州海倫儀器儀表有限公司；JJ-2 高速勻漿機(jī) 上海啟前電子科技有限公司；HH-WO 恒溫水浴鍋 山東千司科學(xué)儀器有限公司；U-T6 紫外可見分光光度計(jì) 讓奇（上海）儀器科技有限公司；V-PHSJ-5 型pH 計(jì) 上海熠昕電子科技有限公司；W-Great20 傅立葉紅外光譜儀 中科瑞捷科技有限公司；X-FD-1A-50 冷凍干燥機(jī) 杭州漢德空分設(shè)備有限公司；JSM-IT200 掃描電子顯微鏡 惠州市華高儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 用流水將肉表面洗干凈，均勻切割為4 cm×3 cm×3 cm 的小塊，放在燒杯內(nèi)，用保鮮膜蓋緊，在4 ℃的冰箱中保存。

1.2.2 雞肉煮制處理 常壓煮制處理：將肉樣放入裝有500 mL 的燒杯中，再放入85 ℃恒溫水浴鍋中，用電子溫度記錄儀檢測(cè)肉塊中心溫度達(dá)到72 ℃。

微壓樣品處理：將被測(cè)肉樣放入微壓鍋，壓力為4 kPa。

高壓樣品處理：把被測(cè)試的肉樣放入高壓鍋，壓力為70 kPa。

保壓時(shí)間分別為15、20、25、30、35 min，完成后取出冷卻至室溫[22]。

用吸水紙吸干肉樣表面汁液，測(cè)定其余指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù)測(cè)定。

1.2.3 肌原纖維蛋白的提取 參考文獻(xiàn)[23-24]方法稍作修改。稱取肉樣，添加其四倍量的4 ℃提取液（10 mmol/L 磷酸緩沖溶液，其中包括100 mmol/L NaCl、1 mmol/ EDTA 以及2 mmol/L MgCl2，pH7.0），混合搖勻后進(jìn)行勻漿，勻漿120 s 后在3500 r/min、4 ℃下離心15 min。取沉淀，將勻漿反復(fù)離心三次，于以上條件下棄去上清液，得到的沉淀以四倍量4 ℃洗液洗滌（25 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，含0.6 mol/L NaCl，pH7.0）反復(fù)洗滌三次后過濾，用0.1 mol/L HCl 將濾液pH 調(diào)節(jié)至6.0，所得濾液在3500 r/min和4 ℃的條件下再次離心15 min。所得沉淀放入封閉瓶內(nèi)，4 ℃保存，待用。采用牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)，540 nm 處測(cè)其吸光度和雙縮脲法檢測(cè)蛋白濃度（y=0.0485x+0.0032，R2=0.9997）。

1.2.4 羰基含量的測(cè)定 參考Pérez-Alvarez 等[25]方法稍加修改。取1 mL 質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的蛋白溶液和1 mL 濃度為0.01 mol/L 的2,4-二硝基苯肼溶液（DNPH，溶劑為2 mol/L HCl），空白樣品不加DNPH，暗室避光反應(yīng)1 h，每次間隔20 min 振蕩1 次，加1 mL TCA 溶液，搖勻后離心，在10000 r/min，4 ℃條件下離心15 min，除去上清液。得到的沉淀使用1 mL 乙酸乙酯-乙醇溶液（V/V=1:1）清洗3 次。再加入5 mL 6 mol/L 的鹽酸胍溶液，于38 ℃水浴條件下反應(yīng)20 min，隨后在10000 r/min 和4 ℃的條件下繼續(xù)離心5 min。在370 nm 波長處測(cè)定吸光度，羰基含量通過22000 L/（mol·cm）的摩爾吸收率計(jì)算。

式中：A370為370 nm 下的吸光度；n 為稀釋倍數(shù)；106為摩爾基礎(chǔ)單位；C 為測(cè)得的蛋白濃度（mg/mL）。

1.2.5 巰基含量的測(cè)定 參考Yang 等[26]方法稍加修改。取蛋白溶液用0.1 mol/L 的磷酸緩沖液（pH7.4）稀釋為質(zhì)量濃度2 mg/mL，所得溶液取0.5 mL 于試管中，加入2.0 mL 尿素-SDS 溶液和0.5mL DTNB 溶液，混合搖勻，室溫下置于暗處反應(yīng)25 min，在412 nm 處測(cè)定吸光度。巰基含量由11400 L/（mol·cm）的摩爾吸收率計(jì)算。

式中：A412為412 nm 下的吸光度；n 為稀釋倍數(shù)；106為摩爾基礎(chǔ)單位；C 為測(cè)得的蛋白濃度（mg/mL）。

1.2.6 掃描電鏡觀察 參考孫慧琳[27]的方法稍加修改。將雞肉樣品沿肌纖維方向切成0.1 cm×0.1 cm×0.2 cm 的小肉片，用2.5%戊二醛浸泡12 h，加入0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液浸泡固定3 次，每次20 min；完成后進(jìn)行梯度脫水，分別用30%、50%、70%、80%和90%的乙醇，每次15 min，再用無水乙醇進(jìn)行脫水兩次，每次15 min；最后，在冷凍干燥及金噴涂后用掃描電鏡觀察并拍攝肉樣結(jié)構(gòu)。

1.2.7 傅里葉變換紅外光譜測(cè)定 參考Yang 等[28]方法稍加修改。在-20 ℃的條件下冷凍蛋白樣品5 h，之后取出冷凍干燥12 h，稱量1 mg 所得樣品向其中加入100 mg 溴化鉀，于研缽內(nèi)充分研磨。將所得粉末均勻平鋪模具中并橫向置于模座內(nèi)，加壓至10 t/cm2，保持1 min，用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行分析，條件為：光譜范圍：500～4000 cm-1，分辨率：4 cm-1，掃描積累32 次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次以上，采用SPSS 26 對(duì)數(shù)據(jù)處理和方差分析，多重比較采用Duncan 法，并采用Origin2021 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 煮制壓力對(duì)雞肉蛋白羰基含量的影響

在蛋白質(zhì)的氧化性反應(yīng)中，最常見的指示劑是羰基的含量，雞肉內(nèi)羰基直接被蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的氨基酸氧化或主肽鏈發(fā)生斷裂而產(chǎn)生，也可由于雞肉被氧化而產(chǎn)生非蛋白羰基化合物。這類氨基酸側(cè)鏈直接氧化是目前公認(rèn)的生成蛋白質(zhì)羰基衍生物最重要的方法[29]，結(jié)果見圖1。

圖1 不同壓力及時(shí)間對(duì)蛋白羰基含量的影響Fig.1 Effects of different pressure and time on protein carbonyl content

由圖1 可知，保壓時(shí)間為15～35 min 時(shí)，常壓煮制下羰基含量從0.86 nmol/mg 增加到1.91 nmol/mg，增加了1.22 倍；微壓煮制下羰基含量從1.14 nmol/mg 增加至2.71 nmol/mg，增加了1.38 倍；高壓煮制下羰基含量從1.33 nmol/mg 增加至2.91 nmol/mg，增加了1.19 倍。三種壓力下隨著保壓時(shí)間的增加羰基含量均升高，原因是脂質(zhì)氧化的產(chǎn)物與肌原纖維蛋白相結(jié)合，使得蛋白質(zhì)羰基的含量升高，而在雞肉中較少的脂肪發(fā)生氧化反應(yīng)，也會(huì)引起羰基的升高[30]。

2.2 煮制壓力對(duì)雞肉蛋白巰基含量的影響

蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)主要通過分子間各種作用力共同形成，其中二硫鍵對(duì)蛋白質(zhì)的一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性都起著重要的作用[31]。二硫鍵與巰基之間是一種動(dòng)態(tài)的相互轉(zhuǎn)化關(guān)系。蛋白質(zhì)之間疏水性質(zhì)、相互作用力等功能的改變是代表蛋白質(zhì)變性情況的主要指標(biāo)，其改變的主要原因之一是二硫鍵與巰基的共價(jià)交聯(lián)與斷裂改變蛋白質(zhì)的作用力情況并影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[32]。巰基有維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能特性的作用，屬于功能基團(tuán)中活性較強(qiáng)的一類基團(tuán)，結(jié)果見圖2。

圖2 不同壓力及時(shí)間對(duì)蛋白巰基含量的影響Fig.2 Effects of different pressure and time on protein sulfhydryl content

由圖2 可知，常壓煮制時(shí)間為15～20 min 時(shí)，巰基含量從68.5 nmol/mg 增加至78.4 nmol/mg，繼續(xù)延長保壓時(shí)間至35 min，巰基含量下降到55.2 nmol/mg，下降了29.6%。當(dāng)煮制時(shí)間持續(xù)延長，巰基含量先上升再下降，這是因?yàn)槿鈽邮軣嵊绊懥思?dòng)球蛋白的解離程度，當(dāng)保壓時(shí)間達(dá)到20 min 時(shí)肌動(dòng)蛋白最大程度解離，巰基含量在此時(shí)達(dá)到最高，繼續(xù)煮制后改變了肌動(dòng)球蛋白構(gòu)象，巰基氧化生成為二硫鍵[33]，使得巰基含量降低。微壓煮制下，保壓時(shí)間為15～35 min，巰基含量從76.1 nmol/mg 減少至53.4 nmol/mg，下降了29.8%。高壓煮制下，保壓時(shí)間為15～35 min 時(shí)，巰基含量從70.4 nmol/mg 減少至48.3 nmol/mg，下降了31.4%。高壓及微壓條件下，當(dāng)保壓時(shí)間延長，巰基含量同步減少，原因是壓力處理使肌原纖維蛋白展開，更多隱藏的巰基暴露，增加疏水性，使分子間巰基間距變小，促進(jìn)二硫鍵的形成，致使巰基減少[34]。

2.3 煮制壓力對(duì)肌纖維微觀結(jié)構(gòu)的影響

采用最佳加工工藝組合處理雞胸肉，同時(shí)進(jìn)行對(duì)照處理（生雞胸肉）。不同的煮制壓力下各組雞胸肉的掃描電鏡圖結(jié)果見圖3。

圖3 雞胸肉的微觀纖維結(jié)構(gòu)圖（5000×）Fig.3 Microscopic fiber structure of chicken breast (5000×)

圖3A 為對(duì)照組生雞胸肉樣品的肌纖維結(jié)構(gòu)圖，可以看出生雞胸肉肌纖維空隙較小，組織結(jié)構(gòu)致密且有序，紋理清晰，肌束膜以及肌內(nèi)膜的結(jié)構(gòu)比較完整，具有疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。圖3B 為常壓煮制下雞胸肉樣品的肌纖維結(jié)構(gòu)圖，與生雞肉樣品相比，常壓煮制下雞胸肉樣品表面紋理模糊，膜結(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)部分?jǐn)嗔驯澜?，有?xì)微顆?；镔|(zhì)出現(xiàn)，結(jié)構(gòu)的有序度被破壞；圖3C 為4 kPa 微壓煮制下雞胸肉樣品的肌纖維結(jié)構(gòu)圖，可以看出雞胸肉的肌纖維與常壓煮制下雞胸肉樣品類似，但在肌纖維空隙中呈現(xiàn)出更明顯的顆?；镔|(zhì)；圖3D 為70 kPa 高壓煮制下雞胸肉樣品的肌纖維結(jié)構(gòu)圖，相較于常壓蒸煮及微壓煮制，高壓煮制下雞胸肉中肌纖維結(jié)構(gòu)被完全破壞，肌節(jié)斷裂，幾乎看不到顆?；镔|(zhì)，絕大部分肌束膜裂解，基本完全消失。綜上所述，經(jīng)三種不同壓力煮制后的雞胸肉結(jié)構(gòu)被破壞程度大小為高壓煮制＞微壓煮制＞常壓煮制。

2.4 煮制壓力對(duì)肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

傅里葉變換紅外光譜用于分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，可定量分析蛋白各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量[35]，各子峰與其二級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系如下：1615～1637 cm-1為β-折疊；1637～1645 cm-1為無規(guī)則卷曲；1646～1661 cm-1為α-螺旋；1660～1695 cm-1為β-轉(zhuǎn)角[24]。在此基礎(chǔ)上，通過對(duì)不同水煮壓力下的傅里葉光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行基線修正，然后通過計(jì)算二階導(dǎo)數(shù)和去卷積等方法剔除多余的子峰，最后通過Peakfit 擬合得到最小的剩余值。根據(jù)其峰面積來計(jì)算各類二級(jí)結(jié)構(gòu)比率，結(jié)果如圖4～圖6。

圖4 常壓煮制下不同時(shí)間對(duì)雞胸肉肌原纖維蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量圖Fig.4 Relative content of secondary structure of myofibrillar protein in chicken breast at different time under atmospheric pressure cooking

圖5 微壓煮制下不同時(shí)間對(duì)雞胸肉肌原纖維蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量圖Fig.5 Relative content of secondary structure of myofibrillar protein in chicken breast at different time under micro-pressure cooking

圖6 高壓煮制下不同時(shí)間對(duì)雞胸肉肌原纖維蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量圖Fig.6 Relative content of secondary structure of myofibrillar protein in chicken breast at different time under high pressure cooking

由圖4～圖6 可知，不同煮制壓力下，肌原纖維蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量隨保壓時(shí)間延長發(fā)生的變化不相同。在常壓煮制下，保壓15～35 min 時(shí)，α-螺旋的百分比含量從28.74%下降至10.52%，β-折疊的百分比含量從18.13%增加至57.42%，無規(guī)則卷曲的百分比含量從20.59%增加至45.5%，β-轉(zhuǎn)角從11.48%增加至13.53%。隨著壓力保持時(shí)間的延長，α-螺旋的含量降低，β-折疊、無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角的含量則增加。在微壓煮制下，保壓15～35 min，α-螺旋含量由27.16%降低至9.63%；無規(guī)則卷曲含量從27.46%增加至46.69%；β-轉(zhuǎn)角呈波動(dòng)性變化；保壓15～35 min，β-折疊含量呈明顯上升趨勢(shì)，由28.52%升高至45.09%。在高壓煮制下，保壓15～25 min，β-折疊含量從30.03%增加至58.01%，直到35 min，β-折疊含量下降至43.23%；當(dāng)保壓15～35 min 時(shí)，無規(guī)則卷曲含量從28.70%增加至58.61%，α-螺旋含量由25.74%減小到8.05%，β-轉(zhuǎn)角含量隨時(shí)間延長波動(dòng)。

總的來說，保壓時(shí)間的持續(xù)延長導(dǎo)致β-折疊和無規(guī)則卷曲的含量逐漸升高，α-螺旋含量逐漸降低，造成這種現(xiàn)象的原因是壓力的增長以及保壓時(shí)間的延長促進(jìn)肌原纖維蛋白的α-螺旋向β-折疊和無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)換[36]。α-螺旋是一種由分子中的氫鍵形成的有序結(jié)構(gòu)。在不同的煮制壓力下，隨著保壓時(shí)間的增加，α-螺旋的含量都有所下降，這說明加熱可以削弱保持α-螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵作用，從而對(duì)蛋白質(zhì)的去折疊起到了促進(jìn)作用；β-折疊結(jié)構(gòu)也是一種由分子間的氫鍵維持的有序排列，當(dāng)它被加熱后，它的含量會(huì)增加，這就意味著分子間的氫鍵作用會(huì)加強(qiáng)，從而導(dǎo)致它的聚集程度會(huì)變得更大[37]。此外，高壓煮制過程中β-折疊的含量呈先增加后減少的趨勢(shì)，而水的分子因高壓煮制的后期會(huì)隨著二級(jí)結(jié)構(gòu)的膨脹而遷移，疏水基團(tuán)與巰基的接觸為蛋白質(zhì)提供了更大的空間，蛋白質(zhì)在這個(gè)過程中逐漸發(fā)生團(tuán)聚，β-折疊結(jié)構(gòu)也開始解體，分子之間疏水作用也開始產(chǎn)生無規(guī)則卷曲[38]。

3 結(jié)論

隨著保壓時(shí)間的延長，羰基含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，常壓、微壓、高壓煮制羰基含量分別增加了1.22 倍、1.38 倍、1.19 倍，巰基含量呈下降趨勢(shì)，常壓、微壓、高壓煮制巰基含量分別減少了29.6%、29.8%、31.4%；隨著保壓時(shí)間的延長肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊含量和無規(guī)則卷曲含量增加，α-螺旋含量降低；對(duì)雞胸肉蛋白結(jié)構(gòu)的破壞程度為高壓＞微壓＞常壓。本研究結(jié)論明確了不同煮制壓力下蛋白質(zhì)氧化規(guī)律，下一步將蛋白氧化程度與雞肉的食用品質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析，為優(yōu)化煮制的方法和工藝參數(shù)提供參考依據(jù)。

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