摘 要 以阿蓬江（黔江段）為研究區(qū)域，通過對(duì)研究區(qū)域水體微生物的組成成分和群落特征的研究，為長江上游水環(huán)境保護(hù)和長江流域微生物群落特征和多樣性研究提供數(shù)據(jù)支持。結(jié)果表明：通過微生物16S片段高通量測序數(shù)據(jù)，可知阿蓬江（黔江段）水樣樣品中包含27門、46綱、98目、158科。在門水平分類上，以變形菌門占絕對(duì)優(yōu)勢，在綱分類上則是以γ-變形菌綱和放線菌綱為優(yōu)勢類群，在目分類上以伯克氏菌目為優(yōu)勢類群，在科分類上以伯克氏菌科占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢?；诟咄繙y序數(shù)據(jù)分析，干支流空間差異較為明顯。

關(guān)鍵詞 微生物； 群落特征；阿蓬江

中圖分類號(hào)：Q89 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.03.002

我國水體微生物研究主要集中在長江[1]、黃河[2]等主要河流地，以及鄱陽湖[3]等典型湖泊，對(duì)于支流等小型河流、湖泊及其他小型水域的微生物缺乏研究。河流生態(tài)系統(tǒng)中，浮游細(xì)菌是重要組成部分，在水體中浮游細(xì)菌數(shù)量龐大，代謝活動(dòng)強(qiáng)烈，是高級(jí)生物的主要食物，對(duì)水中污染物的降解和水循環(huán)過程有重要作用[4]。在水生態(tài)系統(tǒng)中，微生物對(duì)水體外的環(huán)境因子的變化十分敏感。近年來，眾多學(xué)者研究了浮游細(xì)菌與環(huán)境因子之間的相關(guān)性 [5]，但大都集中在海洋和湖泊[6]。河流作為一個(gè)動(dòng)態(tài)系統(tǒng)，它們的環(huán)境條件在時(shí)間和空間尺度上具有高度差異性[7]。相關(guān)研究[8]表明其在濕地、養(yǎng)殖廢水和深海沉積物等環(huán)境中優(yōu)勢類群均是變形菌門，且大多數(shù)在生物脫氮除磷和污染物降解過程中起重要作用的微生物也是變形菌門[9]。在綱水平上，β-變形菌綱占據(jù)的比例最大，達(dá)到了11.01%到31.50%不等，其大多數(shù)存在于河流和湖泊中（松花江[10]、海寧長山河[11]、東江[12]、Prealpine湖[13]等），對(duì)氮、磷等污染物的降解起到了重要的作用[14]。

本研究選擇阿蓬江（黔江段）為研究區(qū)域，對(duì)其水體中的微生物種類、多樣性和群落分布特征進(jìn)行分析，以期為觀察阿蓬江水污染狀況，為長江上游水環(huán)境保護(hù)和長江流域微生物群落特征和多樣性研究提供數(shù)據(jù)支持。

1" 材料與方法

1.1" 研究區(qū)概況及樣品采集

阿蓬江（黔江段）位于重慶市黔江區(qū)南部，全長約60 km。主要支流有太極河、細(xì)沙河、段溪河及黔江河等河流。于2019年在阿蓬江（黔江段）干支流中設(shè)定11個(gè)樣點(diǎn)并取樣，其中支流設(shè)有4個(gè)樣點(diǎn)，分別是QW1、QW7、QW9、QW11樣點(diǎn)，其余7個(gè)全是干流樣點(diǎn)。

1.2" 水體微生物群落結(jié)構(gòu)分析

1.2.1" 水體微生物總DNA提取

水樣通過0.22 μm的濾膜進(jìn)行抽濾，過濾好后的濾膜放置在無菌離心管中于-20 ℃保存，并使用15 kg干冰送測。

1.2.2" 水體微生物高通量DNA測序

用特定的DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取后，再用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。16S引物使用：341F（5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′） 和 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）以稀釋后的基因組 DNA 為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶 Barcode 的特異引物進(jìn)行PCR。 每一個(gè)25 μL的體系包括 1×PCR buffer、1.5 mM MgCl2、0.4 μM dNTPs、正向和反向引物各1.0 μM、0.5 U KOD-Plus-Neo 酶（TOYOBO） 和 10 ng 模板。 PCR程序包括起始 94 ℃ 1 min， 然后 30 循環(huán) （變性 94 ℃ 20 s，退火 54 ℃ 30 s 和 延伸 72 ℃ 30 s），最后 72 ℃ 5 min。 每個(gè)樣本進(jìn)行3個(gè)PCR技術(shù)重復(fù)。PCR 與 1/6 體積的 6×loading buffer 混合，用 2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。取目的條帶用來回收，回收使用 QIAquick Gel Extraction Kit （QIAGEN）。用Qubit@ 2.0 Fluorometer （Thermo Scientific）定量。最后等摩爾量混合。建庫使用 TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過定量和文庫檢測合格后，使用羅寧生物的Miseq平臺(tái)PE300模式測序。測序工作在上海羅寧生物有限公司進(jìn)行。

1.3" 數(shù)據(jù)分析與處理

高通量測序產(chǎn)出的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA軟件進(jìn)行堿基識(shí)別后轉(zhuǎn)化為原始的測序序列，稱為Raw Data或Raw Reads，結(jié)果以Fastq格式儲(chǔ)存。對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)控，得到高質(zhì)量序列，質(zhì)控后得到的序列稱為Clean Tag。使用UCHIME7算法去除嵌合體，得到Effective Tag。為了方便研究樣本的物種組成及多樣性信息，對(duì)序列進(jìn)行聚類產(chǎn)生操作時(shí)的分類單元，即OTU（Operational Taxonomic Units）。在97%的相似水平下進(jìn)行OTU聚類分析， 每個(gè)OTU代表的是一類相似序列的集合，通過OTU聚類分析，得到OTU豐度表，此豐度表是后續(xù)分析的基礎(chǔ)文件。為防止測序深度對(duì)后續(xù)多樣性分析產(chǎn)生影響，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行重抽樣，使得各樣本保持一致的序列數(shù)。用Circos網(wǎng)站在線繪圖功能（http：//circos.ca/）對(duì)阿蓬江水體微生物種群門、綱、目、科水平的相對(duì)豐度變化情況進(jìn)行可視化表達(dá)。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 阿蓬江干支流水體微生物組成成分

在阿蓬江（黔江段）區(qū)域所取樣的11個(gè)樣點(diǎn)所得的所有細(xì)菌16 SrDNA片段中，將得到的序列按門、綱、目、科分類，可以知道研究區(qū)域所取樣的11個(gè)樣點(diǎn)共有27門、46綱、98目、158科。

2.2" 阿蓬江干支流水體微生物群落多樣性

通過采用α多樣性分析，對(duì)阿蓬江干支流水體微生物群落多樣性進(jìn)行表征，包括物種豐富度指數(shù)（Chao 1）、Shannon多樣性指數(shù)（H’）和Simpson多樣性指數(shù)（D）（見表1）。對(duì)阿蓬江干支流水體樣品測序后，獲得97%相似水平及以上的OTUs分別有約360個(gè)和337個(gè)，且對(duì)微生物群落覆蓋率達(dá)到99%，OTU值干流明顯大于支流。Chao 1豐富度指數(shù)表現(xiàn)為干流水體大于支流水體，干支流微生物群落OTU值均低于Chao 1豐富度指數(shù)， Shannon和Simpson指數(shù)也均表現(xiàn)為干流水體大于支流水體?？傮w而言，阿蓬江水體微生物的群落豐富度和多樣性均表現(xiàn)為干流大于支流。

2.3" 門水平上的微生物群落分布特征

通過高通量測序分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群落在門水平上有27個(gè)細(xì)菌門，其中主要為變形菌門、放線菌門和擬桿菌門等細(xì)菌門，而在這些細(xì)菌門中占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢的是變形菌門，說明阿蓬江（黔江段）是以浮游細(xì)菌組成的典型的淡水水體，符合我國典型的淡水水體微生物組成的群落特征。

從表2可知，在干流中的優(yōu)勢細(xì)菌門是放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、浮霉菌門和裝甲菌門，支流中的優(yōu)勢細(xì)菌門則是變形菌門、疣微菌門、異常球菌門、芽單胞菌門和奇古菌門，從標(biāo)準(zhǔn)偏差來看，放線菌門、擬桿菌門和異常球菌門在干支流的優(yōu)劣勢并不明顯，擬桿菌門和厚壁菌門雖然在占比上是干流優(yōu)于支流，但是其干流的標(biāo)準(zhǔn)偏差是遠(yuǎn)大于支流的，相反的是，異常球菌門在占比上是支流優(yōu)于干流，其標(biāo)準(zhǔn)偏差是支流略大于干流，由此可看出細(xì)菌群落在空間的分布上是有一定的空間差異，但其波動(dòng)幅度不大。

2.4" 綱水平上的微生物群落結(jié)構(gòu)分析

通過高通量測序分析，在綱水平上一共發(fā)現(xiàn)46個(gè)細(xì)菌綱。 從表3的干支流占比分析來看，干流中的優(yōu)勢細(xì)菌綱有放線菌綱和α-變形菌綱，在支流中占據(jù)優(yōu)勢的細(xì)菌綱是γ-變形菌綱和擬桿菌綱。從標(biāo)準(zhǔn)差來看，首先γ-變形菌綱在支流中的標(biāo)準(zhǔn)差是要小于干流，其次是放線菌綱、擬桿菌綱和α-變形菌綱，其標(biāo)準(zhǔn)差均是干流大于支流，最后是疣微菌綱和Acidimicrobiia，這兩大細(xì)菌綱在干支流中的標(biāo)準(zhǔn)差相距太大，疣微菌綱在支流中的標(biāo)準(zhǔn)差是干流中的4倍，Acidimicrobiia在干流的標(biāo)準(zhǔn)差是支流的3倍，所以這兩大細(xì)菌綱在干支流中的空間分布有一定的波動(dòng)幅度。

2.5" 目水平上的微生物群落結(jié)構(gòu)分析

目水平上，一共發(fā)現(xiàn)98個(gè)細(xì)菌目，如表4所示，最優(yōu)勢的細(xì)菌目是伯克氏菌目，從干支流占比對(duì)比分析，伯克氏菌目在支流中的比例大于干流中所占比例，法蘭克氏菌目干流中所占比例大于支流，從兩者標(biāo)準(zhǔn)差來看，干支流中的空間分布沒有明顯差異。擬桿菌目和鞘脂單胞菌目在干流中的占比略優(yōu)于支流，而其在干流中的空間分布波動(dòng)相比于支流是比較大的，而剩下的假單胞菌目、噬幾丁質(zhì)菌目、熱纖梭菌目等細(xì)菌目的相對(duì)比例差距不大，空間波動(dòng)幅度不明顯。

2.6" 科水平上的微生物群落結(jié)構(gòu)分析

科水平上，細(xì)菌科較多，所有樣品中一共有158個(gè)細(xì)菌科，如表5所示，最優(yōu)勢的細(xì)菌科是伯克氏菌科。從干支流的占比來看，支流中占比較大的是伯克氏菌科，而在干流中所占比例較大的是魚孢菌科。從標(biāo)準(zhǔn)差的對(duì)比來看，伯克氏菌科和鞘脂單胞菌科在干流中的空間波動(dòng)幅度遠(yuǎn)大于支流，魚孢菌科、紅桿菌科和假單胞菌科在干支流中的空間分布沒有明顯差異，而未列出的細(xì)菌科占據(jù)比例較大，在空間分布上也沒有明顯差異。

3" 討論與結(jié)論

3.1" 討論

利用Illumina測序技術(shù)的16S擴(kuò)增子測序，檢測了阿蓬江（黔江段）水體微生物群落的組成成分，發(fā)現(xiàn)所取樣的11個(gè)樣點(diǎn)共有27門、46綱、98目、158科。在門分類水平上，變形菌門是11個(gè)樣品中最優(yōu)勢細(xì)菌門，如吳曉冰等[15]在研究長江干流浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中變形菌門（7.49%～85.63%）和張旭[16]在研究海寧市不同類型區(qū)域河流底泥微生物群落結(jié)構(gòu)特征研究時(shí)，其中變形菌門為細(xì)菌門中最優(yōu)勢類群，均符合典型的淡水水體微生物的組成特征。變形菌門在研究區(qū)域呈現(xiàn)出支流含量高、干流含量低的特征，變形菌門在所有樣點(diǎn)中都是絕對(duì)優(yōu)勢類群，說明變形菌門相比其他細(xì)菌更具有適應(yīng)性；放線菌門和擬桿菌門作為次優(yōu)勢類群，在研究區(qū)域呈現(xiàn)出干流含量高、支流含量低的特征；而剩下的厚壁菌門、疣微菌門及浮霉菌門等細(xì)菌門的占比相對(duì)較低，在10%以下。在綱水平上，γ-變形菌綱是最優(yōu)勢類群，在研究區(qū)域呈現(xiàn)出支流含量高、干流含量低的特征；其次次優(yōu)勢類群是放線菌綱、擬桿菌綱及α-變形菌綱，在研究區(qū)域呈現(xiàn)出干流含量高、支流含量低的特征；其余的疣微菌綱、厚壁菌綱及β-變形菌綱等細(xì)菌綱的占比均不超過10%。γ-變形菌綱、放線菌綱、擬桿菌綱及α-變形菌綱在研究區(qū)域是優(yōu)勢類群，這與我國大多數(shù)淡水生態(tài)系統(tǒng)的調(diào)查結(jié)果是一樣的[17-19]。在目和科水平中伯克氏菌均處于優(yōu)勢地位，其干支流的占比差距明顯。初步分析伯克氏菌在支流上含量高的原因可能是支流采樣點(diǎn)都是河流，其周圍城鎮(zhèn)發(fā)展迅速，其發(fā)展產(chǎn)生的各種污水導(dǎo)致水體污染加劇，其水體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)增多，細(xì)菌含量增高。

3.2" 結(jié)論

1）通過微生物16S片段高通量測序分析，阿蓬江（黔江段）所取得的11樣品在界的水平上總共發(fā)現(xiàn)27門、46綱、98目、158科。

2）阿蓬江水體微生物的群落豐富度和多樣性均表現(xiàn)為干流大于支流。

3）在門水平分類上，以變形菌門為絕對(duì)優(yōu)勢類群，在綱水平分類上則是以γ-變形菌綱和放線菌綱為優(yōu)勢類群，在目分類上以伯克氏菌目為優(yōu)勢類群，在科分類上以伯克氏菌科占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢。

4）基于高通量測序數(shù)據(jù)分析，干支流空間差異較為明顯，在門水平上，擬桿菌門和厚壁菌門在干流中的空間分布波動(dòng)幅度較大，疣微菌門和芽單胞菌門在支流中的空間分布有較大差異。綱水平上，疣微菌綱在支流的標(biāo)準(zhǔn)差是干流的4倍，Acidimicrobiia在干流的標(biāo)準(zhǔn)差是支流的3倍，所以這兩大細(xì)菌綱在干支流中的空間分布有一定的差異。在目分類上，細(xì)菌目的空間分布有一定的差異，但熱纖梭菌目、Microtrichales和Selenomonadales在分布上差異較大。在科分類上，細(xì)菌科的空間分布沒有明顯的差異，其中的鞘脂單胞菌科、Ilumatobacteraceae和氨基酸球菌科的空間分布有些波動(dòng)。

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（責(zé)任編輯：敬廷桃）

收稿日期：2023-07-31

作者簡介：許田甜（1983—），本科，工程師，主要研究方向?yàn)樯鷳B(tài)學(xué)、測繪測量。E-mail：29462830@qq.com。

*為通信作者，E-mail：7426997@qq.com。