李光鑫 高強 尤明濤 孫衛(wèi)玲 沈宏 祁得林 楊希

摘? 要：為探究抗生素對藻類的毒性效應(yīng)與機制，以放線菌酮（cycloheximide，CHX）為潛在污染物，以小球藻為受脅迫對象，通過檢測小球藻細胞密度、葉綠素a（chlorophyll a）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（optimal/maximal quantum yield of PSⅡ，F(xiàn)v/Fm）等生長及生理生化指標，探究抗生素對藻類的毒性效應(yīng).研究結(jié)果表明CHX對于小球藻的96 h EC50為1.229 mg/L.在該質(zhì)量濃度下作用96 h后，CHX對小球藻細胞密度的抑制率為49.7%，使葉綠素a的含量降低了36.2%，對Fv/Fm的抑制率為13.0%.此外，與對照相比，CHX暴露使小球藻的ROS和MDA分別上升了533.7%和618.6%.因此，CHX對小球藻的毒性效應(yīng)主要體現(xiàn)為生長抑制，其可能的機制是引起氧化應(yīng)激（如產(chǎn)生ROS和MDA），進而抑制細胞的光合作用（降低Fv/Fm）.

關(guān)鍵詞：放線菌酮；小球藻；毒性效應(yīng)；Fv/Fm

中圖分類號：Q178.1????? 文獻標志碼：A文章編號：1000-2367（2024）03-0043-07

抗生素（antibiotics）是現(xiàn)代醫(yī)療的重要藥物，是通過與細菌靶標的特異性作用來抑制或殺死細菌的有機分子［1］.中國是抗生素的生產(chǎn)和使用大國，每年的使用量高達21萬t，其中約18萬t被用于農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域，出口約3萬t［2］.美國每年使用的2.27萬t抗生素中50%被用于人類疾病治療，另外50%被用于畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)［3］.在2000至2015年間，全球抗生素消費量就已經(jīng)增加了65%，據(jù)推測2030年全球抗生素消費量將比2015年高出200%［4］.然而，研究表明抗生素在人畜體內(nèi)不能被完全吸收，約有30%～90%以尿液、糞便的形式排出體外［5-6］；同時，大多數(shù)抗生素具有良好的水溶性，容易通過地表水進入湖泊、河流等水環(huán)境中［7］.抗生素結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在水體中很難被生物降解，從而導(dǎo)致其在水體中呈“假持久性”，隨時間積蓄從而加劇其對于水生態(tài)系統(tǒng)的污染［8］.因此，研究抗生素對水生生物的毒性效應(yīng)具有重要意義.放線菌酮（cycloheximide，CHX）又叫環(huán)己亞胺，是從鏈霉菌（Streptomyces griseus）中提取出的.放線菌酮可以作用于80 s核糖體，對真核生物的信使RNA翻譯合成過程起到抑制作用，而對已經(jīng)合成的蛋白質(zhì)無影響［9］.因此，放線菌酮通常不用于醫(yī)療目的，常用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，可以加快葉柄自然脫落從而便于果實采摘［10］，也可以用于防止植物的褐化［11-12］.隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，放線菌酮不可避免地隨著灌溉和降雨等過程進入水生態(tài)系統(tǒng)，對水生態(tài)系統(tǒng)具有潛在的威脅.

作為水生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)者，藻類對污染物的響應(yīng)敏感，是毒理學(xué)研究中常用的受試生物［13］.小球藻

收稿日期：2023-04-07;修回日期：2023-05-06.

基金項目：國家自然科學(xué)基金（51879001）.

作者簡介：李光鑫（1996-），男，山東臨沂人，青海大學(xué)碩士研究生，研究方向為微生物生態(tài)學(xué)，E-mail：liguangxinlgx@foxmail.com.

通信作者：楊希，E-mail：yangxi1405@foxmail.com.

引用本文：李光鑫，高強，尤明濤，等.放線菌酮對小球藻的毒性效應(yīng)及其機制研究［J］.河南師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2024，52（3）：43-49.（Li Guangxin，Gao Qiang，You Mingtao，et al.The research of toxic effects and mechanisms of cycloheximide on Chlorella sp.［J］.Journal of Henan Normal University（Natural Science Edition），2024，52（3）：43-49.DOI：10.16366/j.cnki.1000-2367.2023.04.07.0001.）

是由貝耶林克首次分離到的一種綠色微藻［14］.小球藻自被發(fā)現(xiàn)以來由于其生長周期短、易培養(yǎng)等特點［15］，常用于毒理學(xué)研究［16］.本文選取放線菌酮作為潛在污染物，以小球藻作為受試對象，探究放線菌酮毒性效應(yīng)，為評估其對水環(huán)境中水生生物毒性風(fēng)險提供科學(xué)依據(jù).

1? 材料與方法

1.1? 實驗材料

本實驗所用的藻種小球藻（Chlorella sp. FACHB-9）來自中國科學(xué)院水生生物研究所藻種庫，所用培養(yǎng)基為BG-11［17］.實驗所用標準品CHX購買自上海安譜實驗科技股份有限公司.

1.2? 實驗方法

CHX半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）的確定：參照YOU等［18］的方法將CHX母液加入BG-11培養(yǎng)基中與小球藻進行共培養(yǎng).CHX的質(zhì)量濃度梯度設(shè)置為0.00、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、5.00 mg/L.藻種初始濃度設(shè)為105～106 mL-1，每組3個平行，光照強度2 500 lx，光暗時間比12 h∶12 h.培養(yǎng)96 h后取1 mL藻液通過流式細胞儀進行計數(shù).

實驗設(shè)計：預(yù)先配制CHX母液（100 mg/L），以EC50質(zhì)量濃度添加至1 L BG-11培養(yǎng)基中，同時將處在對數(shù)生長期的小球藻按照初始濃度1×106 mL-1 接種至相同體系中.在光照強度為2 500 lx，光照周期比為12 h∶12 h條件下按照藻類抑制標準方法連續(xù)培養(yǎng)96 h［19］.對照組和對照組各設(shè)置3個平行.實驗開始后每8 h搖瓶1次，每隔24 h檢測藻細胞數(shù)、葉綠素a、PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（maximal photochemical efficiency，F(xiàn)v/Fm）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）與丙二醛（malondialdehyde，MDA）.

藻細胞數(shù)測定：本實驗采用流式細胞儀（CytoFLEX LX，China）進行藻細胞計數(shù)，流式細胞儀在使用前需要運行開機流程，按照提示在上樣器中放入含有去離子水的流式管.待運行完開機流程后設(shè)置流式細胞儀工程文件.流式細胞儀的工程文件共需設(shè)置兩個點圖和一個直方圖.第1個點圖X軸設(shè)置為FSC-A，Y軸設(shè)置SSC-A.第2個點圖X軸設(shè)置為PC690-5.5A，Y軸設(shè)置PC690-5.5H.直方圖X軸設(shè)置為PC690-5.5A，Y軸設(shè)置為Count.取1 mL稀釋好的藻樣過濾加入流式管中，將流式管置于流式細胞儀的上樣器，流速設(shè)為低速（10 μL/min），設(shè)置進樣體積為10 μL，待進樣結(jié)果穩(wěn)定后進行記錄，結(jié)果直接在流式細胞儀上讀出，使用完畢后按照提示對流式細胞儀進行清洗.藻數(shù)計算公式為：藻細胞數(shù)=細胞儀上顯示的活體微藻數(shù)/（體積×1 000×稀釋倍數(shù)）.

葉綠素a含量測定：取5 mL藻樣，8 000 r/min離心10 min加入體積分數(shù)95%乙醇重懸，4 ℃避光24 h后8 000 r/min離心10 min，取上清測定A663與A645，A為吸光度.用公式C葉綠素a/（mg·L-1）=12.7A663-2.69A645計算［20］.

PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量測定：采用文獻［21］方法，測定使用的葉綠素?zé)晒鈨x（PHYTO-Ⅱ-D，Germany）在室溫下進行，取2 mL藻樣暗適應(yīng)30 min后，測定其Fv/Fm值.

ROS與MDA測定：采用WANG等［22］所用的化學(xué)熒光法測定ROS水平.用DCFH-DA（2，7-dichlorofuorescin diacetate）活性氧探針進行標記，通過多功能酶標儀測定485 nm吸光值.MDA采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定［23］.

1.3? 數(shù)據(jù)處理

本實驗結(jié)果均為平均值±標準差表示，使用SPSS 25.0軟件進行單因素方差分析（one way ANOVA）事后多重比較采用Bonferroni檢驗，使用GraphPad 8軟件進行繪圖和線性回歸分析，置信水平為0.95，“*”代表P＜0.05差異輕微顯著，“**”代表P＜0.01為差異顯著，“***”代表P＜0.001為差異極顯著.

2? 結(jié)果

2.1? 流式細胞儀測定結(jié)果

如圖1所示，該結(jié)果為放線菌酮處理下96 h小球藻細胞數(shù)流式細胞儀計數(shù)結(jié)果，如圖1（a）所示通過FSC-A，SSC-A兩束激光篩選細胞門類同時可以去除細胞碎片，非熒光顆粒和非藻類顆粒.P1表示生長狀態(tài)良好的細胞.可以看出生長狀態(tài)良好的細胞占總藻細胞數(shù)的91.73%.如圖1（b）所示篩選完畢的藻細胞通過激光通道B690PC5.5A去除集群的小球藻細胞.P2表示非黏連的細胞，P2占P1的99.47%.如圖1（c）所示去黏連完成的細胞通過激光通道B690-PC5.5A進行藻細胞的定量計數(shù)，P3為篩選完成的藻細胞數(shù)所占P2的比例.

2.2? CHX對小球藻存活率和細胞密度的影響

圖2（a）為小球藻96 h存活曲線，可以看出CHX質(zhì)量濃度越高小球藻存活率越低，這表明放線菌酮對小球藻存在劑量-毒性效應(yīng)，通過Graphpad 8計算得出CHX對小球藻的96 h EC50為1.229 mg/L.EC50質(zhì)量濃度是毒理學(xué)常用的劑量濃度，因此本實驗選擇1.229 mg/L作為后續(xù)實驗的CHX質(zhì)量濃度.圖2（b）為放線菌酮對小球藻細胞密度的影響，暴露組在24、48、72、96 h的藻細胞密度均低于對照組（P＜0.001），表明小球藻的生長受到了放線菌酮的持續(xù)抑制，抑制率分別為44.2%、54.3%和49.7%.

2.3? CHX對小球藻葉綠素a的影響

小球藻培養(yǎng)24、48、72、96 h后測得的小球藻培養(yǎng)物葉綠素a質(zhì)量濃度如圖3（a）所示.培養(yǎng)24～48 h后，處理組和對照組的葉綠素a質(zhì)量濃度沒有顯著差異（P＞0.05）；培養(yǎng)72 h后，處理組的葉綠素a質(zhì)量濃度顯著低于對照組（P＜0.05），此時放線菌酮對葉綠素a的抑制率為29.5%.CHX暴露96 h后，處理組的葉綠素a極顯著低于對照組（P＜0.001），抑制率為36.2%.實驗結(jié)果表明，放線菌酮對小球藻的生長（以葉綠素a質(zhì)量濃度表示）具有時間毒性效應(yīng).圖3（b）顯示，在CHX暴露條件下，小球藻細胞密度和葉綠素a質(zhì)量濃度之間具有極顯著的正向線性關(guān)系（P＜0.001），表明細胞密度和葉綠素a都可以作為小球藻的生物量指標，而且CHX暴露情況下葉綠素a的降低是由于細胞密度降低引起的.

2.4? CHX對Fv/Fm的影響

小球藻培養(yǎng)24、48、72、96 h后測得的Fv/Fm如圖4所示.培養(yǎng)24 h后處理組的Fv/Fm顯著低于對照組（P＜0.01），48 h和96 h處理后極顯著低于對照組（P＜0.001），這表明CHX抑制了小球藻的光合作用.與對照相比，CHX暴露24、48、72、96 h后小球藻Fv/Fm的抑制率分別為7.4%、8.1%、10.9%和13.0%，抑制率隨著暴露時間延長而升高.

2.5? CHX對ROS的影響

小球藻培養(yǎng)24、48、72、96 h后測得的ROS如圖5所示.在24、48、72 h處理組ROS極顯著高于對照組（P＜0.001）.這表明CHX可以刺激小球藻產(chǎn)生ROS.在96 h處理組ROS顯著高于對照組（P＜0.01），說明在96 h時CHX對小球藻ROS的刺激有所降低.但在整個實驗期間CHX可以持續(xù)刺激小球藻產(chǎn)生ROS.

2.6? CHX對MDA的影響

小球藻培養(yǎng)24、48、72、96 h后測得的MDA如圖6所示.在24 h CHX組顯著高于對照組的MDA含量（P＜0.01），在48、72 h處理組MDA極顯著高于對照組（P＜0.001），暴露96 h后，處理組的MDA含量顯著高于對照組（P＜0.01）.綜上所述，在試驗期間CHX可以刺激小球藻產(chǎn)生MDA.

3? 討? 論

根據(jù)生長速率常數(shù)，小球藻生長周期可分為4個階段，分別是延滯期、對數(shù)生長期、平穩(wěn)期和衰退期［24］.本實驗根據(jù)生長速率常數(shù)將實驗階段選在了延滯期和對數(shù)生長期.結(jié)果表明放線菌酮可抑制小球藻生長.藻類通過吸收水體中的營養(yǎng)鹽和光能為整個生態(tài)系統(tǒng)提供能量，葉綠素a可以衡量這一過程［25］.研究表明，放線菌酮抑制了葉綠體基因的表達，阻礙了葉綠體的合成［26］.放線菌酮可通過干擾生物合成易位阻斷真核生物翻譯進程，但對已經(jīng)合成的蛋白質(zhì)無作用［27］.本研究發(fā)現(xiàn)，24、48 h對照組藻細胞數(shù)增長緩慢，說明放線菌酮組小球藻本身存在的葉綠體并未被破壞，因此放線菌酮組葉綠素a和對照組葉綠素a沒有差異（P＞0.05）.而在72、96 h，對照組藻數(shù)增長迅速，說明放線菌酮破壞葉綠體基因的表達，導(dǎo)致72、96 h處理組小球藻葉綠素a含量低于對照組.處理組小球藻生物量和葉綠素a具有極顯著的正相關(guān)線性關(guān)系（P＜0.001）.說明葉綠素a含量的降低是由于小球藻生物量下降引起的，即CHX對小球藻的葉綠素a的抑制是由于細胞數(shù)下降引起的，并非抑制其合成.

本研究中發(fā)現(xiàn)放線菌酮可抑制小球藻的PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，且隨著暴露時間增強.表明放線菌酮可能破壞了小球藻的光合系統(tǒng)，降低了PSⅡ的供體和受體，導(dǎo)致小球藻PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量下降，與放線菌酮可降低高等植物PSⅡ的供體和受體、反應(yīng)中心密度、PSⅡ中的量子產(chǎn)生和電子傳輸?shù)陌l(fā)現(xiàn)一致［28-29］.

活性氧廣泛存在于藻組織中，傳統(tǒng)觀點認為活性氧主要由藻細胞線綠體和葉綠體代謝產(chǎn)生，活性氧可以作為信號分子引起超敏反應(yīng)，活性氧的存在對生物體有利，但在藻細胞內(nèi)過多產(chǎn)生會引起DNA的損傷［30］.研究表明替加環(huán)素對蛋白核小球藻活性氧的產(chǎn)生具有促進作用［31］.本研究發(fā)現(xiàn)放線菌酮同樣對小球藻的活性氧產(chǎn)生具有促進作用，這表明小球藻抗氧化物酶無法消除藻內(nèi)過量的活性氧，導(dǎo)致活性氧升高.有研究表明，當(dāng)小球藻受到環(huán)境的刺激時會產(chǎn)生大量自由基，包括超氧化物自由基（-O2-）、羥基自由基（-OH）和過氧化氫（H2O2），為了清除這些自由基，小球藻抗氧化系統(tǒng)會分泌酶系和非酶系抗氧化劑.這些自由基在植物體內(nèi)累積會攻擊細胞膜產(chǎn)生丙二醛，過量的丙二醛與細胞膜結(jié)合會加劇膜的損傷，因此丙二醛可用來評價細胞損傷［32］.本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果相同，說明小球藻受到放線菌酮的脅迫后活性氧與細胞內(nèi)脂質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生了大量丙二醛.

綜上所述，放線菌酮可通過抑制小球藻細胞數(shù)增長導(dǎo)致葉綠素a含量下降，此外還可降低PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，同時刺激小球藻產(chǎn)生ROS，并提高MDA含量，導(dǎo)致小球藻細胞出現(xiàn)氧化損傷和脂質(zhì)過氧化.

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The research of toxic effects and mechanisms of cycloheximide on Chlorella sp.

Li Guangxin1， Gao Qiang1， You Mingtao2， Sun Weiling2， Shen Hong3， Qi Delin1， Yang Xi1

（1. College of EcoEnvironmental Engineering; State Key Laboratory of Plateau Ecology and Agriculture， Qinghai University， Xining 810016，

China; 2. College of Environmental Sciences and Engineering; State Environmental Protection Key Laboratory of All Material

Fluxes in River Ecosystems， Peking University， Beijing 100871， China; 3. State Key Laboratory of Fresh Water Ecology

and Biotechnology; Institute of Hydrobiology， Chinese Academy of Sciences， Wuhan 430072， China）

Abstract： To explore the toxic effect and mechanism of antibiotics on algae. cycloheximide（CHX） as a potential contaminant was used on Chlorella sp.. The amount of biomass， chlorophyll a， reactive oxygen species（ROS）， malondialdehyde（MDA） and Optimal/maximal quantum yield of PSⅡ（Fv/Fm） were chosen as biochemical and physiological parameters. The results of the study showed that the EC50 of 96 h is 1.229 mg/L for Chlorella sp. under CHX. After 96 h of exposure to this concentration， the inhibition rate of CHX on algal biomass was 49.7%， the inhibition rate of CHX on chlorophyll a was 36.2% and the inhibition rate of CHX on Fv/Fm was 13.0%. In addition， the CHX could stimulate the production of ROS and MDA of Chlorella sp.：the promotion rate of ROS and MDA were 533.7% and 618.6% respectively. Therefore， the toxic effect of CHX on Chlorella sp. mainly acts on growth inhibition， its possible mechanism is to cause oxidative stress（such as the production of ROS and MDA）， furthermore， it inhibits photosynthesis（reduces Fv/Fm）.

Keywords： cycloheximide; Chlorella sp.; toxicity effect; Fv/Fm

［責(zé)任編校? 劉洋? 楊浦］