胡孝鵬 紀曉 陳喜 龔芳 劉娟

摘要?目的：探討花青素對自身免疫性心肌炎（AE）大鼠T細胞17/調(diào)節(jié)性T細胞（Th17/Treg）平衡及Janus激酶2/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（JAK2/STAT3）信號通路的影響。方法：將60只SD大鼠分為對照（NC）組、模型（Model）組、花青素組（50 mg/kg花青素）、STAT3激活劑Colivelin組（1 mg/kg Colivelin）、花青素＋Colivelin組（50 mg/kg花青素＋1 mg/kg Colivelin），每組12只。采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測血清炎性因子水平；蘇木素-伊紅（HE）染色檢測心肌病理變化；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）染色檢測心肌細胞凋亡；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）檢測脾臟維甲酸相關(guān)孤兒受體γt（RORγt）、叉頭蛋白p3（Foxp3）mRNA表達情況；蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）檢測心肌JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白表達。結(jié)果：Model組心肌明顯壞死和水腫，大量炎性細胞浸潤；花青素組心肌無明顯的壞死和細胞腫脹；Colivelin組心肌損傷加重；與花青素組相比，花青素＋Colivelin組大鼠炎性細胞浸潤現(xiàn)象增加。與NC組相比，Model組白細胞介素（IL）-17、IL-23水平、RORγt mRNA水平、Th17細胞水平、Th17/Treg比例、心肌細胞凋亡率及磷酸化STAT3（p-STAT3）/STAT3、磷酸化JAK2（p-JAK2）/JAK2比例明顯升高（P＜0.05），IL-10、IL-4水平、Treg細胞水平、Foxp3 mRNA水平明顯下降（P＜0.05）；與Model組比較，花青素組IL-17、IL-23水平、RORγt mRNA水平、Th17細胞水平、Th17/Treg比例、心肌細胞凋亡率以及p-STAT3/STAT3、p-JAK2/JAK2比例明顯下降（P＜0.05），IL-10、IL-4水平、Treg細胞水平、Foxp3 mRNA水平明顯升高（P＜0.05）；Colivelin組對應指標呈相反趨勢（P＜0.05）；與花青素組相比，花青素＋Colivelin組IL-17、IL-23水平、RORγt mRNA水平、Th17細胞水平、Th17/Treg比例、心肌細胞凋亡率及p-STAT3/STAT3、p-JAK2/JAK2比例明顯升高（P＜0.05），IL-10、IL-4水平、Treg細胞水平、脾臟Foxp3 mRNA水平明顯下降（P＜0.05）。結(jié)論：花青素可能通過抑制JAK2/STAT3通路，恢復Th17/Treg平衡，實現(xiàn)對AE大鼠心肌的保護作用。

關(guān)鍵詞?自身免疫性心肌炎；花青素；Janus激酶2/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3信號通路；T細胞17/調(diào)節(jié)性T細胞平衡；炎癥反應；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.07.012

Influence of Anthocyanins on Th17/Treg Balance in Autoimmune Myocarditis Rats by Regulating JAK2/STAT3 Signaling Pathway

HU Xiaopeng， JI Xiao， CHEN Xi， GONG Fang， LIU Juan

Huangshi Fifth Hospital， Huangshi 435000， Hubei， China

Corresponding Author?LIU Juan， E-mail： liujuan1980@sina.com

Abstract?Objective：To investigate the influences of anthocyanins on T helper-17 cells（Thl7）/regulatory T cell（Treg） balance and Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3（JAK2/STAT3） signaling pathway in autoimmune myocarditis（AE） rats.Methods：Sixty SD rats were randomly grouped into control（NC） group，Model group，anthocyanin group（50 mg/kg anthocyanin），STAT3 activator Colivelin group（1 mg/kg Colivelin），anthocyanin＋Colivelin group（50 mg/kg anthocyanin＋1 mg/kg Colivelin），with 12 rats in each group.Enzyme linked immunosorbent assay（ELISA） was used to detect the level of serum inflammatory factor.Hematoxylin-eosin（HE） staining was applied to detect myocardial pathological changes.Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End Labeling（TUNEL） staining was applied to detect cardiomyocyte apoptosis.Real-time quantitative polymerasechain reaction（RT-qPCR） was applied to detect the expression of retinoid-related orphan receptorγt（RORγt） and fork-head box protein（Foxp3） mRNA in spleen.Western Blot was used to detect the expression of JAK2/STAT3 pathway related proteins in the myocardium.Results： In the Model group，myocardial necrosis and edema were obvious，and a large number of inflammatory cells were infiltrated;the myocardium in the anthocyanin group showed no evident necrosis or cell swelling;the myocardial injury was aggravated in the Colivelin group; inflammatory cell infiltration increased in the anthocyanin＋Colivelin group.Compared with NC group，the levels of interleukin（IL）-17，IL-23，RORyt mRNA，Th17 cells，ratio of Th17/Treg，cardiomyocyte apoptosis rate，and ratios of p-STAT3/STAT3 and p-JAK2/JAK2 in Model group were greatly increased（P＜0.05），the levels of IL-10，IL-4，Treg cells and FoxP3 mRNA were greatly decreased（P＜0.05）.Compared with the Model group，the levels of IL-17，IL-23，RORγt mRNA，Th17 cells，ratio of Th17/Treg，cardiomyocyte apoptosis rate，and ratios of p-STAT3/STAT3 and p-JAK2/JAK2 in anthocyanin group ?decreased（P＜0.05），the levels of IL-10，IL-4，Treg cells and Foxp3 mRNA increased（P＜0.05）;the corresponding indicators in the Colivelin group showed the opposite trends（P＜0.05）.Compared with anthocyanin group，the levels of IL-17，IL-23，RORγt mRNA，Th17 cells，ratio of Th17/Treg，cardiomyocyte apoptosis rate，and ratios of p-STAT3/STAT3 and p-JAK2/JAK2 in anthocyanin＋Colivelin group increased（P＜0.05），the levels of IL-10，IL-4，Treg cells and Foxp3 mRNA decreased （P＜0.05）.Conclusion：Anthocyanins may restore the balance of Th17/Treg by inhibiting the JAK2/STAT3 pathway and achieve the protective effect on the myocardium of AE rats.

Keywords?autoimmune myocarditis; anthocyanins; Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3 signaling pathway; ?T helper-17 cells/regulatory T cell balance; inflammatory response; experimental study

基金項目?湖北省科技廳項目（No.2016CFB344）

作者單位?1.黃石市第五醫(yī)院（湖北黃石 435000）；2.湖北文理學院附屬醫(yī)院，襄陽市中心醫(yī)院（湖北襄陽 441021）

通訊作者?劉娟，E-mail：liujuan1980@sina.com

引用信息?胡孝鵬，紀曉，陳喜，等.花青素調(diào)節(jié)JAK2/STAT3信號通路對自身免疫性心肌炎大鼠Th17/Treg平衡的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（7）：1234-1239.

心肌炎是一種炎癥性心臟疾病，主要由病毒或細菌感染和自身免疫性疾病引起［1-2］。自身免疫性心肌炎（autoimmune myocarditis，AE）會導致心臟組織重塑、纖維化和功能喪失，發(fā)展為擴張型心肌病，危及生命［3］。因此，避免心肌炎發(fā)展為擴張型心肌病是臨床急需解決的問題之一。研究發(fā)現(xiàn)，T細胞17/調(diào)節(jié)性T細胞（Th17/Treg）平衡與AE的發(fā)病機制密切相關(guān)，調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡可改善實驗性AE［4］。花青素是類黃酮的重要亞科，具有抗菌、抗氧化、抗炎和抗突變的特性，常用于代謝紊亂、癌癥、眼部疾病和心血管疾病等多種慢性疾病的預防和治療［5］。研究發(fā)現(xiàn)，原花青素可改善病毒性心肌炎大鼠心肌損傷［6］，然而機制不明確。而關(guān)于花青素對AE大鼠Th17/Treg平衡的影響報道較少。因此，本研究主要探究花青素對AE大鼠Th17/Treg平衡的影響及其作用機制。

1?材料與方法

1.1?實驗動物

60只無特定病原體（SPF）級8周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量280～300 g，購自廣州銳格生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2021-0059。本研究已獲得醫(yī)院動物倫理委員會的批準。

1.2?主要試劑與儀器

花青素（貨號：abs42015971）購自愛必信（上海）生物科技有限公司；信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）激活劑Colivelin（貨號：HY-P1061）購自美國MCE公司；白細胞介素（interleukin，IL）-10（貨號：CSB-E07454r-1）、IL-17 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒（貨號：CSB-E07451r-1）購自上海恒斐生物科技有限公司；IL-4（貨號：FY-A014252）、IL-23 ELISA試劑盒（貨號：FY-A014430）購自上海富雨生物科技有限公司；STAT3（貨號：ab68153）、磷酸化STAT3（p-STAT3，貨號：ab267373）、Janus激酶2（JAK2，貨號：ab108596）、磷酸化JAK2（p-JAK2，貨號：ab32101）、 甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）兔多克隆抗體（貨號：ab9485）、IL-17-PE抗體（貨號：ab108596）、CD4-APC（貨號：ab252152）均購自英國Abcam公司；叉頭蛋白p3（Foxp3）-FITC（貨號：orb15626）購自英國Biorbyt公司。熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；ELX800多功能酶標儀購自美國Biotek公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3?AE大鼠模型構(gòu)建及實驗分組

參照相關(guān)文獻［7］進行AE大鼠模型的構(gòu)建。將豬心肌球蛋白加入磷酸緩沖鹽溶液（PBS）稀釋到2 mg/mL，然后將豬心肌球蛋白溶液與完全弗氏佐劑進行1∶1混合得到渾濁乳液。所有造模大鼠通過腹腔注射0.1 mL乳濁液。此外，將PBS與完全弗氏佐劑1∶1混合，在對照（NC）組大鼠腹部同一位置等劑量注射。所有大鼠共注射14 d。將造模成功的48只SD大鼠隨機分為模型（Model）組、花青素組、STAT3激活劑Colivelin組、花青素＋Colivelin組，每組12只?；ㄇ嗨亟M按照50 mg/kg的劑量腹腔注射花青素［4］；Colivelin組腹腔注射1 mg/kg Colivelin［8］；花青素＋Colivelin組在花青素組基礎(chǔ)上腹腔注射1 mg/kg Colivelin；NC組和Model組腹腔注射2 mL/kg生理鹽水，每日2次，持續(xù)14 d。

1.4?標本采集

最后1次腹腔注射藥物后，尾靜脈采血、靜置、分離得到血清，置于－20 ℃保存以備后續(xù)實驗使用。麻醉大鼠后處死，分離脾臟組織和心肌組織，6只大鼠的心肌組織固定于4%多聚甲醛中，脾臟組織用于分離淋巴細胞；剩余6只大鼠的心肌組織和脾臟組織儲存于－80 ℃中以備后續(xù)實驗使用。

1.5?心肌組織形態(tài)觀察

取心肌組織置于4%多聚甲醛溶液中，經(jīng)常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片、制片等過程，用蘇木精和伊紅染色后，在光學顯微鏡下觀察心肌組織的形態(tài)。

1.6?心肌細胞凋亡情況

取1.5中心肌組織切片，按照末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）試劑盒操作過程，并用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色細胞核。TUNEL陽性細胞核呈綠色熒光，即凋亡細胞。在熒光顯微鏡下觀察，細胞凋亡率為TUNEL陽性細胞/DAPI染色細胞×100%。

1.7?血清炎性因子檢測

取1.4中冷凍保存的血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測大鼠血清炎性因子IL-10、IL-4、IL-17以及IL-23β水平。

1.8?流式細胞術(shù)檢測脾臟Th17/Treg細胞表達

分離脾臟組織的淋巴細胞，加入緩沖液細胞懸浮液，使每孔細胞濃度稀釋到1×106個/mL，與CD4-APC、IL-17-PE避光孵育20 min，上機檢測Th17細胞數(shù)量，另外與CD4-APC、Foxp3-FITC避光孵育20 min，檢測Treg細胞數(shù)量。

1.9?RT-qPCR檢測脾臟組織維甲酸相關(guān)孤兒受體γt（RORγt）、Foxp3mRNA表達情況

提取大鼠脾臟組織總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用RT-qPCR測定RORγt、Foxp3 mRNA表達量，反應條件為：預變性95 ℃/30 s，40個循環(huán)（95 ℃/5 s，60 ℃/30 s）；以GAPDH為內(nèi)參基因，引物由NCBI在線軟件設(shè)計。詳見表1。

1.10?免疫印跡法（Western Blot）檢測JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白表達

取大鼠心肌組織勻漿，用RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，將蛋白質(zhì)進行變性、定量、電泳、轉(zhuǎn)膜，將膜室溫封閉3 h后分別加入一抗JAK2（1∶1 000）、p-JAK2（1∶1 000）、STAT3（1∶2 000）、p-STAT3（1∶2 000）和GAPDH抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗（1∶4 000），室溫孵育3 h，加入增強型化學發(fā)光試劑（ECL）顯影后。使用Image LabTM軟件分析目標蛋白的灰度值。

1.11?統(tǒng)計學處理

采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分析的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2?結(jié)?果

2.1?花青素對大鼠心肌組織的影響

NC組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)正常，未見明顯的壞死和水腫現(xiàn)象；與NC組相比，Model組大鼠心肌組織出現(xiàn)明顯的壞死和水腫現(xiàn)象，大量炎性細胞浸潤；與Model組比較，花青素組大鼠心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)與NC組相似，Colivelin組大鼠炎性細胞浸潤現(xiàn)象增加；與花青素組相比，花青素＋Colivelin組心肌組織水腫和壞死現(xiàn)象加重。詳見圖1。

2.2?花青素對大鼠心肌細胞凋亡的影響

與NC組相比，Model組大鼠心肌細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與Model組相比，花青素組大鼠心肌細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），Colivelin組大鼠心肌細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與花青素組相比，花青素＋Colivelin組大鼠心肌細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）。詳見圖2、表2。

2.3?花青素對大鼠血清炎性因子的影響

與NC組相比，Model組大鼠IL-17和IL-23水平明顯升高（P＜0.05），IL-10和IL-4水平明顯降低（P＜0.05），與Model組相比，花青素組大鼠IL-17和IL-23水平明顯降低（P＜0.05），IL-10和IL-4水平明顯升高（P＜0.05）；Colivelin組大鼠IL-17和IL-23水平明顯升高（P＜0.05），IL-10和IL-4水平明顯降低（P＜0.05）。與花青素組相比，花青素＋Colivelin組大鼠IL-17和IL-23水平明顯升高（P＜0.05），IL-10和IL-4水平明顯降低（P＜0.05）。詳見表3。

2.4?花青素對大鼠脾臟Th17/Treg細胞水平的影響

與NC組相比，Model組脾臟Th17細胞水平以及Th17/Treg比例明顯升高（P＜0.05），Treg水平明顯降低（P＜0.05）。與Model組相比，花青素組脾臟Th17水平以及Th17/Treg比例明顯降低（P＜0.05），Treg水平明顯升高（P＜0.05）；Colivelin組脾臟Th17水平以及Th17/Treg比例明顯升高（P＜0.05），Treg水平明顯降低（P＜0.05）。與花青素組相比，花青素＋Colivelin組脾臟Th17水平以及Th17/Treg比例明顯升高（P＜0.05），Treg細胞水平明顯降低（P＜0.05）。詳見表4。

2.5?花青素對大鼠脾臟組織RORγt、Foxp3mRNA水平的影響

與NC組相比，Model組脾臟組織RORγt mRNA水平明顯升高，F(xiàn)oxp3mRNA水平明顯降低（P＜0.05）；與Model組相比，花青素組脾臟組織RORγt mRNA水平明顯降低，F(xiàn)oxp3mRNA水平明顯升高（P＜0.05），Colivelin組脾臟組織RORγtmRNA水平明顯升高，F(xiàn)oxp3mRNA水平明顯降低（P＜0.05）；與花青素組相比，花青素＋Colivelin組脾臟組織RORγt mRNA水平明顯升高，F(xiàn)oxp3mRNA水平明顯降低（P＜0.05）。詳見表5。

2.6?花青素對大鼠心肌組織JAK2、STAT3蛋白表達水平的影響

與NC組相比，Model組心肌組織p-STAT3/STAT3、p-JAK2/JAK2比例明顯升高（P＜0.05）；與Model組相比，花青素組心肌組織p-STAT3/STAT3、p-JAK2/JAK2比例明顯降低（P＜0.05），Colivelin組心肌組織p-STAT3/STAT3、p-JAK2/JAK2比例明顯升高（P＜0.05）；與花青素組相比，花青素＋Colivelin組心肌組織p-STAT3/STAT3、p-JAK2/JAK2比例明顯升高（P＜0.05）。詳見圖3、表6。

3?討?論

AE是一種炎癥性疾病，其可發(fā)展為心力衰竭、心源性休克、心律失常和猝死。AE病人在患病的過程中，釋放大量的炎性因子，從而造成心肌組織發(fā)生炎癥損傷，促使心肌纖維化，最終損害心臟功能［9-11］。本研究通過構(gòu)建AE大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，Model組大鼠心肌出現(xiàn)明顯的壞死和水腫現(xiàn)象，大量炎性細胞浸潤，心肌細胞凋亡率明顯升高，提示AE大鼠模型構(gòu)建成功。花青素已被廣泛應用于抗氧化、抗菌、抗炎、抗糖尿病、血管生成和心臟保護等方面［12］。研究發(fā)現(xiàn)，花青素可以通過改善小鼠炎癥改善高脂飲食誘導的胰島素抵抗［13］，還可以通過改善心肌組織炎癥改善膿毒癥大鼠心功能［14］。本研究結(jié)果顯示，與Model組比較，花青素組大鼠心肌無明顯壞死和細胞腫脹，且心肌細胞凋亡率明顯下降，提示花青素可能對AE大鼠心肌起到一定的保護作用。

炎癥是決定心肌炎發(fā)展成擴張型心肌病的主要有害因素，減輕炎癥可對心肌炎發(fā)揮保護作用［15-16］。Th17細胞受RORγt調(diào)控產(chǎn)生IL-17、IL-22和IL-23，募集中性粒細胞，并促進感染部位的炎癥；而Treg細胞受Foxp3調(diào)控產(chǎn)生IL-10和IL-4，抑制多種免疫細胞的活性，從而抑制免疫反應［17-18］。RORγt與Foxp3的水平可反映Th17細胞和Treg細胞活化情況［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，Model組大鼠體內(nèi)Th17/Treg平衡被打破，花青素干預則可明顯降低大鼠血清IL-17、IL-23水平及脾臟RORγt mRNA水平，升高血清IL-10、IL-4水平及脾臟Foxp3 mRNA水平，提示花青素可能通過調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡減弱AE大鼠心肌炎癥反應。

JAK2是蛋白酪氨酸激酶家族的成員，在炎癥反應以及細胞增殖和分化過程中起著重要作用［19］。JAK2可以通過調(diào)節(jié)STAT3磷酸化影響機體炎癥水平［20］。研究表明，抑制JAK/STAT通路能夠調(diào)控Th17/Treg平衡，改善神經(jīng)元炎性損傷和凋亡［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，Model組大鼠心肌p-STAT3/STAT3、p-JAK2/JAK2比例明顯升高，推測JAK2/STAT3通路可能參與了AE大鼠Th17/Treg平衡的破壞。與Model組比較，花青素組大鼠心肌p-STAT3/STAT3、p-JAK2/JAK2比例明顯降低，推測花青素可能通過抑制JAK2/STAT3通路恢復AE大鼠的Th17/Treg平衡。本研究采用STAT3激活劑Colivelin干預發(fā)現(xiàn)，與花青素組相比，花青素＋Colivelin組心肌炎性細胞浸潤現(xiàn)象增加，IL-17、IL-23、RORγt mRNA水平、心肌細胞凋亡率及p-STAT3/STAT3、p-JAK2/JAK2比例明顯升高，IL-10、IL-4、Foxp3 mRNA水平明顯降低，表明Colivelin可減弱花青素對AE大鼠Th17/Treg平衡和心肌損傷的改善作用。

綜上所述，花青素可能通過抑制JAK2/STAT3通路，恢復AE大鼠的Th17/Treg平衡，改善AE大鼠心肌損傷。然而，花青素的作用靶點可能涉及其他通路，有待后續(xù)進一步探究。

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（收稿日期：2022-08-02）

（本文編輯王麗）