宋秀威 楊月君 王偉

摘要?目的：探討吳茱萸堿調(diào)節(jié)高遷移率族蛋白B1（HMGB1）/Toll樣受體4（TLR4）/核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號通路對腦梗死大鼠神經(jīng)炎癥的影響。方法：采用大腦中動脈栓塞法構建腦梗死大鼠模型，隨機分為模型組、吳茱萸堿低劑量組、吳茱萸堿高劑量組、吳茱萸堿高劑量＋空載質(zhì)粒組、吳茱萸堿高劑量＋HMGB1過表達組，每組15只，另選取15只健康大鼠設為假手術組，以吳茱萸堿和質(zhì)粒分組處理后，采用改良神經(jīng)功能缺損評分（mNSS）評估大鼠神經(jīng)損傷；三苯基氯化四氮唑（TTC）染色檢測大鼠腦梗死面積；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）染色檢測大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率；透射電鏡觀察大鼠海馬神經(jīng)元超微結構；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測大鼠血清及腦組織促炎因子環(huán)氧化酶-2（COX-2）、白細胞介素-18（IL-18）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）水平；蛋白免疫印跡法檢測大鼠腦組織HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路蛋白表達。結果：與假手術組比較，模型組大鼠海馬神經(jīng)元超微結構發(fā)生損傷，mNSS評分、腦梗死面積、海馬神經(jīng)元凋亡率、血清與腦組織COX-2、IL-18、iNOS水平、腦組織HMGB1、TLR4蛋白表達及p-NF-κB p65/NF-κB p65明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，吳茱萸堿低劑量組、吳茱萸堿高劑量組、吳茱萸堿高劑量＋空載質(zhì)粒組大鼠海馬神經(jīng)元超微結構損傷均減輕，mNSS評分、腦梗死面積、海馬神經(jīng)元凋亡率、血清與腦組織COX-2、IL-18、iNOS水平、腦組織HMGB1、TLR4蛋白表達及p-NF-κB p65/NF-κB p65均降低（P＜0.05）；吳茱萸堿高劑量組大鼠海馬神經(jīng)元超微結構損傷較吳茱萸堿低劑量組進一步減輕，mNSS評分、腦梗死面積、海馬神經(jīng)元凋亡率、血清與腦組織COX-2、IL-18、iNOS水平、腦組織HMGB1、TLR4蛋白表達及p-NF-κB p65/NF-κB p65進一步降低（P＜0.05）。與吳茱萸堿高劑量組比較，吳茱萸堿高劑量＋HMGB1過表達組大鼠海馬神經(jīng)元超微結構損傷加重，mNSS評分、腦梗死面積、海馬神經(jīng)元凋亡率、血清與腦組織COX-2、IL-18、iNOS水平、腦組織HMGB1、TLR4蛋白表達及p-NF-κB p65/NF-κB p65升高（P＜0.05）。結論：吳茱萸堿可通過阻止HMGB1/TLR4/NF-κB信號激活而降低促炎因子表達，從而抑制神經(jīng)炎癥，減輕腦梗死大鼠神經(jīng)功能損傷。

關鍵詞?腦梗死；吳茱萸堿；高遷移率族蛋白B1/Toll樣受體4/核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號通路；神經(jīng)炎癥；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.07.013

腦梗死（cerebral infarction，CI）是由腦動脈閉塞引起的腦組織缺血性壞死和神經(jīng)元損傷凋亡，可導致偏癱、認知能力下降，具有高死亡率、高致殘率的特點［1-2］。過度的神經(jīng)炎癥是導致神經(jīng)功能損傷的主要因素，抑制神經(jīng)炎癥可減少神經(jīng)元凋亡，減輕認知功能損傷［3-4］。高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）/Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）信號通路可通過調(diào)控促炎因子釋放和小膠質(zhì)細胞激活而介導神經(jīng)炎癥的發(fā)生發(fā)展，阻斷該信號傳導可抑制神經(jīng)炎癥［5-6］。吳茱萸堿可抑制NF-κB p65磷酸化，阻止小膠質(zhì)細胞過度激活引起的神經(jīng)炎癥［7-8］。本研究以不同劑量吳茱萸堿處理腦梗死大鼠，探討吳茱萸堿調(diào)節(jié)HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路對腦梗死大鼠神經(jīng)炎癥的影響。

作者單位?保定市第二醫(yī)院（河北保定 071000），E-mail：Sxiu55@126.com

引用信息?宋秀威，楊月君，王偉.吳茱萸堿調(diào)節(jié)HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路對腦梗死大鼠神經(jīng)炎癥的影響［J］.中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2024，22（7）：1240-1246.

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物

SD大鼠，雄性，無特定病原體（SPF）級，購于萊岸科技（廣州）有限公司，生產(chǎn)許可證號SYXK（粵）2022-0283，體質(zhì)量200～230 g，6周齡左右，動物飼養(yǎng)房內(nèi)保持屏障環(huán)境，分籠喂養(yǎng)，每籠不超過5只，所有操作符合3R原則，并嚴格遵循《實驗動物管理條例》要求。

1.1.2?主要試劑及儀器

吳茱萸堿［經(jīng)高效液相色譜（HPLC）法測得純度≥98%］、三苯基氯化四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）、大鼠環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、白細胞介素-18（interleukin-18，IL-18）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；大鼠誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）ELISA試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）檢測試劑盒、兔源一抗β-actin、HMGB1、p-NF-κB p65、TLR4、NF-κB p65購自英國Abcam公司。VHX-7000光學顯微鏡（日本基恩士公司生產(chǎn)）；JEM-2100Plus透射電子顯微鏡（深圳市藍星宇電子科技有限公司生產(chǎn)）；VarioskanLUX全自動酶標儀（賽默飛世爾科技中國有限公司生產(chǎn)）。

1.2?方法

1.2.1?腦梗死大鼠模型制備及分組處理

參照文獻［9］制備腦梗死大鼠模型：以50 mg/kg劑量的3%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，以仰臥位固定在操作板上，剃除頸部毛發(fā)后消毒、備皮，切開左側(cè)皮膚并分離肌肉組織，找到并游離頸動脈，將左側(cè)頸總動脈和頸外動脈結扎，于頸總動脈處開孔插入線栓并前進至大腦中動脈，封閉血流2 h后取出線栓恢復血流，縫合傷口并再灌注24 h完成造模，然后從大鼠平衡、運動、感知和反射等方面對其神經(jīng)功能缺損進行評定，評估標準參考文獻［10］，改良神經(jīng)功能缺損評分（modified Neurological Severity Score，mNSS）總分18分，得分≥7分即為造模成功。隨機分為模型組、吳茱萸堿低劑量組、吳茱萸堿高劑量組、吳茱萸堿高劑量＋空載質(zhì)粒組、吳茱萸堿高劑量＋HMGB1過表達組，每組15只。另選取15只健康大鼠，設為假手術組，只游離頸動脈不進行缺血再灌注。

將吳茱萸堿和空載質(zhì)粒、HMGB1過表達質(zhì)粒溶于生理鹽水，吳茱萸堿低劑量組、吳茱萸堿高劑量組大鼠分別以35、70 mg/kg的劑量灌胃（3.5、7.0 mg/mL的吳茱萸堿藥液10 mL/kg，每日1次）［11］，同時尾靜脈注射與吳茱萸堿高劑量＋HMGB1過表達組等劑量的生理鹽水（每周2次）；吳茱萸堿高劑量＋空載質(zhì)粒組、吳茱萸堿高劑量＋HMGB1過表達組大鼠以70 mg/kg的劑量灌胃（7.0 mg/mL的吳茱萸堿藥液10 mL/kg，每日1次），同時分別尾靜脈注射空載質(zhì)粒、HMGB1過表達質(zhì)粒（每周2次）；假手術組、模型組大鼠灌胃10 mL/kg劑量的生理鹽水（每日1次），同時尾靜脈注射與吳茱萸堿高劑量＋HMGB1過表達組等劑量的生理鹽水（每周2次）。各組大鼠均處理2周。

1.2.2?檢測大鼠神經(jīng)功能損傷情況

給藥結束后24 h，采用mNSS評估各組大鼠神經(jīng)功能，得分越高表示大鼠神經(jīng)功能缺損越嚴重。

1.2.3?TTC染色檢測大鼠腦梗死面積

各組大鼠于mNSS評分結束后以乙醚麻醉，采集頸動脈血離心，收集上清置于－80 ℃?zhèn)溆?。每組隨機選取5只大鼠，斷頭剝離出大腦，切成厚度大致相同的冠狀切片，以TTC溶液染色后固定，拍照后以Image pro軟件對圖像進行分析，定量每只大鼠全腦切片面積和全腦切片中梗死面積，計算腦梗死面積，腦梗死面積＝全腦切片中梗死面積/全腦切片面積×100%。

每組剩余的10只大鼠中，再次隨機選取5只，斷頭剝離出大腦，使用手術剪剪下缺血半暗帶腦組織0.4 g儲存于液氮備用，剩余的腦組織置于4%多聚甲醛中固定后以梯度乙醇（50%、70%、80%、90%、100%）脫水、二甲苯透明、熱石蠟包埋，置于石蠟切片機中固定切片，得到厚度約4 μm的切片備用。

每組剩余5只大鼠，斷頭剝離出大腦，使用手術剪剪下缺血半暗帶腦組織0.4 g，剪碎、勻漿、離心后以二喹啉甲酸（BCA）法測定上清中總蛋白濃度，最后將腦組織蛋白樣品液置于－80 ℃?zhèn)溆?，剩余的腦組織依次置于2.5%戊二醛、2%四氧化鋨中固定，以50%、70%、80%、90%、100%梯度乙醇依次脫水，然后浸透包埋后置于超薄切片機中固定切片，得到厚度約70 nm的切片備用。

1.2.4?TUNEL染色檢測大鼠神經(jīng)元凋亡情況

選取1.2.3中無破損的厚度約4 μm腦組織切片進行脫蠟、水化、TUNEL染色處理，在光學顯微鏡下觀察并隨機采集5個視野圖像，以Image pro軟件對圖像進行分析，定量切片中海馬神經(jīng)元凋亡細胞數(shù)與海馬神經(jīng)元總細胞數(shù)，海馬神經(jīng)元凋亡率＝海馬神經(jīng)元凋亡細胞數(shù)/海馬神經(jīng)元總細胞數(shù)×100%。

1.2.5?大鼠海馬神經(jīng)元超微結構檢測

選取1.2.3中無破損的厚度約70 nm的腦組織切片，以枸杞酸鉛和醋酸鈾雙重染色后，采用透射電子顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元超微結構并采集圖像。

1.2.6?ELISA檢測大鼠血清及腦組織促炎因子COX-2、IL-18、iNOS水平

取1.2.3中血清以冰水浴慢慢解凍，同時取出存在液氮中的腦組織剪碎、勻漿、離心后以BCA法測定上清中總蛋白濃度后，每組取出200 μL腦組織蛋白樣品液和200 μL血清通過ELISA法測量其中COX-2、IL-18、iNOS水平，具體步驟參照各自ELISA試劑盒說明書進行。

1.2.7?蛋白免疫印跡法檢測大鼠腦組織HMGB1/TLR4/NF-κB通路蛋白表達

取1.2.3中置于－80 ℃的腦組織蛋白樣品液以冰水浴慢慢解凍，根據(jù)蛋白濃度檢測結果每組取出25 μg總蛋白，煮沸變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，將β-actin、HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白自膜上剪下，以兔源一抗和辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)羊抗兔二抗孵育進行抗原抗體反應，通過化學發(fā)光法顯色后拍照，以Image pro軟件對圖像進行分析后量化各組蛋白相對表達量。

1.3?統(tǒng)計學處理

以SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的定量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較行t檢驗；多組間比較行單因素方差分析，兩兩之間進一步比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2?結?果

2.1?吳茱萸堿對腦梗死大鼠神經(jīng)功能損傷的影響

與假手術組比較，模型組大鼠mNSS評分、腦梗死面積明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，吳茱萸堿低劑量組、吳茱萸堿高劑量組、吳茱萸堿高劑量＋空載質(zhì)粒組大鼠mNSS評分、腦梗死面積均降低（P＜0.05），吳茱萸堿高劑量組大鼠mNSS評分、腦梗死面積較吳茱萸堿低劑量組進一步降低（P＜0.05）；與吳茱萸堿高劑量組比較，吳茱萸堿高劑量＋HMGB1過表達組大鼠mNSS評分、腦梗死面積升高（P＜0.05），吳茱萸堿高劑量＋空載質(zhì)粒組大鼠mNSS評分、腦梗死面積無明顯變化（P＞0.05）。詳見圖1～圖3。

2.2?吳茱萸堿對腦梗死大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

與假手術組比較，模型組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，吳茱萸堿低劑量組、吳茱萸堿高劑量組、吳茱萸堿高劑量＋空載質(zhì)粒組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率均降低（P＜0.05），吳茱萸堿高劑量組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率較吳茱萸堿低劑量組進一步降低（P＜0.05）；與吳茱萸堿高劑量組比較，吳茱萸堿高劑量＋HMGB1過表達組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率升高（P＜0.05）；吳茱萸堿高劑量＋空載質(zhì)粒組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率無明顯變化（P＞0.05）。詳見圖4、圖5。

2.3?吳茱萸堿對腦梗死大鼠海馬神經(jīng)元超微結構的影響

假手術組海馬神經(jīng)元胞體形態(tài)大且完好，存在眾多神經(jīng)軸突，細胞器完整，細胞核邊緣光滑且染色質(zhì)均勻分布；模型組大鼠海馬神經(jīng)元超微結構受損嚴重，神經(jīng)元形態(tài)受損不完整，神經(jīng)軸突大量消失，細胞器結構破壞，細胞質(zhì)內(nèi)形成很多空泡及溶酶體，細胞核皺縮且染色質(zhì)凝聚；與模型組比較，吳茱萸堿低劑量組、吳茱萸堿高劑量組、吳茱萸堿高劑量＋空載質(zhì)粒組大鼠海馬神經(jīng)元超微結構受損癥狀均減輕，相比吳茱萸堿低劑量組，吳茱萸堿高劑量組、吳茱萸堿高劑量＋空載質(zhì)粒組大鼠海馬神經(jīng)元超微結構受損癥狀進一步減輕；與吳茱萸堿高劑量組比較，吳茱萸堿高劑量＋HMGB1過表達組大鼠海馬神經(jīng)元受損癥狀加重。詳見圖6。

2.4?吳茱萸堿對腦梗死大鼠腦組織促炎因子COX-2、IL-18、iNOS水平的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織COX-2、IL-18、iNOS水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，吳茱萸堿低劑量組、吳茱萸堿高劑量組、吳茱萸堿高劑量＋空載質(zhì)粒組大鼠腦組織COX-2、IL-18、iNOS水平均降低（P＜0.05），吳茱萸堿高劑量組大鼠腦組織COX-2、IL-18、iNOS水平相比吳茱萸堿低劑量組進一步降低（P＜0.05）；與吳茱萸堿高劑量組比較，吳茱萸堿高劑量＋HMGB1過表達組大鼠腦組織COX-2、IL-18、iNOS水平升高（P＜0.05）；吳茱萸堿高劑量＋空載質(zhì)粒組大鼠腦組織COX-2、IL-18、iNOS水平無明顯變化（P＞0.05）。詳見圖7。

2.5?吳茱萸堿對腦梗死大鼠血清促炎因子COX-2、IL-18、iNOS水平的影響

與假手術組比較，模型組大鼠血清COX-2、IL-18、iNOS水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，吳茱萸堿低劑量組、吳茱萸堿高劑量組、吳茱萸堿高劑量＋空載質(zhì)粒組大鼠血清COX-2、IL-18、iNOS水平均降低（P＜0.05），吳茱萸堿高劑量組大鼠血清COX-2、IL-18、iNOS水平較吳茱萸堿低劑量組進一步降低（P＜0.05）；與吳茱萸堿高劑量組比較，吳茱萸堿高劑量＋HMGB1過表達組大鼠血清COX-2、IL-18、iNOS水平升高（P＜0.05），吳茱萸堿高劑量＋空載質(zhì)粒組大鼠血清COX-2、IL-18、iNOS水平無明顯變化（P＞0.05）。詳見圖8～圖10。

2.6?吳茱萸堿對腦梗死大鼠腦組織HMGB1/TLR4/NF-κB通路相關蛋白表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織HMGB1、TLR4蛋白表達及p-NF-κB p65/NF-κB p65明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，吳茱萸堿低劑量組、吳茱萸堿高劑量組、吳茱萸堿高劑量＋空載質(zhì)粒組大鼠腦組織HMGB1、TLR4蛋白表達及p-NF-κB p65/NF-κB p65均降低（P＜0.05），吳茱萸堿高劑量組大鼠腦組織HMGB1、TLR4蛋白表達及p-NF-κB p65/NF-κB p65較吳茱萸堿低劑量組進一步降低（P＜0.05）；與吳茱萸堿高劑量組比較，吳茱萸堿高劑量＋HMGB1過表達組大鼠腦組織HMGB1、TLR4蛋白表達及p-NF-κB p65/NF-κB p65升高（P＜0.05），吳茱萸堿高劑量＋空載質(zhì)粒組大鼠腦組織HMGB1、TLR4蛋白表達及p-NF-κB p65/NF-κB p65無明顯變化（P＞0.05）。詳見圖11、圖12。

3?討?論

神經(jīng)炎癥是造成腦梗死神經(jīng)損傷的致病因素，抑制神經(jīng)炎癥可減輕神經(jīng)元凋亡，從而改善腦損傷［12-13］。吳茱萸堿是具有強烈抗菌、抗炎特性的生物堿，可通過減輕機體炎來緩解哮喘大鼠氣道炎癥［14］和小鼠潰瘍性結腸炎癥狀［15］。本研究結果顯示，不同劑量的吳茱萸堿可降低腦梗死大鼠mNSS評分，減少腦梗死面積，并降低海馬神經(jīng)元凋亡率及血清與腦組織COX-2、IL-18、iNOS水平，減輕海馬神經(jīng)元超微結構損傷，表明吳茱萸堿可降低促炎因子表達釋放，抑制神經(jīng)炎癥發(fā)生發(fā)展，減輕海馬神經(jīng)元凋亡損傷，最終改善腦梗死大鼠神經(jīng)功能，提示吳茱萸堿具有明顯的腦保護作用。

在炎癥反應過程中，HMGB1作為TLR4的內(nèi)源性配體，可以激活TLR4，然后激活NF-κB，促進一系列炎性因子的釋放，導致過度和損傷性炎癥，進而導致組織損傷。阻滯HMGB1/TLR4/NF-κB信號傳導可降低炎性因子過量表達，減輕神經(jīng)炎癥，進而改善認知功能［16］。有研究顯示，抑制HMGB1介導的TLR4/NF-κB信號通路的激活可抑制神經(jīng)炎癥和氧化應激，減輕包括腦梗死在內(nèi)的腦缺血疾病導致的腦損傷和神經(jīng)功能缺損［17-18］。本研究發(fā)現(xiàn)腦梗死大鼠腦組織HMGB1、TLR4蛋白表達及p-NF-κB p65/NF-κB p65較假手術組大鼠明顯升高，表明HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路被激活，吳茱萸堿可逆轉(zhuǎn)其變化趨勢，提示HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路可能參與介導吳茱萸堿對腦梗死大鼠神經(jīng)炎癥的抑制過程。為了進一步驗證吳茱萸堿的作用機制，本研究采用高劑量吳茱萸堿處理腦梗死大鼠的同時過表達HMGB1，結果發(fā)現(xiàn)上調(diào)HMGB1表達可激活TLR4/NF-κB信號傳導，減弱吳茱萸堿對腦梗死大鼠神經(jīng)炎癥的抑制作用，拮抗其對海馬神經(jīng)元凋亡損傷的減輕作用，最終逆轉(zhuǎn)吳茱萸堿對腦梗死大鼠神經(jīng)功能的改善作用，揭示吳茱萸堿抑制腦梗死大鼠神經(jīng)炎癥是通過上調(diào)HMGB1實現(xiàn)的。

總之，吳茱萸堿可減少促炎因子釋放，抑制神經(jīng)炎癥反應，減輕腦梗死大鼠海馬神經(jīng)元超微結構損傷及凋亡，最終改善大鼠神經(jīng)功能缺損，阻斷HMGB1/TLR4/NF-κB信號途徑傳導可能是其機制之一。本研究證實了吳茱萸堿對腦梗死大鼠具有治療作用，為臨床腦缺血疾病的治療提供了新的藥物選擇。

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（收稿日期：2022-09-24）

（本文編輯王麗）