王思雨，張國玉，張永祥，運(yùn)立媛，3*，張民，3，4*

（1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300392；2.新疆冠農(nóng)股份有限公司，新疆庫爾勒 841000；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部智慧養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（部省共建）；4.天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工中俄聯(lián)合研究中心，天津 300392）

迷迭香（RosmarinusofficinalisL.），別名海洋之露，是唇形科多年生芳香常綠灌木，是一種具有悠久栽培歷史和食用歷史的天然香料植物，同時(shí)也是最早使用的醫(yī)藥用植物之一，原產(chǎn)地為環(huán)地中海沿岸地區(qū)，在我國已成功引種并得到廣泛推廣[1-2]。迷迭香富含黃酮、揮發(fā)油、多酚、萜類等多種生物活性化合物，具有抗微生物、抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等功效，尤其是迷迭香中的迷迭香酸、鼠尾草酸等具有較強(qiáng)的抗菌和抗氧化活性[3]。因此，迷迭香粗提物作為天然抗氧化劑因其安全性高、抗氧化能力強(qiáng)等特點(diǎn)日益受到重視。然而，對于迷迭香粗提物的抑菌活性和防腐效果的研究報(bào)道較少。

隨著人們生活水平的提高，食品安全問題越來越被重視，而在貯藏、運(yùn)輸?shù)冗^程中由于微生物、溫度、食品結(jié)構(gòu)等因素影響，食品保鮮受到諸多挑戰(zhàn)[4]。目前，添加食品防腐劑仍是防止食品腐敗變質(zhì)的主要手段之一，但某些常用化學(xué)合成防腐劑存在致畸性、致癌性和引起食物中毒等問題，因而使用天然防腐劑被認(rèn)為是提高微生物安全性的有效替代方案[5-6]。

因此，本研究利用單因素結(jié)合響應(yīng)面法對迷迭香提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，利用牛津杯法、濾紙圓片法對迷迭香粗提物的抑菌活性進(jìn)行初步探討，以期為開發(fā)迷迭香天然防腐劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

迷迭香：市售；無水乙醇（分析純）：上海風(fēng)船信息科技有限公司；大腸桿菌（Escherichiacoli）菌種凍干粉、綠膿桿菌（Pseudomonasaeruginosa）菌種凍干粉、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）菌種凍干粉、蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）菌種凍干粉：北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；營養(yǎng)瓊脂、LB 培養(yǎng)基、素瓊脂：北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250B-Z 型生化培養(yǎng)箱：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；SW-CJ-2D 型雙人凈化工作臺：浙江孚夏醫(yī)療科技有限公司；LDZX-30KBS 型立式高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；FD-250101 型冷凍干燥機(jī)：杭州富睿捷科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 迷迭香粗提物提取單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將迷迭香磨粉，過60 目篩后得到迷迭香粉，稱取5.0 g 迷迭香粉，加入一定體積的乙醇溶液在一定溫度下進(jìn)行回流提取，過濾、合并濾液，再濃縮至干，稱量粗提物（即迷迭香粗提物）質(zhì)量。以此為提取方法，分別考察液料比[4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1（mL/g）]、提取時(shí)間（20、40、60、80、100 min）、提取溫度（60、70、80、90、100 ℃）、提取次數(shù)（1、2、3、4、5 次）、乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%）對迷迭香粗提物得率的影響。

1.3.2 迷迭香粗提物得率的計(jì)算

迷迭香粗提物得率（Y，%）的計(jì)算公式如下。

式中：m為迷迭香粗提物的質(zhì)量，g；M為迷迭香粉的質(zhì)量，g。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化迷迭香粗提物試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)中心組合（Box-Behnken）試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用五因素三水平的響應(yīng)面分析法[7]。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of response surface design

1.3.4 菌懸液制備

將菌種凍干粉活化傳代后，進(jìn)行稀釋涂布培養(yǎng)計(jì)數(shù)。用無菌水10 倍梯度稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-66 種菌懸液，涂布培養(yǎng)計(jì)數(shù)，選擇含菌數(shù)約1×106CFU/mL 菌懸液進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)[8]。

1.3.5 抑菌圈的測定

1.3.5.1 牛津杯法測定

將牛津杯121 ℃滅菌備用，無菌操作下，將牛津杯放入制好的含菌平板中，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙，在杯中加入50 μL 樣液，做3 個(gè)平行，以無菌水為空白對照組，預(yù)擴(kuò)散后在37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長狀況[9]。

1.3.5.2 濾紙圓片法測定

用打孔器將定性濾紙打成6 mm 小圓片，置于培養(yǎng)皿中，121 ℃滅菌15 min 后備用；無菌操作下，將滅菌濾紙片浸于迷迭香粗提物中充分浸泡，浸泡2 h 后取出。將浸泡好的濾紙片放入制成的含菌平板上，預(yù)擴(kuò)散后在37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況[10]。

1.3.6 最低抑菌濃度測定

采用二倍稀釋法，將迷迭香粗提物用40%乙醇水溶液稀釋為原液的100.00%、50.00%、25.00%、12.50%、6.25%、3.13% 6 個(gè)濃度（即濃度分別為100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13 mg/mL）。準(zhǔn)備無菌平板，取100 μL 供試菌懸液于平板上，均勻涂布，分別吸取1 mL不同稀釋度的提取液至含菌平板上，每組重復(fù)3 次。將培養(yǎng)皿倒置放于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察供試菌生長狀況[11]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin 2019 作圖，Design-Expert V8.0.6 進(jìn)行響應(yīng)面分析，SPSS 25 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05 表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，P＜0.01 表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)極顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 液料比對迷迭香粗提物得率的影響

液料比對迷迭香粗提物得率的影響見圖1。

圖1 液料比對迷迭香粗提物得率影響Fig.1 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of crude extract of rosemary

由圖1 可知，迷迭香粗提物得率呈先上升后下降趨勢，液料比在6∶1（mL/g）時(shí)，迷迭香粗提物得率達(dá)到最大值。當(dāng)液料比超過6∶1（mL/g），增加實(shí)際生產(chǎn)成本[12]，因此，選擇液料比5∶1、6∶1、7∶1（mL/g）進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.2 提取溫度對迷迭香粗提物得率的影響

提取溫度對迷迭香粗提物得率的影響見圖2。

圖2 提取溫度對迷迭香粗提物得率影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of crude extract of rosemary

由圖2 可知，隨著提取溫度的升高，迷迭香粗提物得率呈先上升后下降的趨勢。提取溫度為80 ℃時(shí)，得率最高，但隨著提取溫度的升高，迷迭香粗提物得率出現(xiàn)降低的趨勢，這可能由于溫度過高，促使迷迭香粗提物分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，加速物質(zhì)氧化及降解，導(dǎo)致得率降低[13]。因此選擇提取溫度70、80、90 ℃進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.3 提取時(shí)間對迷迭香粗提物得率的影響

提取時(shí)間對迷迭香粗提物得率的影響見圖3。

圖3 提取時(shí)間對迷迭香粗提物得率影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of crude extract of rosemary

由圖3 可知，隨著提取時(shí)間的延長，迷迭香粗提物得率呈先升高后下降的趨勢，提取時(shí)間為60 min 時(shí)，迷迭香粗提物得率最高；提取時(shí)間超過60 min 后，迷迭香粗提物得率降低。這可能是由于過短時(shí)間內(nèi)迷迭香中活性物質(zhì)無法全部溶解，而提取時(shí)間過長會(huì)使迷迭香中活性成分如迷迭香酸、鼠尾草酸、鼠尾草酚等發(fā)生降解，從而導(dǎo)致得率的降低[14]。因此選擇提取時(shí)間40、60、80 min 進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.4 乙醇濃度對迷迭香粗提物得率的影響

乙醇濃度對迷迭香粗提物得率的影響見圖4。

圖4 乙醇濃度對迷迭香粗提物得率影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the yield of crude extract of rosemary

由圖4 可知，隨著乙醇濃度的增大，得率先增大后減小，這可能是由于乙醇濃度的增加能夠增強(qiáng)細(xì)胞的穿透力，促進(jìn)溶劑的滲透，從而提高迷迭香粗提物得率。乙醇濃度為60% 時(shí)，迷迭香粗提物得率最高；隨著乙醇濃度的增加，迷迭香粗提物得率出現(xiàn)下降趨勢，這可能是由于迷迭香粗提物具有廣泛極性，當(dāng)溶液極性過低或過高時(shí)，會(huì)減少粗提物成分的溶解，導(dǎo)致提取率的降低[15]。因此選擇乙醇濃度50%、60%、70%進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.5 提取次數(shù)對迷迭香粗提物得率的影響

提取次數(shù)對迷迭香粗提物得率的影響見圖5。

圖5 提取次數(shù)對迷迭香粗提物得率影響Fig.5 Effect of extraction times on the yield of the crude extract of rosemary

由圖5 可知，隨著提取次數(shù)的增加，迷迭香粗提物得率逐漸升高，當(dāng)提取3 次后，迷迭香粗提物得率無顯著性差異變化。隨著提取次數(shù)的增加，得率趨于平緩。產(chǎn)生上述現(xiàn)象的原因是隨著提取次數(shù)的增加，迷迭香中物質(zhì)逐漸溶出，但3 次后已完全溶出，故提取次數(shù)超過1、2、3 次后，迷迭香粗提物得率的增加不顯著，應(yīng)選取提取次數(shù)1、2、3 次進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)[16-17]。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

以液料比、浸提時(shí)間、提取溫度、乙醇濃度、提取次數(shù)為考察因素，以迷迭香粗提物得率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Response surface design scheme and results

通過Design-Expert V8.0.6 軟件計(jì)算出回歸方程，得回歸方程為Y=32.99+1.06A-0.55B-1.14C-0.43D+4.5E+0.000AB+0.95AC-1.38AD-1.32AE-2.55BC+1.05BD-0.055BE-0.40CD+1.65CE+1.59DE-3.29A2-3.58B2-4.56C2-4.49D2-1.98E2。該模型的有效性和顯著性分析見表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表3 可以看出，P＜0.000 1，該回歸模型極顯著，失擬項(xiàng)＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說明回歸模型可以準(zhǔn)確描述5 個(gè)因子對迷迭香粗提物得率的作用規(guī)律，試驗(yàn)誤差小，可以利用該模型分析及預(yù)測迷迭香粗提物得率。R2值常用來表示擬合度，該模型R2=0.913 8，表明回歸模型與實(shí)際結(jié)果接近。R2Adj=0.844 8，表明可以利用該模型來判斷84.48% 響應(yīng)值的變化情況。精密度12.056，表明試驗(yàn)準(zhǔn)確度較高，從回歸方差分析可知，方程一次項(xiàng)A、C對迷迭香粗提物得率的作用顯著（P＜0.05）、方程一次項(xiàng)E、二次型A2、B2、C2、D2、E2，以及交互項(xiàng)BC對迷迭香粗提物得率的作用極顯著（P＜0.01）。

由F值可知，5 個(gè)因子對迷迭香粗提物得率的作用程度，各因子作用的主次順序?yàn)镋＞C＞A＞B＞D，即提取次數(shù)＞提取時(shí)間＞液料比＞提取溫度＞乙醇濃度。

三維響應(yīng)面及等高線可較直接的反映各因素對迷迭香粗提物的作用。響應(yīng)面表面的陡峭程度和等高線的密度反映了相互作用的影響程度。響應(yīng)面越陡，表明該因子對迷迭香物質(zhì)得率的作用越大，因子之間的交互影響越顯著，等高線越接近橢圓表明兩個(gè)因子間的交互影響顯著，即對結(jié)果影響更為顯著。響應(yīng)面及等高線見圖6。

圖6 各因素的等高線和響應(yīng)面Fig.6 Contour lines and response surfaces of each factor

由圖6 可知，所選區(qū)域范圍中響應(yīng)面最高點(diǎn)以及等高線的中心點(diǎn)就是迷迭香粗提物得率的最大值，越接近中心點(diǎn)，迷迭香粗提物得率越高。

通過響應(yīng)面試驗(yàn)分析得到最優(yōu)工藝條件為液料比7∶1（mL/g）、提取溫度78.41 ℃、提取時(shí)間61.83 min、乙醇濃度59.26%、提取次數(shù)2.87，此時(shí)迷迭香粗提物最優(yōu)得率為32.25%。考慮到實(shí)際可操作性，對最佳提取條件優(yōu)化為液料比7∶1（mL/g）、提取溫度78 ℃、提取時(shí)間62 min、乙醇濃度60%、提取次數(shù)3 次，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。在此條件下粗提物得率為（32.40±0.52）%，與理論值無顯著性差異。說明此模型預(yù)測較好且穩(wěn)定，可用于迷迭香粗提物提取。

2.3 迷迭香粗提物抑菌作用

近年來，隨著各類抗生素的使用，細(xì)菌常用抗生素的耐藥性逐年攀升。研究表明，迷迭香對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等均有一定的抑菌作用[18-20]。試驗(yàn)結(jié)果如圖7 和表4 所示。

圖7 迷迭香粗提物對食品中常見細(xì)菌的抑菌效果Fig.7 Inhibitory effects of crude extract of rosemary on common bacteria in food

表4 迷迭香粗提物抑菌圈直徑Table 4 Diameter of inhibition zone of crude extract of rosemary

由圖7、表4 可知，迷迭香粗提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、綠膿桿菌有較好的抑菌效果，可形成明顯的抑菌圈，且迷迭香粗提物對金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌擁有更高的抑菌活性，抑菌圈直徑顯著高于其余兩種菌種。

研究表明，迷迭香粗提物主要通過破壞細(xì)胞膜和膜介導(dǎo)的凋亡途徑來發(fā)揮抗菌活性，通過破壞細(xì)胞膜的通透性和流動(dòng)性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部的各種物質(zhì)泄漏，致使細(xì)菌死亡[21]。與郭冬云等[22]的研究結(jié)果相比，本試驗(yàn)提取的迷迭香粗提物對金黃色葡萄球菌抑菌能力（抑菌圈直徑22.15 mm）高于其抑菌能力[抑菌圈直徑（11.45±0.19）mm]，這可能與提取工藝有關(guān)[23-24]。李明喆等[25]研究表明，迷迭香中的有效成分迷迭香酸能夠進(jìn)入E.coli細(xì)胞，通過調(diào)控微生物酶的活性，干擾微生物代謝，從而抑制細(xì)菌生長。因此，推測迷迭香粗提物的抑菌機(jī)制可能與破壞微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)及干擾微生物代謝有關(guān)。

2.4 迷迭香粗提物最低抑菌濃度

最低抑菌濃度是評價(jià)抗菌活性大小的指標(biāo)，因此本研究以最低抑菌濃度評價(jià)迷迭香粗提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、綠膿桿菌的抑菌能力。試驗(yàn)結(jié)果如表5 所示。

表5 迷迭香粗提物的最低抑菌濃度Table 5 Minimum inhibitory concentration of crude extract of rosemary

由表5 可知，迷迭香粗提物濃度在50.00 mg/mL時(shí)，均可有效抑制受試細(xì)菌的生長。當(dāng)迷迭香粗提物濃度為25.00 mg/mL 時(shí)，大腸桿菌出現(xiàn)菌落；當(dāng)迷迭香粗提物濃度為12.50 mg/mL 時(shí)，蠟樣芽孢桿菌和綠膿桿菌出現(xiàn)菌落；當(dāng)迷迭香粗提物濃度為6.25 mg/mL時(shí)，金黃色葡萄球菌出現(xiàn)菌落。因此，迷迭香粗提物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果大于蠟樣芽孢桿菌和綠膿桿菌，且均大于大腸桿菌。因此，迷迭香粗提物對大腸桿菌的最低抑菌濃度為50.00 mg/mL，對綠膿桿菌和蠟樣芽孢桿菌的最低抑菌濃度為25.00 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為12.50 mg/mL。

通過抑菌圈試驗(yàn)和最低抑菌濃度試驗(yàn)結(jié)果可以看出迷迭香粗提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、綠膿桿菌具有較好的抑菌效果。

3 結(jié)論

迷迭香粗提物的最優(yōu)提取工藝條件為液料比7∶1（mL/g）、提取溫度78 ℃、提取時(shí)間62 min、乙醇濃度60%、提取次數(shù)3 次，在此條件下，迷迭香粗提物的提取率為（32.40±0.52）%。迷迭香粗提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、蠟樣芽孢桿菌均具有一定抑菌效果，對大腸桿菌的最低抑菌濃度為50 mg/mL，對綠膿桿菌和蠟樣芽孢桿菌的最低抑菌濃度為25 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為12.50 mg/mL。本研究優(yōu)化了迷迭香粗提物提取工藝；同時(shí)，抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，迷迭香粗提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、蠟樣芽孢桿菌具有有效的抑菌活性，研究結(jié)果可為抗生素耐藥感染中的天然產(chǎn)物替代開發(fā)提供依據(jù)。