彭亞彬，徐澤宇，韓天琦，王麗娟，薛鮮麗，2，王德培，3*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300450；2.天津市微生物代謝與發(fā)酵過(guò)程控制技術(shù)工程中心，天津 300450；3.天津工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

黑曲霉作為一種食品安全性的絲狀真菌，已成為國(guó)際公認(rèn)的重要工業(yè)生產(chǎn)菌株[1]。由于其具有極強(qiáng)的活性蛋白分泌以及蛋白質(zhì)翻譯后的加工能力，成為發(fā)酵生產(chǎn)主要菌種之一，廣泛應(yīng)用于各種酶制劑的生產(chǎn)、食品加工、生物肥料、廢物處理、藥物生產(chǎn)等領(lǐng)域[2-3]。盡管黑曲霉是大多數(shù)發(fā)酵產(chǎn)品的理想來(lái)源，并且作為宿主已經(jīng)成功表達(dá)多種蛋白，但是仍然存在發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)不到工業(yè)生產(chǎn)要求水平的問(wèn)題，如何實(shí)現(xiàn)目的基因在黑曲霉中高效表達(dá)，是提高發(fā)酵產(chǎn)量的關(guān)鍵。目前基因表達(dá)調(diào)控方式主要包括DNA 水平調(diào)控[4]、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控[5]、翻譯水平調(diào)控[6]、翻譯后修飾調(diào)控及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控[7-8]等，其中轉(zhuǎn)錄調(diào)控是黑曲霉及其開發(fā)利用研究的熱點(diǎn)，通過(guò)篩選或改造黑曲霉的啟動(dòng)子可顯著提高目的基因的轉(zhuǎn)錄水平[9-10]。

啟動(dòng)子是一段位于結(jié)構(gòu)基因上游5′端DNA 序列，作為順式作用元件發(fā)揮著重要作用，參與基因轉(zhuǎn)錄的起始，通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合來(lái)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄活性[11]。黑曲霉具有復(fù)雜的菌絲形態(tài)與異核體等問(wèn)題，缺乏快速準(zhǔn)確的啟動(dòng)子評(píng)估方法，導(dǎo)致目前用于構(gòu)建黑曲霉細(xì)胞工廠構(gòu)建的強(qiáng)啟動(dòng)子有限，從而限制了黑曲霉的開發(fā)利用。因此篩選更多高效表達(dá)的啟動(dòng)子元件對(duì)于實(shí)現(xiàn)黑曲霉合成各類發(fā)酵產(chǎn)品是非常重要的。目前真菌啟動(dòng)子的研究方法主要有利用啟動(dòng)子探針質(zhì)粒載體篩選啟動(dòng)子、利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)克隆啟動(dòng)子、基因組文庫(kù)篩選法和利用載體或接頭的染色體步移技術(shù)克隆啟動(dòng)子[12]等，而熒光蛋白基因廣泛地被用作報(bào)告基因來(lái)表征啟動(dòng)子的啟動(dòng)效果[8，12-14]。獲得啟動(dòng)子序列后，可根據(jù)已報(bào)道的黑曲霉啟動(dòng)子關(guān)鍵元件對(duì)其進(jìn)行序列分析[15-16]，除此之外通過(guò)生物信息學(xué)的方法對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行分析推測(cè)也是一種重要的方法[17-18]。

本研究構(gòu)建一種具有紅色熒光蛋白（Rfp）和潮霉素抗性（HygR）基因表達(dá)框的啟動(dòng)子捕獲探針載體，Rfp基因無(wú)終止子，HygR基因帶有構(gòu)巢曲霉PtrpC啟動(dòng)子可自主表達(dá)。通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將表達(dá)框隨機(jī)整合到黑曲霉基因組中，以潮霉素抗性篩選出突變株[19]，根據(jù)紅色熒光效果獲得啟動(dòng)活性強(qiáng)的啟動(dòng)子，通過(guò)交錯(cuò)熱不對(duì)稱鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)獲得Rfp上游未知啟動(dòng)子序列[20]，并以5′端缺失法對(duì)獲得的啟動(dòng)子進(jìn)行鑒定[21-22]，以期為絲狀真菌強(qiáng)啟動(dòng)子篩選提供一種可參考的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌菌株DH5α、農(nóng)桿菌菌株EHA105、黑曲霉菌株CGMCC 10142、pN1 質(zhì)粒[有紅色熒光蛋白基因（Rfp）、潮霉素抗性基因（HygR）和卡那霉素抗性基因（KanaR）]、p40 質(zhì)粒（在大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌中穩(wěn)定復(fù)制帶有KanaR）：天津科技大學(xué)生化過(guò)程與控制實(shí)驗(yàn)室保存；潮霉素B、抗生素卡那霉素、氨芐青霉素、噻孢霉素鈉：北京索來(lái)寶科技有限公司；Primer Star Max酶、限制性內(nèi)切酶、DNA 連接酶、Genome Walking Kit試劑盒、10 000 bp DNA marker、5 000 bp DNA marker：北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒：天根生化科技有限公司；2×Rapid Taq 酶：南京諾維贊生物科技有限公司；所有的引物均由金唯智生物科技有限公司合成，所用引物序列見表1。

表1 試驗(yàn)用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.2 培養(yǎng)基

1.3 主要儀器

ME104 電子天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；SW-CJ-ID 超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；TCL 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：中科院生物物理所技術(shù)公司；Champ Gel 6000 全自動(dòng)凝膠成像儀：北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；DYY-6C 電泳儀：北京六一儀器廠；Mastercycler X50PCR 儀：上海恒久醫(yī)療器械有限公司；SPX-250B-Z 生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BX50 正置熒光顯微鏡：上海奧林巴斯貿(mào)易有限公司。

1.4 方法

1.4.1 PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件見表2。

表2 PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件Table 2 PCR reaction system and conditions

1.4.2 啟動(dòng)子捕獲探針質(zhì)粒載體的構(gòu)建

在此次研究中,我們對(duì)70例股骨粗隆骨折患者進(jìn)行了分析,均是老年患者,為患者提供了針對(duì)性的護(hù)理,提供鎮(zhèn)痛和深靜脈血栓的護(hù)理,避免患者在接受治療的過(guò)程中出現(xiàn)并發(fā)癥,根據(jù)研究結(jié)果顯示,全部患者接受護(hù)理之后,共有65例順利的度過(guò)了圍手術(shù)期,有5例患者在治療階段有并發(fā)癥產(chǎn)生,經(jīng)過(guò)護(hù)理人員針對(duì)性的積極的護(hù)理,患者均痊愈,全部患者順利康復(fù)出院。

啟動(dòng)子捕獲探針質(zhì)粒載體pN3 的構(gòu)建方法見圖1。

圖1 pN3 質(zhì)粒構(gòu)建Fig.1 Construction of pN3 plasmid

由圖1 可知，首先以pN1 質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的接頭引物Rfp-C-F 和Hyg-C-R 擴(kuò)增Rfp-PtrpC-HygR片段，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并根據(jù)試劑盒說(shuō)明書切膠回收；對(duì)切膠回收產(chǎn)物即回收片段和p40質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶HindШ、KpnI 進(jìn)行雙酶切，再用連接酶進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆酶切驗(yàn)證并進(jìn)行測(cè)序，將啟動(dòng)子捕獲探針質(zhì)粒載體命名為pN3。

1.4.3 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑曲霉轉(zhuǎn)化及突變株的篩選

將含有目的片段的質(zhì)粒使用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105 感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)卡那霉素抗性篩選單菌落并通過(guò)PCR 驗(yàn)證，將正確轉(zhuǎn)化子與黑曲霉CGMCC 10142 共同培養(yǎng)，將2×107個(gè)/mL 的新鮮黑曲霉孢子與100 μL 的OD600=0.8 的驗(yàn)證正確的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子混合，涂布于0.45 μm 的Hybond N+濾膜上，置于IM 培養(yǎng)基表面，25 ℃培養(yǎng)箱共培養(yǎng)48 h。將共培養(yǎng)完成后的菌體洗脫至含有150 μg/mL 潮霉素B 的CM 平板進(jìn)行初步篩選，35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d，長(zhǎng)出的單菌落可能為獲得Rfp-PtrpC-HygR片段插入的突變株，將這些單菌落挑取轉(zhuǎn)接至潮霉素濃度更高的CM 平板復(fù)篩。

1.4.4 黑曲霉突變株的熒光測(cè)定

將黑曲霉菌株于CM 培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)24 h，黑曲霉突變株M-pglaA 于糖誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)，挑取CM培養(yǎng)基上適量的突變株幼嫩菌絲至載玻片，放置在正置熒光顯微鏡的載物臺(tái)上，高倍鏡觀察菌絲形態(tài)。在黑暗環(huán)境中找到清晰的菌絲后選擇綠色激發(fā)光觀察[14]。

1.4.5 黑曲霉突變株Rfp 基因上游序列的獲取

提取具有紅色熒光的黑曲霉突變株的基因組，PCR 驗(yàn)證插入片段Rfp-PtrpC-HygR正確后，再以該突變株基因組為模板，通過(guò)交錯(cuò)熱不對(duì)稱鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)擴(kuò)增出插入片段上游未知啟動(dòng)子序列，并進(jìn)行測(cè)序；根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物P1-F 和P1-R 驗(yàn)證啟動(dòng)子和Rfp-PtrpC-HygR片段的共線性；將測(cè)序結(jié)果與Rfp序列進(jìn)行比對(duì)，獲得未知啟動(dòng)子序列；將獲得的序列于NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確定該啟動(dòng)子所啟動(dòng)表達(dá)的基因，選取該基因上游啟動(dòng)子區(qū)作為進(jìn)一步研究對(duì)象。

1.4.6 啟動(dòng)子5′端缺失質(zhì)粒構(gòu)建

Pgh啟動(dòng)子5′端缺失質(zhì)粒和pglaA 質(zhì)粒構(gòu)建思路如圖2 所示。

圖2 Pgh 啟動(dòng)子5′端缺失質(zhì)粒和pglaA 質(zhì)粒構(gòu)建Fig.2 Construction of Pgh 5′deletion and pglaA plasmids

構(gòu)建Pgh啟動(dòng)子5′端缺失質(zhì)粒思路如下：首先構(gòu)建pG1 質(zhì)粒即包括完整的Pgh啟動(dòng)子，以Ku70基因序列為同源臂，中間插入Pgh啟動(dòng)子、Rfp基因和HygR基因。pG1 質(zhì)粒構(gòu)建成功后，以其為母本繼續(xù)構(gòu)建pG2、pG3、pG4、pG5、pG6 質(zhì)粒、依次對(duì)Pgh啟動(dòng)子進(jìn)行5′端缺失。pG1 質(zhì)粒具體構(gòu)建方法如下：以黑曲霉菌株CGMCC 10142 基因組為模板，以引物Ku70F-F和Ku70F-R 擴(kuò)增Ku70F；以引物Ku70R-F 和Ku70R-R擴(kuò)增Ku70R；以引物K-PgH-F 和PgH-r-R 擴(kuò)增Pgh啟動(dòng)子；以pN3 質(zhì)粒為模板，以引物P-Rfp-F 和HYG-KR 擴(kuò)增片段Rfp-PtrpC-HygR。將擴(kuò)增得到的Ku70F和Pgh啟動(dòng)子通過(guò)PCR 融合獲得片段ku70F-Pgh，再將獲得的Rfp-PtrpC-HygR和Ku70R通過(guò)PCR 融合獲得片段Rfp-PtrpC-HygR-Ku70R，最后將兩片段通過(guò)融合PCR 獲得最終片段。將該目的片段和p40 質(zhì)粒通過(guò)BamHI 和HindШ 進(jìn)行雙酶切連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，PCR 和雙酶切驗(yàn)證正確后用于pG2、pG3、pG4、pG5、pG6 和pglaA 質(zhì)粒的構(gòu)建。分別以pG1 質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增Pg2/Pg3/Pg4/Pg5/Pg6-Rfp-PtrpC-HygRKu70R，SpeI 和KpnI 雙酶切pG1 質(zhì)粒作為載體、Pg2/Pg3/Pg4/Pg5/Pg6-Rfp-PtrpC-HygR-Ku70R并使用T4連接酶連接載體和片段，化轉(zhuǎn)至大腸桿菌DH5α，PCR和雙酶切驗(yàn)證正確后用于下一步試驗(yàn)。以出發(fā)菌株基因組為模板擴(kuò)增糖化酶啟動(dòng)子（PglaA：848 bp），與從pG1 質(zhì)粒擴(kuò)增的Rfp-PtrpC-HygR-Ku70R融合獲得片段PglaA-Rfp-PtrpC-HygR-Ku70R，以相同的方式構(gòu)建pglaA 質(zhì)粒。

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動(dòng)子捕獲探針質(zhì)粒載體pN3 的構(gòu)建

pN3 質(zhì)粒探針和其黑曲霉突變株篩選及PCR 驗(yàn)證見圖3。

圖3 pN3 質(zhì)粒PCR 驗(yàn)證Fig.3 PCR validation of pN3 plasmid

由圖3 可知，按照1.4.2 所述方法構(gòu)建pN3 質(zhì)粒，并進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，結(jié)果與預(yù)期一致，探針質(zhì)粒pN3 構(gòu)建完成。

2.2 pN3 質(zhì)粒黑曲霉突變株的篩選與驗(yàn)證

pN3 質(zhì)粒黑曲霉突變株的篩選與驗(yàn)證結(jié)果見圖4。

圖4 pN3 質(zhì)粒探針黑曲霉突變株篩選及PCR 驗(yàn)證Fig.4 Screening and PCR validation of Aspergillus niger mutants with pN3 plasmid probe

通過(guò)潮霉素抗性對(duì)pN3 質(zhì)粒黑曲霉突變株進(jìn)行篩選并對(duì)篩選到的黑曲霉突變體進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，具體方法如下：提取大腸桿菌DH5α 中的pN3 質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌EHA105，由其介導(dǎo)整合到黑曲霉菌株CGMCC 10142 基因組中，以150 μg/mL 潮霉素篩選突變株，初步篩選出具有潮霉素抗性的327 個(gè)突變株，從這些突變株隨機(jī)挑選出32 個(gè)于250 μg/mL 潮霉素B的CM 培養(yǎng)基平板上35 ℃培養(yǎng)72 h，選取潮霉素抗性強(qiáng)的13 個(gè)突變株的基因組進(jìn)行PCR 驗(yàn)證Rfp-HygR片段，得到7 株P(guān)CR 驗(yàn)證正確的突變株，巢氏PCR 擴(kuò)增HygR片段進(jìn)一步驗(yàn)證這7 株突變株的正確性，均為正確隨機(jī)插入突變株。

2.3 pN3 質(zhì)粒黑曲霉突變體的熒光測(cè)定

pN3 質(zhì)粒黑曲霉突變體的熒光測(cè)定結(jié)果見圖5。

圖5 黑曲霉突變株M-pN3 菌絲熒光觀察Fig.5 Fluorescence detection of Aspergillus niger mutant M-pN3

對(duì)PCR 驗(yàn)證正確的7 株突變株進(jìn)行正置熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)12 號(hào)突變株菌絲具有相對(duì)較強(qiáng)的紅色熒光特征，其余6 株突變株紅色熒光強(qiáng)度都比12 號(hào)突變株弱或者觀測(cè)不到熒光，原因是HygR基因具有啟動(dòng)子，能夠自主表達(dá)，存在HygR基因隨機(jī)整合到黑曲霉基因組的可能，出現(xiàn)潮霉素抗性但無(wú)紅色熒光表型，因此以紅色熒光強(qiáng)度作為篩選啟動(dòng)子的報(bào)告基因，將12 號(hào)突變株其命名為M-pN3。

2.4 M-pN3 菌株報(bào)告基因上游啟動(dòng)子的獲得與分析

Tail-PCR 擴(kuò)增M-pN3 突變株Rfp-PtrpC-HygR片段上游未知序列結(jié)果見圖6。

圖6 Tail-PCR 擴(kuò)增M-pN3 突變株Rfp-PtrpC-HygR 片段上游未知序列Fig.6 Amplification of the upstream unknown sequence of Rfp-PtrpC-HygR of M-pN3 by Tail-PCR

以下游特異性引物SP1、SP2、SP3，上游非特異性引物AP1、AP2、AP3、AP4（試劑盒提供，序列未知）通過(guò)Tail-PCR 獲得M-pN3 基因組插入片段Rfp-PtrpCHygR上游序列，回收第三輪擴(kuò)增的明亮的條帶并進(jìn)行測(cè)序并使用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該段序列與A.nigerCBS513.88 數(shù)據(jù)庫(kù)公布的A.nigerAn08g05220 序列（基因ID：AM270168.1）同源性高達(dá)100%。根據(jù)比對(duì)結(jié)果追溯其下游序列，通過(guò)與A.nigerCBS513.88 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，得知該序列下游為An08g05230 基因序列，編碼糖苷水解酶基因。因此將得到的糖苷水解酶編碼基因上游的序列截取1 500 bp 的長(zhǎng)度命名為Pgh啟動(dòng)子。

Pgh啟動(dòng)子序列分析見圖7。

圖7 Pgh 啟動(dòng)子序列分析Fig.7 Sequence analysis of Pgh promoters

將Pgh啟動(dòng)子利用啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件Promoter 2.0進(jìn)行預(yù)測(cè)，并根據(jù)已報(bào)道的啟動(dòng)子元件序列對(duì)Pgh啟動(dòng)子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子有很大的可能性具有啟動(dòng)活性。對(duì)Pgh啟動(dòng)子進(jìn)行分析：Pgh啟動(dòng)子中含有啟動(dòng)子通用元件TATA 框，多個(gè)CAAT-box、CT-box、GCbox 和多個(gè)誘導(dǎo)型元件，且具有黑曲霉啟動(dòng)子通用序列CTTCTC，具體元件類型和位置見表3。

表3 Pgh 啟動(dòng)子元件分析Table 3 Analysis of Pgh promoter components

2.5 Pgh 啟動(dòng)子5′端缺失質(zhì)粒及pglaA 質(zhì)粒的構(gòu)建

首先構(gòu)建pG1 質(zhì)粒即包括完整的Pgh啟動(dòng)子，以Ku70基因序列為同源臂，中間插入Pgh啟動(dòng)子、Rfp基因和HygR基因。pG1 質(zhì)粒構(gòu)建成功后，以其為模板繼續(xù)構(gòu)建pG2、pG3、pG4、pG5 和pG6 質(zhì)粒，依次對(duì)Pgh啟動(dòng)子進(jìn)行5′端缺失并將pG1 質(zhì)粒的Pgh啟動(dòng)子替換為PglaA構(gòu)建pglaA 質(zhì)粒。

2.6 pG 系列質(zhì)粒黑曲霉菌株突變株的篩選

pG1～6 質(zhì)粒黑曲霉突變株的PCR 驗(yàn)證結(jié)果見圖8。

圖8 pG1～6 質(zhì)粒黑曲霉突變株的PCR 驗(yàn)證Fig.8 PCR validation of Aspergillus niger mutants with pG1-6 plasmids

由圖8 可知，對(duì)獲得的質(zhì)粒pG1～6 的黑曲霉突變體提取基因組進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，驗(yàn)證引物均為Ku70F-F和Ku70R-R，正確的突變株命名為M-pG1～6。

以Ku70為表達(dá)框Rfp-PtrpC-HygR的左右臂，構(gòu)建pG1～6 質(zhì)粒探針目的是將其表達(dá)框同源重組在同一位點(diǎn)上，使試驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確，但是由于黑曲霉獲得同源重組突變株異常困難，pG1～6 質(zhì)粒表達(dá)框均未成功整合到Ku70位點(diǎn)。

2.7 pG 系列質(zhì)粒黑曲霉菌株突變株熒光觀察及其潮霉素抗性驗(yàn)證

黑曲霉突變體菌絲熒光觀察及其潮霉素抗性驗(yàn)證結(jié)果見圖9。

圖9 黑曲霉突變體菌絲熒光觀察及其潮霉素抗性驗(yàn)證Fig.9 Mycelial fluorescence detection and hygromycin resistance verification of Aspergillus niger mutants

將突變株接種于CM 固體培養(yǎng)基上，35 ℃培養(yǎng)24 h，在正置熒光顯微鏡下觀察菌絲紅色熒光，結(jié)果如圖9A 所示，M-pG1 和M-pG2 突變株菌絲有較強(qiáng)的紅色熒光，與對(duì)照突變株M-pglaA 的紅色熒光強(qiáng)度無(wú)顯著差異，M-pG3 突變株菌絲紅色熒光較弱，M-pG4 突變株菌絲紅色熒光微弱，M-pG5 和M-pG6 突變株菌絲未檢測(cè)到紅色熒光，表明pG5 和pG6 序列不具有啟動(dòng)活性或者啟動(dòng)活性極低，將M-pglaA、M-pG1～M-pG6 各黑曲霉突變株成熟孢子點(diǎn)種于250 μg/mL 潮霉素B 的CM 固體培養(yǎng)基上35 ℃培養(yǎng)48 h，結(jié)果如圖9B 所示。各突變株潮霉素抗性生長(zhǎng)情況與紅色熒光表達(dá)存在極好相關(guān)性，其中M-pglaA、M-pG1、M-pG2 紅色熒光較強(qiáng)，其抗潮霉素生長(zhǎng)情況較好，48 h 菌落直徑一致且長(zhǎng)出孢子，相對(duì)于上述3 株菌M-pG3 紅色熒光弱，其抗潮霉素生長(zhǎng)情況也表現(xiàn)出菌落小且不產(chǎn)孢子，而MpG4 紅色熒光微弱，表現(xiàn)出在250 μg/mL 濃度抗潮霉素條件下無(wú)法生長(zhǎng)，M-pG5 和M-pG6 突變株完全不萌發(fā)故未放置圖片。這些結(jié)果表明：通過(guò)5′端缺失所得到的不同啟動(dòng)子區(qū)域序列，其啟動(dòng)表達(dá)紅色熒光蛋白活性與其潮霉素抗性具有明確正相關(guān)性，由此推斷潮霉素抗性基因不僅可以作為篩選標(biāo)記，也可以作為副報(bào)告基因來(lái)評(píng)價(jià)黑曲霉啟動(dòng)子的啟動(dòng)效果。

3 討論

關(guān)于利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA 隨機(jī)插入法捕獲啟動(dòng)子，目前僅在水稻和小麥等植物和很少的真菌中有報(bào)道[24-25]。本研究構(gòu)建了Rfp報(bào)告基因和HygR篩選標(biāo)記的質(zhì)粒探針pN3，通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將表達(dá)框隨機(jī)整合到黑曲霉基因組中，通過(guò)潮霉素抗性對(duì)突變株篩選，再通過(guò)PCR 對(duì)突變株基因型驗(yàn)證，對(duì)驗(yàn)證正確的突變株進(jìn)行紅色熒光觀察，獲得了一株能在300 μg/mL濃度潮霉素的CM 平板上生長(zhǎng)產(chǎn)孢且菌絲紅色熒光強(qiáng)的M-pN3 突變株。根據(jù)本課題組長(zhǎng)期使用潮霉素作為黑曲霉突變體篩選標(biāo)記的經(jīng)驗(yàn)，在黑曲霉中，上游基因的啟動(dòng)子會(huì)對(duì)與其串聯(lián)的下游基因的表達(dá)起到一定的促進(jìn)作用，啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性越強(qiáng)，對(duì)下游基因的表達(dá)促進(jìn)作用越大。根據(jù)這個(gè)發(fā)現(xiàn)，設(shè)計(jì)了啟動(dòng)子捕獲探針pN3，通過(guò)250 μg/mL 較高濃度潮霉素對(duì)初篩獲得的突變株復(fù)篩，以捕獲具有較強(qiáng)啟動(dòng)活性的啟動(dòng)子。本研究中，通過(guò)250 μg/mL 潮霉素濃度復(fù)篩獲得13 株突變體，經(jīng)PCR 驗(yàn)證有7 株突變株成功整合表達(dá)框到基因組中，整合效率為53.8%。

Tail-PCR 法是獲得基因組中已知基因序列側(cè)翼序列最常用的方法，陳璨[26]通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，利用Tail-PCR 技術(shù)擴(kuò)增出多個(gè)紅曲霉突變體T-DNA 側(cè)翼序列，并通過(guò)測(cè)序和比對(duì)獲得這些序列的詳細(xì)信息。本研究通過(guò)Tail-PCR 獲得M-pN3 突變株Rfp-PtrpCHygR表達(dá)框上游未知啟動(dòng)子序列，將測(cè)序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，確定該序列位于黑曲霉CBS 513.88 糖苷水解酶上游的啟動(dòng)子區(qū)，獲取該基因起始密碼子上游1 500 bp 序列命名為Pgh啟動(dòng)子。為進(jìn)一步研究Pgh啟動(dòng)子，我們采用了簡(jiǎn)單而高效的5′端缺失法構(gòu)建探針質(zhì)粒pg1～6 對(duì)其進(jìn)一步分析，Xiao等[27]曾利用5′端缺失法分析PsrbB啟動(dòng)子，確定-1 024 ～-588 bp 為其具有缺氧誘導(dǎo)活性的核心區(qū)域。根據(jù)5′端缺失啟動(dòng)子突變體的紅色熒光觀察結(jié)果，啟動(dòng)子Pgh的-1 066～-766 bp 區(qū)域能極大增強(qiáng)啟動(dòng)子啟動(dòng)活性，結(jié)合啟動(dòng)子元件分析可以發(fā)現(xiàn)這段序列中有較多CAAT-box 和一個(gè)CT-motif，這兩種元件是絲狀真菌啟動(dòng)子重要元件[28]；而在-766～-433 bp 和-433～226 bp 間各有一個(gè)CAAT-box 和GC-box，而在對(duì)照黑曲霉啟動(dòng)子PglaA中同樣具有GC-box、多個(gè)CAAT-box 和CTmotif，這些結(jié)果證明黑曲霉啟動(dòng)子PPgh是一個(gè)較強(qiáng)的啟動(dòng)子，CAAT-box、CT motif 和GC-box 是黑曲霉強(qiáng)啟動(dòng)子中必要的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)元件。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)啟動(dòng)子捕獲探針pN3 篩選出一株具有正確T-DNA 隨機(jī)插入、菌絲具有較強(qiáng)熒光特征且具有較高潮霉素抗性的突變菌株，通過(guò)交錯(cuò)熱不對(duì)稱鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)獲得T-DNA 側(cè)翼啟動(dòng)子序列Pgh，并通過(guò)5′端缺失法確定了-1 066～-766 bp 區(qū)域?yàn)槠鋯?dòng)核心區(qū)域。pN3 啟動(dòng)子探針捕獲質(zhì)粒為黑曲霉及其他絲狀真菌天然強(qiáng)啟動(dòng)子捕獲提供一個(gè)簡(jiǎn)單的工具，也可用于其他絲狀真菌啟動(dòng)子的篩選鑒定，同時(shí)為進(jìn)一步構(gòu)建黑曲霉雜合啟動(dòng)子奠定基礎(chǔ)。