朱璐　李淑順　聞婧　馬秋月　顏坤元　李倩中

摘要：雞爪槭新品種金陵丹楓葉色絢爛，是優(yōu)質(zhì)的彩葉樹種。以金陵丹楓帶芽莖段為外植體，75%乙醇40s+0.1%氯化汞20min消毒效果最佳。以NN69為基本培養(yǎng)基，篩選獲得最適宜的啟動培養(yǎng)基為NN69+0.1mg/LIBA，增殖培養(yǎng)基為NN69+0.4mg/LKT+0.1mg/LIBA，生根培養(yǎng)基為NN69+0.3mg/LIBA。探討了金陵丹楓不定芽對羧芐青霉素和潮霉素的敏感性，篩選獲得羧芐青霉素的臨界值為300～400mg/L，潮霉素的臨界值為2.5mg/L。

關(guān)鍵詞：金陵丹楓;再生體系;羧芐青霉素;潮霉素

中圖分類號：S792.350.5文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）01-0054-05

作者簡介：朱璐（1987—），女，山東淄博人，博士，助理研究員，研究方向為雞爪槭遺傳育種。E-mail：luzhu@jaas.ac.cn。

通信作者：李倩中，研究員，研究方向為槭樹新品種選育及種質(zhì)資源利用。E-mail：qianzhongli@jaas.ac.cn。

金陵丹楓是槭樹科槭屬植物雞爪槭（Acerpalmatum）的一個園藝品種，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)過多年選育而成[1]。其葉片掌狀5～7裂，葉片邊緣具有重鋸齒，葉基部近心臟形，新葉為亮紅色，觀賞期達100d以上。金陵丹楓已獲得江蘇省林木良種認定證書和植物新品種權(quán)證書;可孤植、群植或作為高檔盆栽用，具有極高的觀賞和應用價值。

在金陵丹楓種苗的生產(chǎn)中，通常采用嫁接的方式，但是嫁接成活率受多種外界因素影響較大，如砧木和接穗的質(zhì)量，嫁接季節(jié)和溫度、濕度等，不利于大規(guī)模生產(chǎn)[2]。金陵丹楓扦插不易生根，繁殖較困難，因此亟待建立金陵丹楓的組培再生體系，解決批量生產(chǎn)的問題。目前，國內(nèi)雖有少量雞爪槭品種已建立了組培再生體系，如金陵黃楓、赤楓、日本紅楓等[3-6]，但是不同品種的雞爪槭對不同培養(yǎng)基和植物激素的適應性差異很大，還需要針對不同品種研究其適宜的組培繁殖技術(shù)。

本研究以金陵丹楓當年生枝條作為外植體，通過啟動培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)等階段，篩選最適宜金陵丹楓生長的激素濃度，同時還研究了金陵丹楓不定芽對不同濃度的羧芐青霉素（carbenicillin，簡稱Carb）和潮霉素（hygromycin，簡稱Hyg）的敏感性，以期為金陵丹楓轉(zhuǎn)基因體系的建立提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

雞爪槭品種金陵丹楓健康無病害的當年新鮮枝條，采集于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院槭樹良種基地。試驗于2019年5月開始進行，試驗地點為江蘇省農(nóng)業(yè)科學院休閑農(nóng)業(yè)研究所實驗室。[LM]

1.2培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基為NN69，購于北京酷來搏科技有限公司，添加蔗糖20g/L、瓊脂5g/L，調(diào)整pH值至5.7。其他試劑均購于北京索萊寶科技有限公司。本試驗光照強度為100μmol/（m2·s），光周期為16h—8h（光照—黑暗），溫度為（25±2）℃。

1.3試驗方法

1.3.1外植體消毒

將采集到的金陵丹楓當年生新鮮枝條剪去葉片，切取約3cm的帶芽莖段，用洗潔劑清洗，自來水流水沖洗1h。使用75%乙醇和0.1%氯化汞組合消毒不同時間，同時添加0.2%Tween-20，消毒完畢后使用無菌水漂洗3次，在無菌濾紙上晾干表面水分后，接種到NN69培養(yǎng)基中，每瓶接種3個外植體，每個處理重復3次。隨時觀察其污染率，防止交叉感染，篩選最佳外植體消毒時間。

1.3.2啟動培養(yǎng)

將上述獲得的無菌外植體分別接種到含有不同生長素（IAA、IBA、NAA、6-BA和TDZ）不同濃度配比的NN69培養(yǎng)基中（表2），培養(yǎng)45d后，統(tǒng)計腋芽誘導率，觀察腋芽萌動及后續(xù)生長狀況。每個處理重復3次，篩選最佳啟動培養(yǎng)基。

1.3.3增殖培養(yǎng)

將生長狀況良好、長約1cm的腋芽剪下，放入含有不同濃度的細胞分裂素（6-BA和KT）和生長素（IBA和NAA）配比的NN69培養(yǎng)基中，培養(yǎng)45d后統(tǒng)計平均增殖系數(shù)。每個處理重復3次，篩選最佳增殖培養(yǎng)基。

1.3.4生根培養(yǎng)

將經(jīng)過增殖培養(yǎng)獲得的約1cm叢生芽分別剪下，轉(zhuǎn)移到含有不同濃度生長素IAA（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L）、IBA（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L）和NAA（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L）配比的NN69培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30d后統(tǒng)計生根數(shù)及平均根長。每個處理重復3次，篩選獲得最佳生根培養(yǎng)基。

1.3.5羧芐青霉素（Carb）抗性試驗

選取增殖培養(yǎng)基上獲得的生長狀況良好的健壯不定芽接種到含有不同濃度Carb（0、100、200、300、400、500、600、700mg/L）的增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)45d后統(tǒng)計不定芽的誘導率及平均增殖系數(shù)，同時觀察不定芽的成活率及生長狀況。每個處理重復3次，每個處理50個芽。

1.3.6潮霉素（Hyg）抗性試驗

選取增殖培養(yǎng)基上獲得的生長狀況良好的健壯不定芽接種到含有不同濃度Hyg（0、2.5、5.0、7.5、10、12.5、15.0、17.5mg/L）的增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)45d后統(tǒng)計不定芽的增值率及增殖系數(shù)，同時觀察不定芽的成活率及生長狀況。每個處理重復3次，每個處理50個芽。

1.4數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel2016和SPSS19.0進行統(tǒng)計整理及分析，差異顯著性采用ANOVA分析，Duncans檢驗（P<0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1不同消毒處理對外植體的影響

將田間采集的外植體莖段用不同的消毒時間進行處理（表1）。[JP+1]金陵丹楓外植體使用75%乙醇消毒40s和0.1%氯化汞消毒20min的組合處理時，既能保證金陵丹楓外植體具有較低的污染率（17.6%），又能保持較高的腋芽萌發(fā)率（90.3%）。因此，選用該處理對金陵丹楓外植體消毒效果最佳。

2.2不同激素配比對外植體啟動培養(yǎng)的影響

將無菌外植體接種到不同激素配比的NN69培養(yǎng)基中，接種約10d后腋芽開始萌動，同時莖基部開始形成愈傷組織。接種45d后統(tǒng)計腋芽誘導率（表2），在NN69培養(yǎng)基中添加單種激素對金陵丹楓外植體啟動培養(yǎng)的影響顯著優(yōu)于同時添加多種激素。其中添加IBA濃度為0.1mg/L時，腋芽誘導率最高，為（90.6±3.1）%，腋芽生長快且長勢健壯。最終選擇該培養(yǎng)基為金陵丹楓最佳培養(yǎng)基。

2.3不同激素配比對芽增殖培養(yǎng)的影響

將無菌外植體在啟動培養(yǎng)基上生長的腋芽剪下，放入不同激素濃度配比的NN69培養(yǎng)基中培養(yǎng)45d后，統(tǒng)計觀察腋芽平均增殖系數(shù)（增殖系數(shù)=產(chǎn)生的叢生芽數(shù)/接種的腋芽數(shù)×100%）。統(tǒng)計結(jié)果見表3，金陵丹楓腋芽在不同激素組合的增殖培養(yǎng)基中的平均增殖系數(shù)差異顯著。6-BA和IBA組合的平均增殖系數(shù)為3.1～3.6，TDZ和IBA組合的平均增殖系數(shù)為2.2～2.9，KT和IBA組合的平均增殖系數(shù)為6.2～8.3，明顯優(yōu)于其他激素組合。其中在添加0.4mg/LKT和0.1mg/LIBA的NN69培養(yǎng)基中腋芽的增殖系數(shù)最高，為8.3，顯著高于添加其他激素組合的培養(yǎng)基，且該培養(yǎng)基上生長的叢生芽狀態(tài)良好，長勢健壯，利于進行生根培養(yǎng)。

2.4不同濃度生長素對生根的影響

將在增殖培養(yǎng)基上產(chǎn)生的叢生芽剪下，分別轉(zhuǎn)移到含有不同生長素濃度的NN69培養(yǎng)基中，觀察統(tǒng)計不定芽的生根狀況。試驗結(jié)果顯示，金陵丹楓不定芽在添加不同生長素的培養(yǎng)基中生根狀況差異顯著。在添加IAA的培養(yǎng)基上，生根率僅為55.9%～65.4%，平均根系量僅為2.5～3.7，平均根長僅為1.9～2.9cm。在添加IBA的培養(yǎng)基上，生根率顯著升高，為75.9%～95.6%，平均根系量為4.3～7.1條，平均根長為3.0～3.9cm。在添加NAA的培養(yǎng)基上，生根率僅為67.8%～80.1%，平均根系量僅為3.1～3.9條，平均根長僅為2.3～2.9cm。不定芽在添加0.3mg/LIBA的培養(yǎng)基上，生根率最高，平均根系量和平均根長最大，小苗長勢最好（表4）。雞爪槭金陵丹楓叢生芽分化及生根情況見圖1。

2.5不同濃度的羧芐青霉素對誘導叢生芽的影響

抗生素Carb可以有效抑制農(nóng)桿菌的生長，同時也會抑制叢生芽的誘導和增殖。隨著Carb濃度的增高，金陵丹楓叢生芽的誘導率和平均增殖系數(shù)顯著降低（表5），表明金陵丹楓叢生芽對Carb非常敏感。Carb濃度為700mg/L時，叢生芽誘導率僅為45.9%，且叢生芽基本停止增殖。

2.6不同濃度的潮霉素對誘導叢生芽的影響

抗生素Hyg在遺傳轉(zhuǎn)化篩選過程中起著重要作用。Hyg也會抑制叢生芽的誘導和增殖，甚至會導致叢生芽白化死亡。Hyg對金陵丹楓叢生芽的生長影響尤為明顯。當Hyg濃度為10.0mg/L時，叢生芽的誘導率僅為20.3%，且叢生芽幾乎不增殖。當Hyg濃度為12.5mg/L時，叢生芽不被誘導，且20.6%叢生芽出現(xiàn)白化死亡現(xiàn)象（表6）。

3結(jié)論與討論

組培再生技術(shù)具有繁殖速度快、繁殖系數(shù)大、繁殖后代整齊一致等優(yōu)點，被廣泛應用于各種植物種苗繁育中。但是由于物種之間的差異，許多木本植物仍面臨組培再生困難的問題。本研究以雞爪槭金陵丹楓為研究對象，建立了組培再生技術(shù)體系。以當年生枝條為外植體，75%乙醇消毒40s，0.1%氯化汞消毒20min，流水沖洗后接種到NN69+0.1mg/LIBA的培養(yǎng)基上進行啟動培養(yǎng)，誘導腋芽萌發(fā)。將萌發(fā)的腋芽切下，接種到NN69+0.4mg/LKTNN69+0.1mg/LIBA的培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，誘導產(chǎn)生叢生芽。從產(chǎn)生的叢生芽切下的單個不定芽接種到NN69+0.3mg/LIBA的培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，長成帶根小苗后可以移栽到穴盤。通過金陵丹楓不定芽對羧芐青霉素和潮霉素的敏感性的研究，發(fā)現(xiàn)當Carb濃度為700mg/L或者Hyg濃度為10mg/L時，叢生芽基本停止增殖。

進行組培再生體系的建立第1步是要解決外植體的污染問題。由于本試驗的外植體取自大田的當年生枝條，附生菌較多，故采用了75%乙醇消毒和0.1%氯化汞消毒組合消毒的方式，這與前人的研究結(jié)果[3]一致。在組培過程中，常用的基本培養(yǎng)基有MS[7]、WPM[8]、NN69[9]、B5[10]、White[11]等，不同基本培養(yǎng)基對槭屬植物再生體系的建立具有重要影響。雞爪槭赤楓使用了MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基[4]，日本紅楓青龍使用了WPM培養(yǎng)基[5]，雞爪槭金陵黃楓使用了NN69培養(yǎng)基[3]。本試驗也選擇NN69作為基本培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。植物生長調(diào)節(jié)劑是組培再生體系建立過程中不可或缺的物質(zhì)，其種類、濃度和配比等是誘導腋芽生長、腋芽增殖和不定芽生根的關(guān)鍵因子[12-13]。雞爪槭赤楓[4]、復葉槭[13]、紅翅槭[14]和尖尾槭[15]均采用了6-BA和IAA的組合實現(xiàn)了腋芽的增殖。雞爪槭金陵黃楓利用TDZ和NAA組合使用時，腋芽增殖系數(shù)最高[3]。日本紅楓青龍在TDZ和IBA組合中增殖最快[5]。這說明槭屬植物對激素種類和濃度的感知具有較大差異，不同基因型的槭屬植物需要不同激素濃度和配比。

羧芐青霉素對根癌農(nóng)桿菌具有很好的抑制作用，但是高濃度的羧芐青霉素會抑制不定芽的生長和增殖，濃度過低又不足以抑制農(nóng)桿菌生長。在貢菊葉片誘導不定芽的過程中，當羧芐青霉素為250mg/L時，不定芽的誘導不受影響[16]。藍莓與樹莓在分化階段羧芐青霉素的臨界值為200～300mg/kg[17]。金陵丹楓不定芽對羧芐青霉素的臨界值則為300～400mg/L。在轉(zhuǎn)基因體系建立過程中，潮霉素作為抗性篩選標記具有重要作用。潮霉素濃度過高會導致植物細胞死亡，嚴重抑制植株生長。不同物種對潮霉素的敏感性差異巨大。巨霸楊對潮霉素臨界濃度為4～6mg/L[18]。甘蔗在愈傷組織形成過程中，潮霉素的篩選濃度為30mg/L[19]。[JP3]金陵丹楓不定芽對潮霉素較為敏感，潮霉素濃度為2.5mg/L時，已經(jīng)影響叢生芽的誘導率和增殖系數(shù)。

本研究建立了雞爪槭金陵丹楓組培再生體系，為大量工廠化育苗提供了技術(shù)支撐;并且開展了不定芽對羧芐青霉素和潮霉素的抗性試驗，篩選出了臨界濃度，以期為金陵丹楓遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和優(yōu)化提供參考，同時為進一步目的基因?qū)牒头肿舆z傳育種改良奠定了基礎(chǔ)。

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