李 晶， 林雄杰， 林冬梅， 魯國東， 林占熺*

(1.國家菌草工程技術(shù)研究中心， 福建 福州 350002； 2.福建農(nóng)林大學(xué) 菌草研究所， 福建 福州 350002； 3.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 果樹研究所， 福建 福州 350013)

PEG-CaCl2介導(dǎo)牛樟芝遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建

李 晶1，2， 林雄杰3， 林冬梅1，2， 魯國東1， 林占熺1，2*

(1.國家菌草工程技術(shù)研究中心， 福建 福州 350002； 2.福建農(nóng)林大學(xué) 菌草研究所， 福建 福州 350002； 3.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 果樹研究所， 福建 福州 350013)

為建立穩(wěn)定的牛樟芝(Antrodiacinnamomea)遺傳轉(zhuǎn)化體系，同時篩選出適宜介導(dǎo)牛樟芝原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的PEG-CaCl2濃度。利用潮霉素抗性、綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)標記和PCR擴增驗證擬轉(zhuǎn)化子。結(jié)果表明：新鮮的牛樟芝菌絲體在10 mg/mL溶壁酶溶液中，30℃條件下酶解4 h，原生質(zhì)體的獲得率為3.55×105個/mL；菌絲體和原生質(zhì)體在潮霉素B濃度分別為60 μg/mL和40 μg/mL時不能生長，最終確定篩選擬轉(zhuǎn)化子的潮霉素B濃度為60 μg/mL；濃度為20%～40%的PEG均可介導(dǎo)牛樟芝原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，且40%的PEG轉(zhuǎn)化效率最高。

牛樟芝； 原生質(zhì)體； 聚乙二醇； 潮霉素B； 重組子

真菌是世界第二大類生物，主要分成微生物和大型真菌(食、藥用菌)兩類[1]。牛樟芝(Antrodiacinnamomea)是我國臺灣特有的珍稀藥用菌，屬擔子菌門(Basidiomycota)、多孔菌目(Polyporales)、白肉迷孔菌科(Fomitopsidaceae)、薄孔菌屬(Antrodia)，最早發(fā)現(xiàn)生長在腐爛的空心牛樟樹(Cinnamomumkanehirai)內(nèi)壁，長期以來，牛樟樹被認為是牛樟芝的唯一宿主[2-3]。牛樟芝味苦，含有大量的三萜類、酚類和多糖類等物質(zhì)[4]，對抗過敏、抗炎癥、抗氧化、抗腫瘤、保肝和提高免疫力等具有顯著功效[5-7]。

轉(zhuǎn)化是將外源DNA通過載體、媒介，以物理、化學(xué)等方法導(dǎo)入受體細胞，并完整表達的過程[8]；食藥用菌屬擔子菌類，難以被轉(zhuǎn)化。關(guān)于食藥用菌轉(zhuǎn)化的研究始于20世紀90年代，利用電擊和基因槍等不同轉(zhuǎn)化方法提高雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)[9]和楊樹菇(Agrocybeaegerita)[10]原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率，但外源DNA整合重組后活性較低，異源啟動子不能有效調(diào)控外源基因表達，易出現(xiàn)假陽性等現(xiàn)象。但隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，草菇[11-12]、香菇[13-14]、靈芝[15-16]、平菇[17]和猴頭菇[18]等經(jīng)濟菌類通過改進轉(zhuǎn)化技術(shù)均成功建立了遺傳轉(zhuǎn)化體系。綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)最早在水母中發(fā)現(xiàn)并分離，該蛋白在紫外光或藍光激發(fā)下發(fā)熒光，并發(fā)現(xiàn)其在無任何底物和輔助因子的情況下也能在活細胞中發(fā)熒光[19-21]，故用于細胞和蛋白質(zhì)標記。在牛樟芝遺傳轉(zhuǎn)化體系中，利用GFP標記的載體轉(zhuǎn)入牛樟芝原生質(zhì)體中，能快速篩選并確定轉(zhuǎn)化子，具有高效、穩(wěn)定等特征。

隨著牛樟芝的分類和生物學(xué)特性研究的不斷深入，陸續(xù)開展了其藥理學(xué)、質(zhì)量控制、栽培條件和分子生物學(xué)等方面的研究[22]，而牛樟芝分子生物學(xué)的前提條件是必需建立穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系。目前，李剛[23]建立靈芝原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系，并連續(xù)培養(yǎng)5代以上仍可以穩(wěn)定表達潮霉素抗性；張新濤等[24]建立了我國傳統(tǒng)藥用菌靈芝的遺傳轉(zhuǎn)化體系，但國內(nèi)外對牛樟芝遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究鮮見報道，筆者利用PEG-CaCl2介導(dǎo)建立的牛樟芝遺傳轉(zhuǎn)化體系，并通過GFP標記對其進行驗證，為深入開展分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株及質(zhì)粒 臺灣牛樟芝菌株AC 001(Genbank Accession NO.：KM925002)，由臺灣神農(nóng)真菌生物技術(shù)有限公司惠贈，保存于福建農(nóng)林大學(xué)菌草研究所；pCX62為含抗潮霉素抗性標記質(zhì)粒載體，pCT74為含抗潮霉素抗性和GFP標記質(zhì)粒載體[25]均由福建農(nóng)林大學(xué)功能基因組學(xué)研究中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基及常用溶液 牛樟芝液體培養(yǎng)基：葡萄糖25 g，蛋白胨5 g，麥芽糖3 g，酵母提取物3 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 1 g，維生素B11 g，蒸餾水定容至1 L，pH 5.5；牛樟芝固體培養(yǎng)基：葡萄糖25 g，蛋白胨5 g，麥芽糖3 g，酵母提取物3 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 1 g，維生素B11 g，瓊脂20～25 g，蒸餾水定容至1 L，pH 5.5；馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g(去皮切塊加水煮30 min，用紗布過濾取濾液)，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 L；TB3再生培養(yǎng)基：酸水解酪蛋白3 g，酵母提取物3 g，蔗糖200 g，蒸餾水定容到1 L，配制固體培養(yǎng)基時加入瓊脂粉10 g。0.6 mol/L甘露醇：109.302 g甘露醇，溶于適量去離子水中，定容到1 L；MTC緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，10 mmol/L CaCl2，0.6 mol/L甘露醇；PEG溶液：取適量PEG4000，溶于適量dd H2O，定容到100 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用；PEG-CaCl2溶液：適宜比例PEG溶液，10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L CaCl2，現(xiàn)配現(xiàn)用；溶壁酶溶液(北京索萊寶生物科技有限公司)：適量溶壁酶用0.6 mol/L甘露醇配置，現(xiàn)配現(xiàn)用；以上溶液均過濾除菌。

1.2 原生質(zhì)體的制備與再生

1.2.1 原生質(zhì)體的制備 在PDA上活化后的牛樟芝菌種接種至牛樟芝液體培養(yǎng)基中，28℃，120 r/min，黑暗培養(yǎng)14 d后在無菌條件下過濾收集菌絲體，研磨成勻漿狀，取1 mL裝入50 mL離心管中，用無菌水洗滌后7000 r/min，離心10 min，棄上清；其沉淀用0.6 mol/L甘露醇洗滌，7000 r/min，離心10 min，棄上清，1次重復(fù)；沉淀重懸于10 mL(濃度為10 mg/mL)的溶壁酶溶液中[26-27]，于30℃，80 r/min酶解，2 h后用血球計數(shù)板對酶解程度進行鏡檢，直至大多數(shù)酶解為原生質(zhì)體，確定最佳酶解時間。

將酶解產(chǎn)物過濾，除去未被酶解的菌絲體，濾液于7000 r/min離心機，離心20 min，棄上清液，沉淀用0.6 mol/L甘露醇和MTC緩沖液各洗滌1次后離心，棄上清；沉淀重懸于2 mL 含7%二甲基亞砜的0.6 mol/L甘露醇中，每管200 μL分裝后置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 原生質(zhì)體的再生 取上述制備的新鮮原生質(zhì)懸浮液100 μL，涂布在TB3再生培養(yǎng)基平板上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗倒置培養(yǎng)，14 d后按公式計算再生率：再生率=再生菌落總數(shù)/涂板原生質(zhì)體總數(shù)×100%。

1.3 牛樟芝菌絲體及原生質(zhì)體對潮霉素B的敏感性測定

1.3.1 牛樟芝菌絲體 將牛樟芝菌株分別接種到含潮霉素B濃度為20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL和120 μg/mL的固體培養(yǎng)基中央，每個濃度3次重復(fù)，以不加潮霉素B的平板作為對照；接種后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)14 d，觀察并記錄生長情況，篩選最適合的潮霉素濃度。

1.3.2 牛樟芝原生質(zhì)體 牛樟芝原生質(zhì)體懸浮液100 μL分別涂布于含潮霉素B濃度為20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL和120 μg/mL固體培養(yǎng)基中，每個濃度3次重復(fù)，以不加潮霉素B的平板作為對照；接種后在28℃、黑暗條件下培養(yǎng)14 d，觀察并記錄生長情況，篩選最適合的潮霉素B濃度。

1.4 質(zhì)粒提取

質(zhì)粒提取方法按照OMEAG質(zhì)粒提取試劑盒說明操作。

1.5 PEG-CaCl2介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

參照李剛[16]、劉莉[18]的方法，略加改進。取2管原生質(zhì)體(200 μL/管)，向其中一管加入50 μg質(zhì)粒，另外一管加入等體積的0.6 mol/L甘露醇作對照，分別加入100 μL 0.6 mol/L甘露醇，輕微混勻后置冰上預(yù)冷5 min；再逐滴加入1 mL 20%、30%、40%、50%和60%的PEG-CaCl2溶液，輕微混勻后于冰上放置60 min，逐滴加入0.5 mL PEG-CaCl2溶液，室溫放置30 min，再加入1 mL MTC緩沖液和5 mL牛樟芝液體培養(yǎng)基，28℃，85 r/min振蕩培養(yǎng)48 h；取1 mL均勻涂布在含潮霉素B濃度為60 μg/mL的牛樟芝固體培養(yǎng)基平板中，28℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng)14 d。

1.6 牛樟芝轉(zhuǎn)化子篩選及鑒定

分別進行pCX62和pCT74質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。挑取在含潮霉素B濃度為60 μg/mL的牛樟芝固體培養(yǎng)基上正常生長的轉(zhuǎn)化子視為擬定轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)接至含潮霉素B濃度為60 μg/mL的牛樟芝固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)5代，挑選繼續(xù)生長的擬定轉(zhuǎn)化子進行液體擴大培養(yǎng)并收集菌絲體，采用CTAB法提取gDNA[28]，進行潮霉素基因(hph)PCR擴增。引物序列分別為5′-GCCCTTCCTCCCTTTATT-3′和5′-TCCATCACAGTTTGCCAGT-3′，引物由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μL，擴增程序為95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，58.7℃退火30 s，72℃延伸40 s，32個循環(huán)；72℃延伸7 min，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 PEG-CaCl2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系驗證

將含GFP的外源質(zhì)粒pCT74導(dǎo)入牛樟芝原生質(zhì)體后篩選擬轉(zhuǎn)化子，并通過熒光顯微鏡觀察其菌絲體形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體的制備及再生

不同酶解時間對原生質(zhì)體得率研究表明，酶解2 h和3 h時，原生質(zhì)體的獲得量分別為2.03×105個/mL和3.13×105個/mL；酶解4 h時，原生質(zhì)體的獲得量最大，達3.55×105個/mL；繼續(xù)增加酶解時間至5 h，原生質(zhì)體獲得量降至3.08×105個/mL，可能是由于溶壁酶對已生成的原生質(zhì)體產(chǎn)生毒害作用，影響原生質(zhì)體的數(shù)量及活性，最終影響原生質(zhì)體再生及轉(zhuǎn)化效率。所制備原生質(zhì)體大小適中，無變形(圖1A)，在TB3再生培養(yǎng)基上再生率達4.59%(圖1B)。

圖1 牛樟芝原生質(zhì)體(A)及其在TB3 培養(yǎng)基上再生情況(B)

Fig.1 Regeneration ofA.cinnamomeaprotoplasts on TB3 medium

2.2 牛樟芝菌絲體對潮霉素B的敏感性

由圖2可知，牛樟芝菌株在含不同濃度潮霉素B的牛樟芝固體培養(yǎng)基上生長6～8 d后呈明顯不耐受性，牛樟芝菌絲體在潮霉素B濃度為20 μg/mL的培養(yǎng)基上有少量繼續(xù)生長；當潮霉素B濃度達到40 μg/mL時僅有極少量菌絲可萌發(fā)，但第7天后不再生長；當潮霉素B濃度>60 μg/mL時，牛樟芝菌絲體完全不生長。

注：A，空白對照；B，潮霉素B濃度20 μg/mL；C，潮霉素B濃度40 μg/mL；D，潮霉素B濃度60 μg/mL；E，潮霉素B濃度80 μg/mL；F，潮霉素B濃度100 μg/mL；G，潮霉素B濃度120 μg/mL(下同)。

Note: A, CK; B, 20 μg/mLhygromycin B; C, 40 μg/mL hygromycin B; D, 60 μg/mL hygromycin B; E, 80 μg/mL hygromycin B; F, 100 μg/mL hygromycin B; G, 120 μg/mL hygromycin B. The same below.

圖2 不同濃度潮霉素B 處理牛樟芝菌絲的生長情況

Fig.2 Growth ofA.cinnamomeamycelium treated with different concentration of hygromycin B

2.3 牛樟芝原生質(zhì)體對潮霉素B的敏感性

由圖3可見，牛樟芝原生質(zhì)體再生培養(yǎng)14 d后，含不同濃度潮霉素B的牛樟芝固體培養(yǎng)基呈明顯不耐受性，當固體培養(yǎng)基中潮霉素B濃度為20 μg/mL時牛樟芝原生質(zhì)體的生長明顯受到抑制，僅有少量能生長；當潮霉素B濃度為40 μg/mL時牛樟芝原生質(zhì)體幾乎不能生長；當潮霉素B濃度>60 μg/mL時，牛樟芝原生質(zhì)體完全不能生長(圖3)。因此，將潮霉素B濃度為60 μg/mL作為牛樟芝轉(zhuǎn)化子抗性篩選濃度。

圖3 不同濃度潮霉素 B處理牛樟芝原生質(zhì)體的生長情況

2.4 牛樟芝轉(zhuǎn)化子篩選及鑒定

由圖4表明，用20%～40% PEG-CaCl2溶液介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化均能獲得擬轉(zhuǎn)化子，但轉(zhuǎn)化效率差異較大，其中以40% PEG-CaCl2介導(dǎo)的牛樟芝原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率最高。由圖5可見，培養(yǎng)5代的牛樟芝 pCX62和pCT74擬轉(zhuǎn)化子中hph片段擴增篩選得到的1～5號擬轉(zhuǎn)化子均可擴增大小約為560 bp的hph片段，6號為原始菌株，能初步確定該轉(zhuǎn)化體系的成功建立。

注：A，PEG濃度為0；B，PEG濃度為20%；C，PEG濃度為30%；D，PEG濃度為40%；E，PEG濃度為50%；F，PEG濃度為60%。

Note: A, CK; B, 20% PEG; C, 30% PEG; D, 40% PEG; E, 50% PEG; F, 60% PEG.

圖4 不同濃度PEG-CaCl2溶液處理牛樟芝原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率

Fig.4 Transformation efficiency ofA.cinnamomeaprotoplast treated with different concentration of PEG-CaCl2solution

注：樣品1～5號為轉(zhuǎn)化菌株，6號為原始菌株。

Note: 1～5, transformant stains; 6, original stain.

圖5 牛樟芝 pCX62(左)和pCT74 (右)擬轉(zhuǎn)化子hph片段擴增

Fig.5 hph amplification of pCX62 (left) and pCT74 (right) transformant ofAntrodiacinnamomea

圖6 pTC74轉(zhuǎn)化子菌絲體在普通(A)和熒光顯微鏡(B)及野生菌株(C)在熒光顯微鏡下菌絲形態(tài)

Fig.6 Mycelium of pCT74 transformant under common microscope (A) and fluorescence microscope (B) and hyphal morphology of wild strain (c) under fluorescence microscope

2.5 牛樟芝遺傳轉(zhuǎn)化體系的驗證

由圖6可見，在熒光顯微鏡下pCT774擬轉(zhuǎn)化子的菌絲體中可觀察到大量的綠色熒光，而野生型牛樟芝菌絲體則無該現(xiàn)象，從而進一步證明PEG-CaCl2可成功介導(dǎo)牛樟芝原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。

3 結(jié)論與討論

與前人研究結(jié)果[23-24]相比，本研究利用GFP對所轉(zhuǎn)化體系進行驗證，在熒光顯微鏡下能快速、直接觀察到轉(zhuǎn)化情況，縮短轉(zhuǎn)化培養(yǎng)及驗證時間，提高了驗證效率。張新濤等[24]的結(jié)果中靈芝原生質(zhì)體再生率僅1%，李剛等[23]的研究結(jié)果也表明，靈芝再生率也與酶解時間、培養(yǎng)基等有關(guān)，本研究牛樟芝原生質(zhì)體再生率4.59%，而原生質(zhì)體再生率低也能直接影響轉(zhuǎn)化效率。牛樟芝原生質(zhì)體再生率和轉(zhuǎn)化效率低可能是因為高等真菌的遺傳規(guī)律和菌齡限制[24]，但也可能是以下原因：

1) 酶解條件的選擇。有效去除細胞壁是成功制備原生質(zhì)的關(guān)鍵。真菌細胞壁主要含有大量的多糖類物質(zhì)，選擇適宜的溶壁酶至關(guān)重要。劉莉等[18]對猴頭菇遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究中發(fā)現(xiàn)，1%溶壁酶、1%纖維素酶和1%蝸牛酶對原生質(zhì)體的制備效果最佳(3×106個/mL)，其次為1%溶壁酶(2.8×106個/mL)。本研究中用10 mg/mL的溶壁酶制備牛樟芝原生質(zhì)體可達3.13×105個/mL，說明不同溶壁酶之間對原生質(zhì)體的形成可能存在差異。

研究中還發(fā)現(xiàn)酶解時間能直接影響原生質(zhì)的數(shù)量，酶解2～4 h，原生質(zhì)體數(shù)量不斷升高，而酶解5 h后，原生質(zhì)體數(shù)量明顯下降，是由于酶解時間過長，溶壁酶對原生質(zhì)體膜進行酶解，導(dǎo)致原生質(zhì)體破裂，從而使再生能力下降，這與李剛等[16]研究結(jié)果一致。

2) PEG介導(dǎo)濃度的選擇。本研究結(jié)果表明，不同濃度的PEG-CaCl2溶液對轉(zhuǎn)化獲得率影響較大。當PEG-CaCl2溶液濃度為20%～40%時，均能獲得不同數(shù)量的轉(zhuǎn)化子，而當濃度達50%以上時，均無法獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)化子，在PEG處理過程中，由于細胞質(zhì)濃度不均勻或細胞體積過小容易使原生質(zhì)體破碎，因此轉(zhuǎn)化過程中，原生質(zhì)體的質(zhì)量、活性以及細胞滲透壓環(huán)境的穩(wěn)定是轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵。過高的PEG濃度會影響細胞穩(wěn)定性，對細胞產(chǎn)生一定的毒害作用，本研究當PEG濃度>50%時，未獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)化子，可能是因為濃度過高使原生質(zhì)體破裂從而無法再形成轉(zhuǎn)化子。

利用GFP驗證牛樟芝遺傳轉(zhuǎn)化體系具有直觀、快速、穩(wěn)定等特點，提高轉(zhuǎn)化驗證效率和準確性，可在各領(lǐng)域使用。牛樟芝子實體和菌絲體都含量大量三萜類和多糖類，其藥理功能越來越得到認可，建立牛樟芝遺傳轉(zhuǎn)化體系，利用分子生物學(xué)技術(shù)拓展牛樟芝的研究和利用空間，建立穩(wěn)定、快速的牛樟芝遺傳轉(zhuǎn)化體系，通過導(dǎo)入外源基因，提升牛樟芝工業(yè)生產(chǎn)價值，從而為牛樟芝的市場化推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯： 劉忠麗)

Establishment of Genetic Transformation System ofAntrodiacinnamomeaBased on PEG-CaCl2Mediated Method

LI Jing1,2, LIN Xiongjie3, LIN Dongmei1,2, LU Guodong1, LIN Zhanxi1,2*

(1.ChinaNationalJuncaoEngineeringResearchCenter,Fuzhou,Fuzhou350002; 2.JuncaoInstitute,FujianUniversityofAgricultureandForestry,Fuzhou,Fuzhou350002; 3.FruitInstitute,FujianAcademyofAgriculturalScience,Fuzhou,Fuzhou350013,China)

The transformants ofAntrodiacinnamomeamycelium and protoplast were verified by hygromycin B resistance, GFP and PCR to establish the stable genetic transformation system ofAntrodiacinnamomeaand screen the suitable PEG-CaCl2concentration for transformation ofAntrodiacinnamomeaprotoplast. Results: The protoplast yield extracted from freshA.cinnamomeamycelium is 3.55×105/mL under the conditions of 10 mg/mL lyticase, 4 h and 30℃. The mycelium and protoplast ofA.cinnamomeacan not grow on 40 μg/mL or 60 μg/mL hygromycin B medium. The suitable concentration of hygromycin B to screenA.cinnamomeatransformants is 60 μg/mL. 20%～40% PEG can mediate transformation ofA.cinnamomeaprotoplast and the optimal PEG concentration is 40%.

Antrodiacinnamomea; protoplast; polyethylene glycol; hygromycin B; recombinant

2015-09-16； 2016-04-02修回

福建省2011計劃“福建省菌草生態(tài)產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心”(k80nd8002)；國家菌草工程技術(shù)研究中心組建項目(2011FU125X 12)

李 晶(1985-)，女，碩士，從事蔬菜學(xué)食用菌研究。E-mail:13959197195@163.com

*通訊作者：林占熺(1943-)，男，研究員，從事菌草栽培食藥用菌技術(shù)研究。E-mail:lzxjuncao@163.com

1001-3601(2016)04-0166-0086-06

S646.9； Q939.5

A