于永明 ，王軍輝，麻文俊，馬建偉，張宋智，李平英，韓云花

1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)研究所，國(guó)家林業(yè)局 林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；2.甘肅省小隴山林業(yè)科學(xué)研究所，甘肅 天水 741022

楸樹(shù)（Catalpa bungeiC.A.Mey.）材質(zhì)優(yōu)良，樹(shù)干挺拔，花色淡紅素雅，觀(guān)賞性高，是珍貴用材及綠化樹(shù)種，在我國(guó)豐富的樹(shù)木資源中，惟其“材”貌雙全，自古素有“木王”之美稱(chēng)。近年來(lái)，在楸樹(shù)生物學(xué)特性、開(kāi)花結(jié)實(shí)習(xí)性、種質(zhì)資源現(xiàn)狀、良種選擇、繁殖技術(shù)、造林技術(shù)等方面都有較為系統(tǒng)的研究?！笆晃濉逼陂g，珍貴闊葉樹(shù)種種質(zhì)創(chuàng)新課題組對(duì)楸樹(shù)種源和無(wú)性系選擇、目標(biāo)樹(shù)選擇和培育、立地選擇、干形培育、混交林結(jié)構(gòu)調(diào)整、密度控制和水肥調(diào)控等關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行了深入研究，建立了珍貴用材林定向單株培育的科技創(chuàng)新平臺(tái)，提高了我國(guó)珍貴用材林培育的技術(shù)創(chuàng)新能力[1-4]。在楸樹(shù)組培研究領(lǐng)域，已有研究者對(duì)楸樹(shù)器官的體細(xì)胞胚胎發(fā)生進(jìn)行探討，并取得一定的研究結(jié)論[5]，但普遍以楸樹(shù)嫩芽為材料。本珍貴闊葉樹(shù)種種質(zhì)創(chuàng)新課題組根據(jù)研究結(jié)果，已制定了《楸樹(shù)無(wú)性系組培快繁技術(shù)規(guī)程》地方標(biāo)準(zhǔn)[6]。

抗生素是由微生物或高等動(dòng)植物在生活過(guò)程中產(chǎn)生的具有抗病原體或其他活性的一類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細(xì)胞的發(fā)育功能?？敲顾厥且环N蛋白質(zhì)生物合成抑制劑，通過(guò)與30S 核糖體結(jié)合而使mRNA 密碼誤讀，若細(xì)菌產(chǎn)生一種破壞卡那霉素的酶，則該菌可變?yōu)榭剐灾?，卡那霉素抗性質(zhì)粒常被作為選擇基因或標(biāo)記基因用于分子克隆[7-8]。潮霉素是一種常用的抗性篩選藥物，其抗性基因表達(dá)產(chǎn)物是一種蛋白激酶，通過(guò)磷酸化潮霉素使其喪失活性。由于在真核和原核生物中潮霉素篩選假陽(yáng)性率低，重復(fù)性好，現(xiàn)在通過(guò)潮霉素對(duì)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行篩選已被廣泛應(yīng)用[9-12]?？敲顾睾统泵顾厥悄壳斑z傳轉(zhuǎn)化體系廣泛應(yīng)用的2 種抗生素。我們進(jìn)行了卡那霉素和潮霉素對(duì)楸樹(shù)無(wú)性系試管苗生長(zhǎng)的影響研究，以確定抗生素對(duì)楸樹(shù)莖段分化和生根的敏感質(zhì)量濃度，建立有效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為楸樹(shù)特性良種的選育與轉(zhuǎn)化提供重要理論和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

河南洛陽(yáng)楸樹(shù)優(yōu)良無(wú)性系2-8、1-4組培苗由本課題組篩選；卡那霉素與潮霉素均購(gòu)自Sigma公司。

1.2 楸樹(shù)無(wú)性系生長(zhǎng)分化培養(yǎng)

選擇生長(zhǎng)一致的楸樹(shù)組培苗，轉(zhuǎn)接到增殖分化培養(yǎng)基上。增殖培養(yǎng)莖段帶1 個(gè)腋芽，確保誘導(dǎo)分化在同一水平。繼代增殖分化培養(yǎng)基為DKW+BA（芐氨基腺嘌呤）1.0 mg/L+IBA（吲哚丁酸）0.2 mg/L+蔗糖25 g/L+瓊脂4.5 g/L（pH5.8），以楸樹(shù)無(wú)性系2-8 組培繼代瓶苗為材料，在培養(yǎng)基中分別加入0、25、50、100、150 mg/L 的卡那霉素，1、5、10 mg/L 的潮霉素，共8個(gè)處理質(zhì)量濃度；以楸樹(shù)無(wú)性系1-4、2-8 組培繼代瓶苗為材料，在培養(yǎng)基中分別加入0、1、5、10 mg/L 的潮霉素，共4個(gè)處理質(zhì)量濃度。每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，每重復(fù)接種10 瓶，每瓶接種3 株。所有材料都置于組培室內(nèi)，組培苗培養(yǎng)溫度22～26℃，光照2000 lx，光照時(shí)間為14 h/d。

1.3 楸樹(shù)試管苗生根培養(yǎng)

生根莖段長(zhǎng)度為1.5 cm，確保插入培養(yǎng)基莖段部位沒(méi)有腋芽，以免影響根系的誘導(dǎo)。生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.1 mg/L+NAA（萘乙酸）0.01 mg/L+蔗糖10 g/L+瓊脂5.0 g/L（pH5.8），以楸樹(shù)無(wú)性系2-8 組培繼代瓶苗為材料，在培養(yǎng)基中分別加入0、25、50、100、150 mg/L 的卡那霉素，1、5、10 mg/L的潮霉素，共8個(gè)處理質(zhì)量濃度；以楸樹(shù)無(wú)性系1-4、2-8 組培繼代瓶苗為材料，在培養(yǎng)基中分別加入0、25、50、100、150 mg/L 的卡那霉素，共5 個(gè)處理質(zhì)量濃度。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)接種10瓶，每瓶接種3 株。所有材料都置于組培室內(nèi)，培養(yǎng)條件同上。

1.4 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

增殖培養(yǎng)40 d 后，統(tǒng)計(jì)增殖培養(yǎng)指標(biāo)，包括增殖芽數(shù)、芽長(zhǎng)、葉數(shù)、接入莖段愈傷組織橫向及縱向膨大情況。增殖系數(shù)以各處理增殖芽數(shù)與芽長(zhǎng)的積除以轉(zhuǎn)接莖段長(zhǎng)度（1 cm）而得。

生根培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計(jì)生根培養(yǎng)指標(biāo)，包括接入莖段發(fā)根數(shù)、根長(zhǎng)、發(fā)芽數(shù)、芽長(zhǎng)、葉數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 抗生素對(duì)楸樹(shù)繼代瓶苗生長(zhǎng)的影響

2.1.1 抗生素對(duì)楸樹(shù)無(wú)性系2-8 繼代瓶苗生長(zhǎng)的影響 方差分析顯示，經(jīng)不同質(zhì)量濃度的抗生素處理，楸樹(shù)無(wú)性系2-8 瓶苗的增殖芽數(shù)（P=0.008）、芽長(zhǎng)（P=0.000）、愈傷組織橫向膨大（P=0.000）、增殖系數(shù)（P=0.000）、葉數(shù)（P=0.000）、愈傷組織縱向膨大（P=0.000）的差異極顯著。多重比較顯示（表1），不同質(zhì)量濃度的抗生素處理對(duì)各指標(biāo)間的差異不同。在培養(yǎng)基中添加抗生素，楸樹(shù)誘導(dǎo)增殖分化芽均低于對(duì)照（質(zhì)量濃度為0 mg/L）；隨著質(zhì)量濃度的增大，呈現(xiàn)出逐漸降低的變化趨勢(shì)，與對(duì)照相比，變化呈負(fù)相關(guān)。卡那霉素與潮霉素的作用基本相同，隨著添加質(zhì)量濃度的增大都呈負(fù)相關(guān)。與對(duì)照相比，在培養(yǎng)基中添加低質(zhì)量濃度的潮霉素（1 mg/L）對(duì)2-8 的分化指標(biāo)增殖芽數(shù)、葉數(shù)及莖段基部愈傷組織的膨大有一定的促進(jìn)作用，但對(duì)分化芽的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。添加卡那霉素質(zhì)量濃度為50 mg/L 時(shí)葉片開(kāi)始發(fā)黃；當(dāng)濃度為100 mg/L 時(shí)葉片開(kāi)始發(fā)白，葉尖開(kāi)始干枯，莖段基部愈傷組織基本停止膨大，瓶苗生長(zhǎng)緩慢；當(dāng)濃度為150 mg/L 時(shí)葉片大多發(fā)白，葉片干枯，莖段基部無(wú)愈傷組織形成，瓶苗基本不生長(zhǎng)。依此，楸樹(shù)繼代瓶苗的分化芽對(duì)卡那霉素的耐受范圍為100～150 mg/L。添加潮霉素質(zhì)量濃度為1 mg/L 時(shí)葉片開(kāi)始發(fā)黃；當(dāng)濃度為5 mg/L 時(shí)葉片開(kāi)始發(fā)白，葉片小，莖段基部愈傷組織較小，瓶苗生長(zhǎng)緩慢；當(dāng)濃度為10 mg/L 時(shí)葉片開(kāi)始干枯，莖段基部愈傷組織較小，瓶苗基本不生長(zhǎng)。依此，楸樹(shù)繼代瓶苗的分化芽對(duì)潮霉素的耐受范圍為10 mg/L左右。

2.1.2 潮霉素對(duì)楸樹(shù)無(wú)性系1-4 繼代瓶苗生長(zhǎng)的影響 方差分析顯示，經(jīng)不同質(zhì)量濃度的潮霉素處理，1-4 瓶苗的增殖芽數(shù)（P=0.009）、芽長(zhǎng)（P=0.001）、愈傷組織橫向膨大（P=0.005）、增殖系數(shù)（P=0.002）、葉數(shù)（P=0.000）、愈傷組織縱向膨大（P=0.009）的差異極顯著。多重比較顯示（表2）,不同濃度處理對(duì)各指標(biāo)間的差異不同。與對(duì)照相比，低質(zhì)量濃度（1 mg/L）潮霉素對(duì)楸樹(shù)無(wú)性系1-4 分化芽數(shù)有促進(jìn)作用，而對(duì)其他指標(biāo)有明顯的抑制作用；隨著潮霉素質(zhì)量濃度（5、10 mg/L）的加大，對(duì)各指標(biāo)出現(xiàn)明顯的抑制，與對(duì)照相比，變化趨勢(shì)呈負(fù)相關(guān)。在促進(jìn)增殖分化芽數(shù)方面，潮霉素對(duì)無(wú)性系1-4 與2-8 的影響一致，說(shuō)明低質(zhì)量濃度（1 mg/L）的潮霉素對(duì)楸樹(shù)無(wú)性系的繼代分化芽數(shù)有一定的促進(jìn)作用。

2.1.3 潮霉素對(duì)無(wú)性系1-4、2-8 分化差異的影響見(jiàn)表3，同一抗生素對(duì)不同無(wú)性系間繼代分化指標(biāo)的影響差異不顯著，在同等培養(yǎng)條件下，無(wú)性系間分化指標(biāo)的差異主要取決于無(wú)性系遺傳因素的制約。

2.2 抗生素對(duì)楸樹(shù)生根瓶苗生長(zhǎng)的影響

2.2.1 抗生素對(duì)楸樹(shù)無(wú)性系2-8 生根瓶苗生長(zhǎng)的影響 方差分析顯示，在楸樹(shù)無(wú)性系2-8 生根培養(yǎng)基中添加不同濃度的抗生素，對(duì)楸樹(shù)根系誘導(dǎo)有明顯的抑制作用，各處理（卡那霉素25、50、100、150 mg/L，潮霉素1、5、10 mg/L）與對(duì)照相比，差異極顯著（P發(fā)根數(shù)=0.000、P根長(zhǎng)=0.000、P發(fā)芽數(shù)=-、P芽長(zhǎng)=0.000、P葉數(shù)=0.000、P生根率=0.000）。隨卡那霉素與潮霉素質(zhì)量濃度的升高，生根率及其他指標(biāo)生長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。潮霉素質(zhì)量濃度達(dá)5 mg/L 時(shí)，生根苗已出現(xiàn)不良生長(zhǎng)狀況，少部分莖段干枯；濃度為10 mg/L 時(shí)，大部分莖段干枯，少部分為綠，莖段未出現(xiàn)芽的分化與根的萌發(fā)現(xiàn)象。依此，楸樹(shù)組培瓶苗生根苗對(duì)潮霉素的耐受范圍為5～10 mg/L?？敲顾刭|(zhì)量濃度達(dá)50 mg/L 時(shí)，生根苗已出現(xiàn)不良生長(zhǎng)狀況，生根誘導(dǎo)率基本是對(duì)照的一半；濃度為100 mg/L 時(shí)，大部分莖段干枯，少部分為綠但未分化芽與根；濃度為150 mg/L 時(shí)，大部分莖段干枯，極少部分上部為綠，基部干枯，但未分化芽與根。依此，楸樹(shù)組培瓶苗生根苗對(duì)卡那霉素的耐受范圍為100～150 mg/L。

表1 不同質(zhì)量濃度的潮霉素和卡那霉素對(duì)2-8組培苗繼代分化的影響

表2 不同質(zhì)量濃度的潮霉素對(duì)1-4組培苗繼代分化的影響

表3 不同質(zhì)量濃度的潮霉素對(duì)楸樹(shù)無(wú)性系2-8、1-4生根苗培養(yǎng)性狀的影響方差分析（P值）

2.2.2 卡那霉素對(duì)楸樹(shù)無(wú)性系1-4 生根瓶苗生長(zhǎng)的影響 在楸樹(shù)無(wú)性系1-4 生根培養(yǎng)基中添加卡那霉素25、50、100、150 mg/L，與對(duì)照相比，差異極顯著（P發(fā)根數(shù)=0.000、P根長(zhǎng)=0.000、P發(fā)芽數(shù)=-、P芽長(zhǎng)=0.000、P葉數(shù)=0.000、P生根率=0.000），影響趨勢(shì)與2-8 類(lèi)似，隨抗生素質(zhì)量濃度的升高，各生長(zhǎng)指標(biāo)受到明顯抑制。當(dāng)卡那霉素濃度達(dá)100 mg/L 時(shí)，莖段部分為綠，部分干枯，莖段無(wú)發(fā)根發(fā)芽情況；濃度為150 mg/L 時(shí)，莖段基本全部干枯，僅極少數(shù)為綠，但未分化芽與根。

2.2.3 卡那霉素對(duì)無(wú)性系1-4、2-8 生根差異的影響 由表6 可知，不同質(zhì)量濃度的卡那霉素對(duì)楸樹(shù)無(wú)性系2-8、1-4 生根苗培養(yǎng)性狀的影響相同，不同無(wú)性系間并無(wú)差異，說(shuō)明在楸樹(shù)無(wú)性系生根培養(yǎng)基中添加卡那霉素對(duì)生根培養(yǎng)性狀的抑制有普適性。

3 討論

生物體對(duì)周?chē)h(huán)境都有一定的適應(yīng)性，當(dāng)環(huán)境處于逆境時(shí)，生物體會(huì)對(duì)逆境產(chǎn)生一定的抗性，逆境強(qiáng)度決定了生物體能否生存?？股嘏c鹽脅迫、低溫脅迫、病害等的發(fā)生類(lèi)似，也是一種逆境脅迫。在植物遺傳轉(zhuǎn)化體系中，不同植物、不同材料對(duì)抗生素的敏感性不同。因此，進(jìn)行選擇性抗生素的抗性試驗(yàn)并篩選出適宜濃度，是轉(zhuǎn)基因進(jìn)行的前提[13]。在抗生素的選擇上，卡那霉素與潮霉素較為常用，卡那霉素的應(yīng)用更為普及。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，卡那霉素對(duì)楸樹(shù)組培苗生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，且與作用濃度呈負(fù)相關(guān)。潮霉素與卡那霉素對(duì)楸樹(shù)瓶苗的影響基本類(lèi)似，但低質(zhì)量濃度（1 mg/L）的潮霉素對(duì)繼代芽的分化有促進(jìn)作用，抗生素對(duì)植物組培材料的分化有促進(jìn)作用還未見(jiàn)報(bào)道。潮霉素對(duì)楸樹(shù)無(wú)性系2-8、1-4組培繼代分化各生長(zhǎng)指標(biāo)影響相同，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)論并非偶然，楸樹(shù)無(wú)性系繼代培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)前期主要為莖段基部的愈傷組織膨大，隨著愈傷組織的形成與膨大，其他指標(biāo)也開(kāi)始迅速增長(zhǎng)，當(dāng)愈傷組織膨大到一定程度（一般在培養(yǎng)30～40 d）時(shí)開(kāi)始褐化干枯，潮霉素可能阻止了愈傷組織釋放的酚類(lèi)物質(zhì)的氧化，延緩楸樹(shù)莖段基部愈傷組織的褐化干枯，提高芽的分化，其內(nèi)在機(jī)理還有待深入研究。楸樹(shù)供試無(wú)性系對(duì)卡那霉素與潮霉素的耐受濃度一致，同等質(zhì)量濃度的抗生素對(duì)2 種無(wú)性系的作用無(wú)顯著差異，敏感濃度相同，在楊樹(shù)[14]研究中涉及了不同樹(shù)種，表明耐受濃度不同，無(wú)性間還未見(jiàn)有其他研究報(bào)道。

表4 不同質(zhì)量濃度的潮霉素和卡那霉素對(duì)楸樹(shù)無(wú)性系2-8生根苗培養(yǎng)性狀的影響

表5 不同質(zhì)量濃度的卡那霉素對(duì)楸樹(shù)無(wú)性系1-4生根苗培養(yǎng)性狀的影響

表6 不同質(zhì)量濃度的卡那霉素對(duì)楸樹(shù)無(wú)性系2-8、1-4生根苗培養(yǎng)性狀的影響方差分析（P值）

近年來(lái)，關(guān)于植物抗生素耐受性研究應(yīng)用取得了一定的進(jìn)展，以組培手段選擇抗生素耐受濃度在菊花、煙草、楊樹(shù)、川芎、黃瓜、大豆、蘋(píng)果[13-22]等植物中有研究報(bào)道，選擇的抗生素主要為卡那霉素與潮霉素。研究表明，抗生素對(duì)植物組培生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，本試驗(yàn)結(jié)果與之吻合。不同植物、不同材料、不同培養(yǎng)階段的耐受濃度不同，大多植物材料對(duì)卡那霉素的敏感濃度為5.0～100 mg/L。30 mg/L 卡那霉素能夠明顯抑制菊花莖段的分化，10 mg/L 能夠抑制生根[15]；卡那霉素與潮霉素對(duì)煙草葉片的分化抑制濃度均為30 mg/L[16]；楊樹(shù)葉片、莖段對(duì)潮霉素的敏感濃度為1.0～6.0 mg/L[14，17]，葉片對(duì)卡那霉素素的敏感濃度為20～40 mg/L[14，17-18]；川芎的根、莖、葉對(duì)卡那霉素的耐受濃度為20～40 mg/L[13]；以黃瓜種子為供試材料，魏愛(ài)民等研究認(rèn)為，200 mg/L 的卡那霉素能夠抑制黃瓜幼苗的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)研究材料為楸樹(shù)莖段，研究結(jié)論與大多研究報(bào)道基本一致。綜合來(lái)看，種子與莖段對(duì)抗生素的耐受性質(zhì)量濃度稍高，葉片較低；植物對(duì)卡那霉素的耐受濃度高于潮霉素，這也說(shuō)明潮霉素對(duì)楸樹(shù)組培苗的毒性較大?？敲顾厥悄壳皯?yīng)用較為廣泛的選擇抗生素，在植物組培應(yīng)用篩選技術(shù)基本成熟的同時(shí)，也逐漸應(yīng)用于田間轉(zhuǎn)基因植株的篩選，這在苜蓿、棉花、大豆、番茄、水稻、小麥等作物中有研究報(bào)道[19]。

蔣衛(wèi)東[13]等認(rèn)為，遺傳轉(zhuǎn)化體系中的篩選劑必須是植物細(xì)胞的抑制劑，但不可殺死細(xì)胞，轉(zhuǎn)化體系過(guò)程中低毒性化合物的選擇效果優(yōu)于高毒性化合物，當(dāng)選擇劑對(duì)植物細(xì)胞具有強(qiáng)毒害時(shí)，細(xì)胞將快速死亡，死亡或?qū)⑺兰?xì)胞對(duì)鄰近的細(xì)胞將產(chǎn)生抑制作用，使鄰近轉(zhuǎn)化細(xì)胞也受到抑制[20]。依此機(jī)理，作為選擇性抗生素，卡那霉素的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于潮霉素，王丹[14]等對(duì)楊樹(shù)的研究也得到同樣結(jié)論，這也與本試驗(yàn)結(jié)論一致。不同植物對(duì)抗生素的敏感性不同，這只是在少部分植物研究中有結(jié)論，大部分研究報(bào)道在抗生素選擇上局限于同一抗生素不同濃度的篩選，很少有不同抗生素針對(duì)同一植物的選擇研究。有必要拓展相關(guān)研究領(lǐng)域，為植物遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定扎實(shí)的理論基礎(chǔ)與實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

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