高航高玉亮李葵花

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉 133002；2.延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，龍井 133400）

羽衣甘藍(lán)下胚軸農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化

高航1高玉亮2李葵花1

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉 133002；2.延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，龍井 133400）

以紅鷗羽衣甘藍(lán)下胚軸為試材，首先優(yōu)化了不定芽分化體系，其次探討了農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化過程中農(nóng)桿菌侵染濃度、侵染時間對不定芽分化率的影響及不定芽分化和生根過程中潮霉素B篩選壓力，最后對抗性植株進(jìn)行了潮霉素B篩選基因的PCR檢測。結(jié)果表明，在MS + 6-BA 5.0 mg/L+AgNO39.0 mg/L培養(yǎng)基中不定芽分化率最高，為84.17%；農(nóng)桿菌侵染濃度OD600值為0.5、侵染5 min時利于遺傳轉(zhuǎn)化，分化率為69.17%；不定芽分化和生根過程中潮霉素B篩選壓力分別為4.0 mg/L和30.0 mg/L；潮霉素B篩選基因的PCR鑒定結(jié)果，在預(yù)期的602 bp處出現(xiàn)了條帶，初步證明潮霉素B篩選基因已整合到羽衣甘藍(lán)基因組中。

羽衣甘藍(lán)；農(nóng)桿菌侵染效率；潮霉素篩選壓力濃度

羽衣甘藍(lán)（Brassica oleracea var. acephala），屬十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種的變種，轉(zhuǎn)色后心葉色彩豐富艷麗。相對于其他觀賞植物，羽衣甘藍(lán)耐寒性強(qiáng)，在我國北方地區(qū)作為秋冬觀賞花卉進(jìn)行栽培，但因其品種耐寒性應(yīng)用區(qū)域較窄，若在東北寒冷地區(qū)廣泛應(yīng)用，必須提高抗寒性。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法能有效轉(zhuǎn)入目的基因于植物基因組中，縮短育種年限，提高育種效率，且轉(zhuǎn)化的外源目的基因拷貝數(shù)低、穩(wěn)定，因而廣泛應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化研究中，但其前提條件是必須建立高效的再生體系。

關(guān)于羽衣甘藍(lán)的再分化研究較多［1-4］，但有關(guān)農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化過程中受體材料再分化對農(nóng)桿菌及篩選劑敏感度影響的研究較少。徐勤青等［5］認(rèn)為農(nóng)桿菌濃度和篩選劑劑量等影響著植物材料的遺傳轉(zhuǎn)化效率，具有較高再分化率并不代表其遺傳轉(zhuǎn)化效率高；苑麗霞等［6］的研究表明，農(nóng)桿菌濃度和侵染時間影響抗性芽分化率。本試驗在前人研究基礎(chǔ)上，以紅鷗羽衣甘藍(lán)下胚軸為試材，優(yōu)化不定芽再分化條件，篩選適合侵染的農(nóng)桿菌濃度、侵染時間及不定芽分化和生根過程中篩選劑潮霉素B的篩選壓力，利用PCR方法驗證篩選基因的存在與否，旨在為建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)羽衣甘藍(lán)遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 將紅鷗羽衣甘藍(lán)種子（購自花卉市場）用10%次氯酸鈉溶液消毒10 min，滅菌水沖洗3次，用無菌濾紙吸干水分，按10粒/瓶播種于B5培養(yǎng)基。25℃、黑暗條件下萌發(fā)后，轉(zhuǎn)移至25℃，2 000 lx，16 h/d光照條件下，培養(yǎng)7 d，切取1.0 cm左右的下胚軸用于遺傳轉(zhuǎn)化。

1.1.2 農(nóng)桿菌菌液濃度的配置 含PH7WG2D（攜帶潮霉素B篩選基因）載體的LBA4404農(nóng)桿菌菌株用于侵染試驗。挑取農(nóng)桿菌LBA4404單菌落于28℃，YEB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)至對數(shù)生長期之后，在6 000 r/min下離心5 min，收集菌體。用滅菌MS液體培養(yǎng)基重懸，配置OD600值為0.1、0.3、0.5、0.7和0.9的不同菌液濃度。

1.1.3 培養(yǎng)基的組成 不定芽分化培養(yǎng)基：MS+6-BA 5.0 mg/L + AgNO 9.0 mg/L；共培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS+36-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.1 mg/L；抑菌分化培養(yǎng)基：MS + 6-BA 5.0 mg/L + AgNO 9.0 mg/L+羧芐霉素5003mg/L；篩選分化培養(yǎng)基：MS+6-BA 5.0 mg/L+AgNO39.0 mg/L+羧芐霉素500 mg/L+潮霉素B 4 mg/L；生根培養(yǎng)基：1/2 MS；生根篩選培養(yǎng)基：1/2 MS+潮霉素B 30 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 羽衣甘藍(lán)下胚軸不定芽分化體系的優(yōu)化 將下胚軸置于添加不同濃度6-BA和AgNO3的MS培養(yǎng)基中（表1），每組合處理40個下胚軸，觀察并計算不定芽分化率。

不定芽分化率（%）=分化不定芽的外植體數(shù)量/總外植體數(shù)量×100 %

1.2.2 農(nóng)桿菌侵染濃度（OD600值）和侵染時間對不定芽分化的影響 利用不同濃度的農(nóng)桿菌菌液（OD600值為0.1、0.3、0.5、0.7和0.9）侵染外植體5 min；利用OD600值為0.5的菌液侵染外植體1、3、5、7和9 min后，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d，轉(zhuǎn)接于抑菌分化培養(yǎng)基中，觀察并調(diào)查受體材料的農(nóng)桿菌感染致死率和不定芽分化率。

致死率（%）=過度污染農(nóng)桿菌的外植體數(shù)量/總外植體數(shù)量×100%

1.2.3 潮霉素B篩選壓力的確定 下胚軸外植體置于含有不同濃度潮霉素B（0、2.0、4.0、6.0和8.0 mg/L）的篩選分化培養(yǎng)基上，篩選不定芽分化率接近于對照不定芽分化率的半致死濃度。

將不定芽分化培養(yǎng)基中分化的2.0 cm左右的不定芽繼代于1/2 MS +潮霉素B（0、10.0、20.0、30.0、40.0和50.0 mg/L）的生根篩選培養(yǎng)基中，篩選生根率接近于對照生根率的半致死濃度。

1.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化 采用OD600=0.5的農(nóng)桿菌菌液侵染下胚軸5 min后，在共培養(yǎng)基中共培養(yǎng)2 d，轉(zhuǎn)移至篩選分化培養(yǎng)基中，當(dāng)抗性芽生長至2.0 cm左右時，繼代于生根篩選培養(yǎng)基20 d，之后轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基，其植株用于潮霉素B篩選基因的PCR分子檢測。

上述試驗均在25℃，2 000 lx，16 h/d光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每個處理采用40個外植體，重復(fù)3次。

1.2.5 潮霉素B基因分子檢測 CTAB法提取抗性植株葉片總DNA，以潮霉素B特異引物（上游引物：5'-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3'；下游引物：5'-GCGAAGAATCTCGTGCTTTC-3'，上海生工合成）進(jìn)行PCR檢測。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，進(jìn)行電泳檢測。

2 結(jié)果

2.1 下胚軸不定芽分化體系的優(yōu)化及分化過程中潮霉素B篩選壓力的確定

羽衣甘藍(lán)下胚軸的再分化體系優(yōu)化實驗結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，隨著6-BA和AgNO3濃度增加，分化率越來越高（表1），其最高臨界濃度分別為5.0 mg/L和9.0 mg/L。在該條件下，下胚軸外植體經(jīng)培養(yǎng)3-4周，就可分化出不定芽，分化率最高，達(dá)84.17%，且每個外植體能夠產(chǎn)生4個左右的不定芽（圖1），為誘導(dǎo)下胚軸不定芽的最適條件。另外，AgNO3的濃度高于9.0 mg/L時，不定芽的分化率雖高，但出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。

圖1 不定芽分化培養(yǎng)基的下胚軸不定芽分化

潮霉素B濃度對誘導(dǎo)外植體不定芽分化的影響較大（結(jié)果未列出）。當(dāng)潮霉素B濃度為4.0 mg/L時，不定芽的分化率為41.24%，接近于半致死濃度，確定4.0 mg/L為篩選分化濃度。在篩選分化培養(yǎng)基上分化的外植體可產(chǎn)生大量淡黃色愈傷組織，部分愈傷組織可分化出不定芽；部分愈傷組織只分化出無生長點(diǎn)的葉片。另外，接近于50%的下胚軸外植體未形成愈傷組織，發(fā)黑、褐化，最終枯死（圖2）。

圖2 篩選分化培養(yǎng)基（含羧芐霉素500 mg/L）的下胚軸不定芽分化

2.2 農(nóng)桿菌濃度（OD值）和侵染時間對不定芽分化率的影響

不同農(nóng)桿菌濃度和侵染時間對受體材料的致死率和不定芽分化率的影響（表2和表3）表明，保持較高不定芽分化率的前提下，OD600值0.5的侵染濃度和5 min的侵染時間是以較高侵染濃度來盡量延長侵染時間的最佳農(nóng)桿菌侵染條件，其分化率為69.17%。濃度過大或侵染時間過長，會造成農(nóng)桿菌感染過度而增加受體材料死亡率，從而大幅度降低不定芽分化率，濃度過小或侵染時間過短，會降低農(nóng)桿菌的侵染機(jī)率而影響遺傳效果。

2.3 生根過程中潮霉素B篩選壓力的確定及抗性植株的獲得

潮霉素B濃度對羽衣甘藍(lán)小芽生根率和生長勢的影響較大。實驗結(jié)果顯示（數(shù)據(jù)未列出），隨著潮霉素B濃度的增加，隨著小芽的生根率減少其生長勢也越來越弱。當(dāng)潮霉素B濃度為20.0 mg/L時，小芽均能產(chǎn)生白色正常的根，存活率達(dá)90%以上；當(dāng)潮霉素B濃度為50.0 mg/L時，所有小芽不能生根且干枯而死；當(dāng)潮霉素B濃度為30.0 mg/L時，45%小芽可產(chǎn)生白色健壯的根，植株葉片擴(kuò)展，呈淡綠色，植株生長良好；55%小芽不產(chǎn)生根或產(chǎn)生短小的根，葉片窄小，呈暗紫色或濃綠色，且莖不伸長，整個植株停止生長，最終枯死（圖3）。因此，選用30.0 mg/L的潮霉素B濃度作為生根篩選濃度。

將農(nóng)桿菌侵染之后分化的抗性小芽置于生根篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)兩周的生長情況。圖4顯示，一些抗性芽產(chǎn)生黃褐色的根，其植株葉片發(fā)黃，最終枯死；部分抗性芽，長出較短的白色根，植株葉片深綠，長勢緩慢。此時，將長勢緩慢的小植株，繼代到生根培養(yǎng)基（不含潮霉素B）中，可獲得生長良好的抗性植株。通過該方法獲得了3株抗性株系。

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

PH7WG2D植物表達(dá)載體攜帶潮霉素B篩選基因，因此通過潮霉素B基因存在與否，可間接的判斷目的基因是否整合于抗性植株中。經(jīng)3個抗性株系潮霉素B的PCR鑒定結(jié)果（圖5）表明，均在602 bp處出現(xiàn)條帶，與預(yù)期大小相符，初步判斷潮霉素B基因已經(jīng)整合到植物基因組中。

3 討論

在羽衣甘藍(lán)的離體再生中，6-BA和AgNO3具有至關(guān)重要的作用。趙秀樞［7］研究表明，當(dāng)6-BA濃度大于1.5 mg/L時，不定芽質(zhì)量呈下降趨勢，玻璃化現(xiàn)象明顯，而本研究中6-BA濃度5.0 mg/L時，不定芽生成率最高，且無玻璃化現(xiàn)象；但當(dāng)AgNO3的濃度高于9.0 mg/L時出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，不定芽分化率也開始出現(xiàn)下降的趨勢，表明不同品種之間不定芽再分化條件具有較大的差異。另外，羽衣甘藍(lán)的再分化研究中，激素種類和濃度可引起外植體的褐化現(xiàn)象，所以用AgNO3等乙烯抑制劑，防止外植體褐化是必要的［8，9］。

表1 6-BA與AgNO3不同組合對下胚軸不定芽分化率的影響

表2 農(nóng)桿菌濃度（OD600值）對下胚軸的致死率和不定芽分化率的影響

表3 侵染時間對下胚軸致死率和不定芽分化率的影響*

圖3 生根篩選培養(yǎng)基上的芽生長狀態(tài)

圖4 生根篩選培養(yǎng)基上的擬轉(zhuǎn)基因抗性芽生長狀態(tài)

圖5 潮霉素B基因PCR檢測

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究中，選用合理的農(nóng)桿菌的侵染濃度和侵染時間非常重要。菌液濃度過大或感染時間過長，會導(dǎo)致外植體被農(nóng)桿菌侵染過度而致死；反之，會導(dǎo)致受體細(xì)胞未被感染而不能成功進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。同屬于蕓薹屬的甘藍(lán)的遺傳轉(zhuǎn)化研究中，采用OD600為0.4-0.5時，侵染5-8 min［10］；OD600為0.35時，侵染5-10 min［11］；OD600為0.6時，侵染3-5 min［12］，其再分化效果最佳，表明根據(jù)外植體的狀態(tài)可以適當(dāng)調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的侵染濃度及侵染時間。本試驗在保證較高的不定芽分化率前提下，篩選較高農(nóng)桿菌侵染濃度（OD600值為0.5左右）及較長侵染時間（5 min），從而獲得更有效的遺傳轉(zhuǎn)化效率。

潮霉素B對谷子、煙草、甘蔗的不定芽分化均有著強(qiáng)烈的抑制作用［13-15］。本研究的敏感性試驗結(jié)果表明，4.0 mg/L和30.0 mg/L分別為不定芽再分化和生根過程中最適合的篩選壓力。進(jìn)行羽衣甘藍(lán)下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化時，在含有4.0 mg/L的潮霉素B的篩選分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)抗性芽，再轉(zhuǎn)移至含有30.0 mg/L潮霉素B的生根篩選培養(yǎng)基中，進(jìn)一步篩選。該方法可盡量保證獲得的株系是潮霉素B抗性芽，大幅度減少篩選假陽性株系的可能性。

4 結(jié)論

為提高羽衣甘藍(lán)遺傳轉(zhuǎn)化效率，以紅鷗品種的下胚軸為試材，遴選了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)過程中能夠保持較高分化率的載體篩選劑劑量及農(nóng)桿菌的侵染濃度和侵染時間。篩選了MS+6-BA 5.0 mg/L + AgNO39.0 mg/L為最佳不定芽分化培養(yǎng)基；確定了OD600為0.5、侵染時間5 min為最適合的農(nóng)桿菌的侵染條件；確定了不定芽分化和生根過程中潮霉素B濃度的半致死劑量分別為4.0 mg/L和30.0 mg/L；通過優(yōu)化條件獲得的抗性株系，經(jīng)PCR鑒定初步證明潮霉素B抗性基因已整合到羽衣甘藍(lán)基因組中。

［1］ 衛(wèi)志明， 黃健秋， 徐淑平， 等. 甘藍(lán)下胚軸的高效再生和農(nóng)桿菌介導(dǎo)Bt基因轉(zhuǎn)化甘藍(lán)［J］. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報， 1998， 14（2）：11-18.

［2］ 嚴(yán)慧玲， 鞏振輝， 賈慶利. 花椰菜下胚軸培養(yǎng)和高頻率芽再生技術(shù)的研究［J］. 西北農(nóng)林科技大學(xué)報：自然科學(xué)版， 2003，31（4）：87-90.

［3］ 韓曉光， 王玎. 羽衣甘藍(lán)叢生芽誘導(dǎo)和植株再生研究［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2006， 34（3）：454-455.

［4］ 張文玲， 李凌， 劉凡. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)羽衣甘藍(lán)轉(zhuǎn)化體系的建立［J］.西南大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版， 2010， 32（4）：61-65.

［5］ 徐勤青， 劉風(fēng)珍， 萬勇善. 影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)花生遺傳轉(zhuǎn)化率主要因素的研究［J］. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2008， 39（2）：161-165.

［6］ 苑麗霞， 王景雪， 孫毅， 等. 處理時間對農(nóng)桿菌介導(dǎo)甘藍(lán)轉(zhuǎn)化中抗性芽分化率的影響［J］. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2006（2）：27-29.

［7］ 趙秀樞， 李名揚(yáng)， 張文玲， 等. 觀賞羽衣甘藍(lán)高頻再生體系的建立［J］. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 2009， 28（1）：141-148.

［8］ De Block M， Botterman J， Vandewiele M， et al. Engineering herbicide resistance in plants by expression of a detoxifying enzyme［J］. The EMBO Journal， 1987， 6（9）：2513-2518.

［9］ 高武軍， 王景雪， 盧龍斗， 等. 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜基因轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展［J］. 生物學(xué)通報， 2002， 37（6）：10-12.

［10］ 沈革志， 王新其， 朱玉英， 等. TA29-barnase 基因轉(zhuǎn)化甘藍(lán)產(chǎn)生雄性不育植株［J］. 植物生理學(xué)報， 2001， 27（1）：43-48.

［11］ 徐淑平， 衛(wèi)志明， 黃健秋. 青菜的高效再生和農(nóng)桿菌介導(dǎo)Bt及CpTI 基因的轉(zhuǎn)化［J］. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報， 2002，28（4）：253-260.

［12］ 王曉峰， 魯瑞芳， 彭學(xué)賢， 等. 結(jié)球甘藍(lán)外源基因轉(zhuǎn)化再生時的激素條件研究［J］. 西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2000， 28（1）：43-47.

［13］ 王節(jié)之， 郝曉芬， 鄭向陽， 等. 谷子潮霉素抗性濃度的篩選與研究［J］. 華北農(nóng)學(xué)報， 1999， 14（4）：60-62 .

［14］ 王哲， 孫敬克， 王世翔， 等. 煙草潮霉素抗性濃度的篩選與研究［J］. 河南城建學(xué)院學(xué)報， 2009， 18（4）：65-67.

［15］ 姚麗， 吳才文， 曾千春. 甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化中不同階段潮霉素抗性篩選［J］. 中國糖料， 2010（2）：17-19.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Optimization of Agrobacterium-mediated Transformation System for Brassica oleracea var. acephala with Hypocotyls as Explants

Gao Hang1Gao Yuliang2Li Kuihua1
（1. Agricultural College of Yanbian University，Yanji 133002；2. Yanbian Agricultural Sciences Academy，Longjing 133400）

An efficient transformation method for kale（Brassica oleracea var. acephala）cultivar Hongou was developed using hypocotyls as explant tissues with the following 3 steps：firstly optimizing the differentiation system of adventitious buds；secondly investigating the effects of Agrobacterium infection concentration and time on differentiation rate and the selective concentration of Hygromicin B（Hyg）gene during differentiation and rooting of adventitious buds；finally verifying the selective gene Hyg in the resistant plants by PCR. The highest differentiation rate（84.17%）of adventitious buds was found on MS + 6-BA 5.0 mg/L + AgNO39.0 mg/L medium. An infection concentration OD600of Agrobacterium as 0.5 and infection time for 5 min were favorable for genetic transformation， and the differentiation rate was 69.17%. The selective concentration of Hyg during the differentiation and rooting of adventitious buds were 4.0 mg/L and 30.0 mg/L， respectively. Moreover，the amplified specific gene Hyg bands were observed at the expected 602 bp by PCR analysis， which preliminarily demonstrated that the screened gene Hyg was integrated into the B. oleracea var. acephala genome.

Brassica oleracea var. acephala；Agrobacterium infection efficiency；selective concentration of hygromycin B

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.017

2014-10-13

國家自然科學(xué)基金項目（31260470），延邊大學(xué)啟動金項目（2011800-601010018）

高航，女，碩士研究生，研究方向：園藝學(xué)；E-mail：1547493298@qq.com

李葵花，副教授，研究方向：園藝學(xué)；E-mail：khli@ybu.edu.cn