居秀榮，李加友，于建興，丁煜濤，鄒若楠，張景馭，徐濤

（1.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院，浙江杭州 310018；2.嘉興大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江嘉興 314001）

植物天然活性物質(zhì)指構(gòu)成植物體內(nèi)除水分、糖類、蛋白質(zhì)類、脂肪類等必要物質(zhì)外，還包括其次生代謝產(chǎn)物（如苷類、萜類、黃酮、生物堿、甾體、多糖、色素等）。研究發(fā)現(xiàn)，植物天然活性物質(zhì)具有多種生物活性，包括抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗炎、降血糖、降血脂、降血壓、抑菌、提高免疫力、改善肥胖、降低心血管疾病、預(yù)防骨質(zhì)疏松等[1-2]功能。植物天然活性物質(zhì)是重要的醫(yī)藥原料，在醫(yī)療、保健、生物醫(yī)藥領(lǐng)域中占有非常重要的地位，同時(shí)作為添加劑在食品、化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用已成為發(fā)展新方向，具有廣闊的市場空間。

目前，關(guān)于植物天然活性物質(zhì)的提取方法主要有熱水回流提取法、溶劑浸提法、酸（堿）沉淀法、微波輔助提取法、超聲輔助提取法、超微粉碎技術(shù)輔助提取法、酶輔助提取法等。熱水回流提取法工藝簡單，提取劑安全無污染、經(jīng)濟(jì)易得，但需多次浸提、耗時(shí)、廢料、提取率低[3]；溶劑浸提法操作簡單，但回收率低[4]；酸（堿）沉淀法可利用活性物質(zhì)酸堿性差異進(jìn)行提取，但酸（堿）易破壞產(chǎn)物的立體結(jié)構(gòu)和活性，且提取后的液體酸堿中和時(shí)產(chǎn)生大量的鹽；超聲輔助提取法耗時(shí)短，但單位體積的能耗高，也可能會改變活性成分的分子結(jié)構(gòu)[5]；微波輔助提取法省時(shí)高效、無污染，但設(shè)備要求高、規(guī)?；a(chǎn)難以實(shí)現(xiàn)[6]；超微粉碎技術(shù)輔助提取法對活性物質(zhì)提取率的提升最為顯著，但需要專用設(shè)備，提取成本高；酶輔助提取法條件溫和、時(shí)間短、效率高，在多糖、黃酮、油脂、生物堿、三萜皂苷、有機(jī)酸等提取中廣泛應(yīng)用，是一種頗具發(fā)展?jié)摿Φ奶崛》椒╗7]。因此本文從酶輔助提取法的基本原理、優(yōu)勢及影響因素、應(yīng)用及其與其他方法聯(lián)合運(yùn)用等多個(gè)角度綜述近年來國內(nèi)外酶輔助提取植物天然活性物質(zhì)的主要成果和最新進(jìn)展，以期為酶輔助提取植物天然活性物質(zhì)的相關(guān)研究和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供參考。

1 酶輔助提取植物天然活性物質(zhì)的概述

1.1 酶輔助提取植物天然活性物質(zhì)的基本原理

酶輔助提取是一項(xiàng)從植物組織中提取活性物質(zhì)的酶解技術(shù)，即先在提取液中加一定量的酶進(jìn)行預(yù)處理，再以適宜的提取方法進(jìn)行提取。由于植物天然活性物質(zhì)通常被細(xì)胞壁包裹，其結(jié)構(gòu)嚴(yán)密、組分復(fù)雜、機(jī)械強(qiáng)度高，起到支撐保護(hù)細(xì)胞的作用，是活性物質(zhì)的天然屏障。在活性物質(zhì)提取過程中，活性物質(zhì)不僅需要克服細(xì)胞壁的抗降解屏障，還要克服細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)的雙重阻力[8]。酶通過高度專一性和高效的催化性，對細(xì)胞壁進(jìn)行降解，使細(xì)胞質(zhì)中的活性物質(zhì)能夠克服細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)的雙重屏障，并釋放到提取物中。酶輔助提取原理就是利用外源酶（纖維素酶、木質(zhì)素酶、果膠酶、蛋白酶等）對植物細(xì)胞壁的高度選擇性降解，細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)被破壞，植物活性物質(zhì)充分釋放到提取介質(zhì)中，減少活性物質(zhì)溶出及溶劑提取時(shí)的傳質(zhì)阻礙，從而能夠更充分提取活性物質(zhì)、提高反應(yīng)速率和提取率[9]。例如，纖維素酶可以將細(xì)胞壁的主要成分纖維素中的β-D-葡萄糖苷鍵裂解，裂解后的鍵再進(jìn)行催化，故纖維素酶能夠使植物中的活性物質(zhì)浸出。植物細(xì)胞壁酶解過程見圖1。

圖1 植物細(xì)胞壁酶解過程Fig.1 Enzymatic hydrolysis process of plant cell wall

1.2 酶輔助提取植物天然活性物質(zhì)的優(yōu)勢

酶輔助提取具有選擇性高、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)速率快、提取率高、優(yōu)化有效組分、增強(qiáng)活性等優(yōu)點(diǎn)，是一種高效節(jié)能的提取方法，滿足綠色化、低溫化的可持續(xù)行業(yè)發(fā)展需求，近年來，酶輔助提取的快速發(fā)展受到廣泛關(guān)注，已成為植物天然活性物質(zhì)提取的重要手段。酶催化纖維素、果膠等屏障物質(zhì)分解是在溫和條件下完成的，反應(yīng)溫度一般不超過60 ℃。同時(shí)，經(jīng)過酶處理后的植物材料、活性物質(zhì)提取時(shí)通常采用低溫溶劑浸提（傳統(tǒng)方法為高溫浸提），提取溫度大幅降低[10]。由于生物活性物質(zhì)和浸提溶劑的傳遞速率顯著提高，經(jīng)過酶輔助處理的提取時(shí)間更短[11]。另外，添加的纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等可以對部分活性物質(zhì)進(jìn)行修飾，因此酶輔助提取物的生物活性也顯著提高。

1.3 酶輔助提取植物天然活性物質(zhì)的影響因素

提高酶解溫度可以縮短催化時(shí)間，但是部分活性物質(zhì)對溫度敏感，如花青素溫度超過50 ℃時(shí)，降解速率加快。催化時(shí)間過長，也會對部分活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)造成破壞，影響產(chǎn)品品質(zhì)[12]。酶解時(shí)需要調(diào)整體系pH值，滿足酶的最佳催化條件，纖維素酶水解纖維素的適宜pH 值為4.5，但有些活性物質(zhì)的穩(wěn)定性受pH 值影響較大，如青霉素水溶液穩(wěn)定的pH 值為6.0～6.5，在pH4.5 時(shí)會加速青霉素分解。一般情況下，隨著酶用量的增加，活性物質(zhì)的提取率逐步升高[13]。隨著料液比的增加而增加，提取率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，在提取率達(dá)到最大值后繼續(xù)增加提取液總體積，導(dǎo)致酶濃度降低，使活性物質(zhì)提取率降低[14]。因此，酶輔助提取的溫度、時(shí)間、pH 值、酶量以及酶的種類都會對活性物質(zhì)提取產(chǎn)生影響，是相關(guān)工藝開發(fā)過程中需要重點(diǎn)考察的因素。

1.4 酶種類及提取效果

植物細(xì)胞壁具有多層結(jié)構(gòu)，需要使用不同的酶作用于不同的聚合物，分解細(xì)胞壁。根據(jù)植物種類不同，細(xì)胞壁的化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)也不同，分解細(xì)胞壁最常用的酶有纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等，它們通常由微生物和植物產(chǎn)生[7]。

不同酶在各自較適宜的條件下對活性物質(zhì)提取率的影響存在較大差異，其中纖維素酶的提取效果普遍高于半纖維素酶、果膠酶[15]。說明半纖維素酶能將細(xì)胞壁的半纖維素分解成己糖、戊糖等，起到一定的破壁效果，但效果有限。果膠酶可以分解細(xì)胞壁上的果膠質(zhì)，降低細(xì)胞間的黏度。纖維素細(xì)胞壁組分是阻礙活性物質(zhì)析出的最大因素，多糖和果膠質(zhì)的影響效果較小。

另外復(fù)合酶的效果優(yōu)于單一酶，復(fù)合酶對植物天然活性物質(zhì)的細(xì)胞組織較單一酶（無酶）具有更強(qiáng)的分解能力，多酶協(xié)同作用更有利于細(xì)胞壁的分解。但復(fù)合酶之間也會產(chǎn)生相互抑制作用，由于每種酶最適pH值不同，難以協(xié)調(diào)最優(yōu)酶解條件，以致提取活性物質(zhì)效果下降[16]。表1 總結(jié)了不同種類的酶對天然活性物質(zhì)提取的研究實(shí)例。

表1 不同種類的酶對天然活性物質(zhì)提取的研究實(shí)例Table 1 Examples of studies on extraction of natural active substances by different types of enzymes

2 酶輔助提取在天然活性物質(zhì)中的應(yīng)用

2.1 酶輔助提取多糖的應(yīng)用

多糖是由單糖以糖苷鍵連接而成的聚合物，是中藥開發(fā)領(lǐng)域的重要研究方向。隨著新技術(shù)的不斷發(fā)展和探索，酶輔助提取植物多糖得到了廣泛應(yīng)用。

Shang 等[33]對比了傳統(tǒng)熱水提取法及酶輔助提取法對白三葉草多糖提取的工藝，發(fā)現(xiàn)酶輔助提取的白三葉草多糖較傳統(tǒng)熱水提取法提高了26.59%。丁霄霄等[27]在正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面法優(yōu)化了酶輔助提取靈芝多糖的提取條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酶法提取溫度和時(shí)間分別為50 ℃和81 min，靈芝多糖提取率為3.73%。綜上，與傳統(tǒng)熱水提取法相比，酶輔助提取法能夠縮短提取時(shí)間、降低提取溫度、提高提取率，并且大幅度減少能源消耗。因此，酶輔助提取法是一種節(jié)能環(huán)保的提取方法。

酶輔助提取法對于提高多糖的活性也具有重要意義。項(xiàng)飛兵等[28]在酶輔助提取茯苓多糖過程中發(fā)現(xiàn)，所得茯苓多糖提取液的抗氧化能力是水提法的2.9 倍。Liu 等[34]比較不同提取方法提取山藥多糖的乳化特性表明，酶輔助提取的多糖組分具有更好的乳化活性和穩(wěn)定性。Ai 等[35]研究了水提法和酶輔助提取黑桑椹多糖的結(jié)構(gòu)特征和體外發(fā)酵模式，結(jié)果表明，酶輔助提取顯著提高了多糖得率，同時(shí)改變了多糖的化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了黑桑葚多糖的發(fā)酵性能和益生潛力。由此可見，與傳統(tǒng)水提法相比，酶輔助提取法能提高多糖的生物活性，如增強(qiáng)抗氧化、穩(wěn)定性和發(fā)酵性等活性。

2.2 酶輔助提取黃酮的應(yīng)用

黃酮的基本骨架具有C6-C3-C6 的特點(diǎn)，即由兩個(gè)芳香環(huán)A 和B，通過中央三碳鏈相互連結(jié)而成的一系列化合物，具有多種良好的生物活性，廣泛存在于各類植物中，但是含量較低。目前提取黃酮的主要方法為乙醇浸提，而溶劑殘留與回收問題會導(dǎo)致工藝復(fù)雜化，應(yīng)用酶法打破細(xì)胞壁釋放，有效地避免有機(jī)溶劑殘留，并提高提取率。

詹力等[29]在用酶輔助提取桑葉異槲皮苷、紫云英苷、蘆丁等黃酮類物質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)品得率分別比同等條件下乙醇浸提提高了60.37%、42.42%、24.74%。Jiao 等[17]在沙棘果皮渣黃酮提取的研究中發(fā)現(xiàn)，酶輔助提取法的黃酮類化合物得率從4.34 mg/g 提高到8.04 mg/g。賈冬舒等[36]對比了不同提取方法對稻殼中黃酮的提取，得率分別為0.6%（乙醇浸提法）、0.62%（超聲協(xié)同酶輔助提取法）、0.72%（酶輔助提取法）。酶輔助提取法更有助于黃酮類物質(zhì)溶出，且提取時(shí)間是乙醇浸提法的1/3。綜上，與傳統(tǒng)乙醇浸提法相比，酶輔助提取黃酮不僅具有乙醇浸提法的優(yōu)勢，更重要的是可以邊分解基質(zhì)中纖維素邊利用乙醇快速侵入，在同等條件下提取率顯著提高，原料殘?jiān)陀袡C(jī)溶劑的用量減少。

酶輔助提取法在提高黃酮活性上具有重要意義。De Queirós 等[37]研究了酶輔助提取對全脂大豆粉水提物中生物活性成分異黃酮苷元的可提取性、生物轉(zhuǎn)化率、生物利用度、總酚含量和抗氧化活性的影響。結(jié)果顯示，與對照試驗(yàn)相比，大豆苷元和染料木素黃酮的濃度分別從29.0 μg/g 增加到158.2 μg/g 和從27.0 μg/g增加到156.5 μg/g，酶輔助提取法提取后經(jīng)體外消化可顯著提高異黃酮苷元的生物利用度，總酚含量提高了22%～45%、抗氧化活性提高了15%～22%。于翠翠等[30]通過對比不同提取方法提取蕪菁黃酮抗氧化能力后發(fā)現(xiàn)，酶輔助提取黃酮對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率為95.65%，比水提法和超聲-醇提法分別提高了5.95%和0.96%，酶輔助提取黃酮對羥基自由基清除能力為90.40%，比水提法和超聲-醇提法分別提高了14.84%和49.74%。同時(shí)，酶輔助提取黃酮總抗氧化能力為9.04 U/mL，比水提法提高了22.16%。由此可見，酶輔助提取法可以增強(qiáng)植物黃酮的生物轉(zhuǎn)化率、生物利用度、抗氧化等活性。

2.3 酶輔助提取油脂的應(yīng)用

目前，應(yīng)用酶輔助提取植物油脂多達(dá)十幾種，許多研究將水提法與生物酶制劑相結(jié)合，形成水酶法提油技術(shù)。酶的添加可以破壞植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，降解脂多糖和脂蛋白的降解，有利于油脂釋放，提高油脂的提取率。因此，酶輔助提取技術(shù)已經(jīng)成為油脂類活性物質(zhì)生產(chǎn)的常用工藝。

許萬樂[31]在紫蘇籽油的提取中使用了蛋白酶和纖維素酶。在復(fù)合酶用量2.4%、液料比4∶1（mL/g）、酶解溫度55 ℃、酶解時(shí)間3.5 h 的條件下，紫蘇籽油的得率為74.25%，與理論值相符合。王凱等[23]使用果膠酶對油菜蜂花粉進(jìn)行破壁處理，最佳破壁條件下，即pH 3.5、溫度50 ℃，蛋白分散指數(shù)和可溶性糖含量明顯增加，同時(shí)花粉顆粒的孔洞面積增加39.20%，1 μm 以下粒徑范圍內(nèi)的花粉碎片增加339.92%。De Souza 等[26]研究了水提取和酶輔助提取對杏仁餅油脂的影響。結(jié)果顯示，酶輔助提取的油脂提取率為29.1%，比水提法提高了11.07%。此外，酶輔助提取的奶油乳液更容易破乳，化學(xué)破乳后的乳膏回收率為98.7%，而水提法的乳膏回收率僅為62.8%。因此，酶輔助提取植物油不僅提高了活性物質(zhì)的得率，而且具有良好的破乳效果。

申愛榮等[38]研究發(fā)現(xiàn)，酶輔助提取光皮樹果實(shí)油精煉后色澤淺、透明澄清，折光指數(shù)、相對密度、不飽和脂肪酸濃度較高，品質(zhì)優(yōu)于常規(guī)的榨取法、水提法、化學(xué)溶液浸提法和索氏抽提法得到的油。Xu 等[25]采用酶輔助提取米糠油，并與索氏提取油進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，酶輔助提取的油脂的碘值和皂化值均高于索氏提油。且中蠟和磷脂含量較低，可簡化精制步驟。酶輔助提取的油脂中不飽和脂肪酸（76.31%）、生育酚和生育三烯醇（1 004 mg/kg）、甾醇（7 749 mg/100 g）、角鯊烯（2 962 mg/kg）、谷草素（2.43 g/100 g）含量較高。另外，酶輔助提油的抗氧化活性（EC50=5.52 mg/mL）優(yōu)于索氏提取油（EC50=8.66 mg/mL）?？梢?，酶輔助提取法可以明顯提高植物油品質(zhì)。

2.4 酶輔助提取生物堿的應(yīng)用

生物堿是一類含氮有機(jī)物，大多數(shù)存在于植物中。在醫(yī)藥和農(nóng)藥領(lǐng)域，生物堿的應(yīng)用引起了廣泛關(guān)注。近年來，有許多方法用于生物堿的提取，其中酶輔助提取的應(yīng)用日益增多。

韓建軍等[39]以酶輔助提取黃連中小檗堿及總生物堿，確定了最佳提取工藝，與傳統(tǒng)冷浸提取工藝相比，酶輔助提取的小檗堿及總生物堿提取率分別提高了25.47% 和30.46%。薛璇璣等[40]通過對比不同提取方法提取的拐棗七總生物堿，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酶輔助半仿生法的效率明顯高于其他幾種方法。其中，采用復(fù)合酶輔助半仿生法得到的總生物堿含量比半仿生法提高了29.3%，比復(fù)合酶提取法提高了15.4%。鄧志勇[41]使用酶輔助提取法提取葉下珠中的總生物堿，發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)酸水浸泡法相比，酶輔助提取法具有更短的時(shí)間、更高的提取率和更低的能耗。植物中生物堿含量低，而酶輔助提取法能增加植物細(xì)胞內(nèi)容物的溶出量，利用該技術(shù)提取生物堿的簡單易行、所需設(shè)備少、污染少、產(chǎn)品得率高，為未來的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

張玥等[21]為綜合利用石斛資源，分析測定傳統(tǒng)法及酶輔助提取法對石斛水提液清除DPPH 自由基及羥基自由基能力的影響，測定結(jié)果表明，經(jīng)7.5 U 果膠酶處理的石斛上清液對DPPH 自由基及羥基自由基的IC50值分別為1.25 mg/mL 和4.1 mg/mL，而傳統(tǒng)提取法得到的上清液的IC50值分別為6.50 mg/mL 和6.25 mg/mL，兩者相差較大。由此可見，酶輔助提取法可以增強(qiáng)活性物質(zhì)的抗氧化活性。

2.5 酶輔助提取皂苷的應(yīng)用

皂苷又名皂素，是一類重要的次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物莖、葉和根，作為中草藥的活性成分有著廣泛的應(yīng)用。皂苷提取主要先用醇提取，再用有機(jī)溶劑萃取法，也可以在酶輔助提取條件下提高得率。

在研究蕪菁總皂苷提取率的過程中，證實(shí)了酶輔助提取法與水提法相比能顯著提高總皂苷的提取率[30]。鄭林祿等[22]在仙人掌皂苷試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，酶輔助乙醇法提取仙人掌皂苷的得率為18.25%，比傳統(tǒng)的單純乙醇提取法提高了57.46%。此外，酶輔助提取法還能大大縮短提取時(shí)間，具有短時(shí)高效的特點(diǎn)。Le Thao My 等[42]研究了酶輔助提取人參皂苷Rb1 的提取率，結(jié)果顯示其為25.1 mg/g，比傳統(tǒng)的乙醇浸提法（13.5 mg/g）提高了85.93%。綜上，乙醇濃度可能導(dǎo)致人參皂苷的溶解，而細(xì)胞壁的剛性和復(fù)雜性會抑制人參皂苷的釋放，從而減少兩者之間的接觸，導(dǎo)致人參皂苷Rb1 含量較低，通過應(yīng)用酶水解反應(yīng)，可以引起細(xì)胞壁的降解，進(jìn)而提高皂苷的提取率。結(jié)果表明，酶輔助提取法在提取皂苷過程中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

顏廷才等[43]以酶輔助提取法制備楤木嫩芽皂苷，結(jié)果表明，經(jīng)過β-葡萄糖苷酶酶解后，遼東楤木嫩芽皂苷黏度明顯減小，顏色變?yōu)闇\黃，溶解度增大，揮發(fā)性增加，刺激性氣味增強(qiáng)，甜度降低。這是因?yàn)棣?葡萄糖苷酶酶解了部分單糖，使皂苷單體分子變得更小，單體數(shù)量減少，從而改變其物理化學(xué)特性，提高了其對自由基的清除效果?？梢?，酶輔助提取能夠顯著提高皂苷的抗氧化能力。

2.6 酶輔助提取有機(jī)酸的應(yīng)用

有機(jī)酸指具有酸性的有機(jī)化合物，有綠原酸、迭香酸、總酚酸、丹酚酸等。酶輔助提取有機(jī)酸的優(yōu)勢日益顯著。酶作為一種有效的催化劑，可以幫助提取、修飾或合成天然來源的復(fù)雜生物活性化合物。因此，酶輔助提取植物有機(jī)酸的技術(shù)研究和生產(chǎn)應(yīng)用日益增多。

Ferri 等[44]對分步酶解麥麩提取阿魏酸的方法進(jìn)行研究，首先用堿性蛋白酶和耐熱淀粉酶進(jìn)行預(yù)處理，去除蛋白質(zhì)和糖類。然后用戊聚糖酶和阿魏酸酯酶進(jìn)行酶解，使苯酚溶解，得到最大阿魏酸產(chǎn)量0.82～1.05 g/kg。該工藝步驟較少，并且不需要使用緩沖劑、強(qiáng)酸/強(qiáng)堿或有毒化合物。黃丹丹等[45]探究了酶（纖維素酶）輔助提取對紫蘇葉中迷迭香酸的優(yōu)勢。結(jié)果顯示，采用纖維素酶輔助提取可以獲得6.17%的迷迭香酸提取率。這種方法具有選擇性高、提取時(shí)間短、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。通過去除紫蘇葉的細(xì)胞壁，使迷迭香酸大量溶出，從而顯著提高迷迭香酸得率。Cho 等[46]研究了酶輔助對微藻脂質(zhì)提取的影響。結(jié)果顯示，經(jīng)酶解后，微藻總脂肪酸甲酯產(chǎn)率比未進(jìn)行酶解時(shí)提高了1.10～1.69 倍?？朔藗鹘y(tǒng)提取法的溫度高、時(shí)間長等問題。綜上，酶輔助提取中草藥中有機(jī)酸可以作為一種潛在的替代溶劑提取方法。

El Sayed Mehanni 等[47]比較了酶輔助水提法和有機(jī)溶劑提取法從沙漠棗仁中提取油時(shí)的理化性質(zhì)。結(jié)果表明，與有機(jī)溶劑提取法相比，酶輔助水提法所得到的油具有更低的酸值、過氧化值、顏色強(qiáng)度和磷脂含量。由此可見，酶輔助提取沙漠棗仁油的工藝環(huán)保，不需要有機(jī)溶劑，不會產(chǎn)生有害廢物。這不僅有利于員工的安全，而且利于環(huán)境保護(hù)。此外，磷脂保留在殘余固相中，無需脫膠，降低精煉成本。

3 酶輔助提取法的聯(lián)合運(yùn)用

隨著天然活性物質(zhì)的提取技術(shù)不斷成熟，酶輔助提取法由單獨(dú)應(yīng)用發(fā)展為多種技術(shù)聯(lián)合運(yùn)用，例如，酶-超聲波輔助提取、酶-微波輔助提取、酶-微波-超聲波輔助提取、酶-表面活性劑輔助提取、酶-離子液體輔助提取等。這些技術(shù)的組合使用，改善了單獨(dú)使用活性物質(zhì)提取技術(shù)的不足，提高了活性物質(zhì)的提取率，將成為未來活性物質(zhì)提取的發(fā)展趨勢。

3.1 酶-超聲波輔助提取

超聲波提取法是一種常用的活性成分提取方法，利用聲波的空化作用和機(jī)械作用使細(xì)胞瞬間破裂，加速溶劑滲透藥材，促進(jìn)活性成分的釋放，從而縮短提取時(shí)間，降低提取溫度[48]。而經(jīng)過酶預(yù)處理的酶輔助提取同樣加速了細(xì)胞壁的破裂，提高了有效成分的提取率。冀德富等[49]優(yōu)選酶輔助超聲波提取防己總生物堿，結(jié)果顯示總生物堿提取率（3.92%）明顯高于單純用回流（1.78%）、酶輔助（1.47%）和超聲波法（1.35%）。此外，田春蓮等[50]以酶輔助超聲波協(xié)同提取石蒜屬植物生物堿，提取效果顯著，且復(fù)合酶輔助提取法較單一酶的效果更為顯著。辛明等[51]通過比較水提法、酶提法、醇提法和超聲波協(xié)同復(fù)合酶4 種不同提取方法對圣女果皂苷提取率的影響，得出酶輔助超聲波協(xié)同提取為最佳提取方法。由此，酶-超聲波輔助提取法更省時(shí)高效，提取率明顯高于單獨(dú)使用酶輔助提取法或超聲波法。

3.2 酶-微波輔助提取

微波提取法利用微波熱效應(yīng)及電磁波的作用，使細(xì)胞內(nèi)溫度及壓力升高，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂，并加速分子運(yùn)動[52]。Ma 等[53]利用酶輔助微波提取法制備澳洲堅(jiān)果油。通過優(yōu)化提取條件（提取溫度50 ℃、提取時(shí)間64 min、酶濃度1.60%、照射功率450 W），在最佳條件下，油產(chǎn)量為58.09%，通過氣相色譜-質(zhì)譜分析顯示，與索氏提取相比，酶輔助微波提取的堅(jiān)果油中存在更多氣味成分，并且具有更優(yōu)異的理化性質(zhì)。此外，酶輔助微波提取的油還具有卓越的抗氧化能力。綜上所述，酶輔助微波提取法具有顯著的提取效果，并更好地保留了堅(jiān)果油的香氣和功能，與不可持續(xù)和不環(huán)保的傳統(tǒng)方法相比，保留了風(fēng)味物質(zhì)的初始成分，并增強(qiáng)了堅(jiān)果油中健康有益化合物的提取。酶-微波輔助提取的聯(lián)合使用可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)能量升高，從而改變了細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及其理化性質(zhì)，進(jìn)而影響活性成分的釋放。因此，酶輔助微波提取油可用于開發(fā)功能性食用油，甚至可以用于藥用、化妝品和藥物制劑。

3.3 酶-微波-超聲波輔助提取

在使用酶法、微波和超聲單獨(dú)提取活性物質(zhì)時(shí)，存在一定的缺點(diǎn)。當(dāng)3 種方法共同作用時(shí)，會加速細(xì)胞壁的破裂，使活性物質(zhì)更快地溶于浸提液中，能更好地避免活性物質(zhì)提取過程中的問題。Yin 等[54]將酶-微波-超聲輔助提取法應(yīng)用于提取香菇多糖，評價(jià)了與其他提取方法（包括熱水提取、酶輔助提取、微波輔助提取和超聲輔助提取）在多糖的產(chǎn)量、性質(zhì)和抗氧化活性方面的差異。結(jié)果表明，在優(yōu)化的提取條件（酶解溫度48 ℃、酶促pH5.0、微波功率440 W、微波時(shí)間10 min）下，多糖提取率為9.38%。與熱水回流、酶輔助、超聲輔助和微波輔助提取相比，酶-微波-超聲輔助提取方法的多糖得率分別提高了50.32%、26.59%、16.38%和8.56%。此外，不同提取方法得到的香菇多糖都表現(xiàn)出抗氧化活性，但與其他方法相比，酶-微波-超聲輔助提取的多糖具有最高的還原力。因此，微波-超聲-酶三者的協(xié)同作用在很大程度上提高了多糖的提取率，縮短了提取時(shí)間，降低了提取溫度和液料比，實(shí)現(xiàn)了能源、時(shí)間和物料成本的節(jié)約，并提高了生產(chǎn)效益。

3.4 酶-表面活性劑輔助提取

表面活性劑是一種能夠活躍于表面和界面上的物質(zhì)，它能降低溶劑與物料之間的界面張力，使得物料更容易浸潤，微溶或不溶的物質(zhì)得以溶解。Papaioannou等[55]用酶輔助表面活性劑（Span 20）提取番茄果皮紅素以提高番茄紅素的提取率。傳統(tǒng)有機(jī)溶劑提取方法效率低，溶劑分子難以穿透番茄皮的致密組織并溶解色素。但將酶制劑與表面活性劑輔助提取結(jié)合，先用酶對番茄皮進(jìn)行預(yù)處理，然后再用表面活性劑進(jìn)行提取，與未經(jīng)過酶處理的番茄皮相比，提取率提高了4～10 倍。Yu 等[56]采用酶輔助（表面活性劑）提取黑胡椒中的風(fēng)味物質(zhì)胡椒堿，在優(yōu)化條件下，胡椒堿的含量從0.16% 顯著提高到4.54%，酶解可以有效促進(jìn)黑胡椒細(xì)胞的破壞，加速風(fēng)味物質(zhì)的釋放，而表面活性劑可減少酶的失活。綜上，利用表面活性劑的增溶作用協(xié)同酶輔助提取天然活性成分，可以提高酶的水解效率，降低物質(zhì)之間的張力，使得溶劑分子更易滲入顆粒中。表面活性劑不僅成本較低，容易在食品和化妝品行業(yè)中使用。同時(shí)避免使用有機(jī)溶劑，更加環(huán)保，是一種提取中藥有效成分的新方法。

3.5 酶-離子液體輔助提取

離子液體是一種新型綠色溶劑，具有很強(qiáng)的溶解能力，飽和蒸汽壓小、揮發(fā)性低、綠色無污染、可循環(huán)。封易成等[57]使用酶（纖維素酶）輔助離子液體提取山楂有機(jī)酸。離子液體（溴化-1-丁基三甲基咪唑）濃度0.039 mol/L、纖維素酶添加量1.059%、液料比29.84∶1（mL/g）、浸提溫度55℃、浸提時(shí)間25.3 min，該條件下得到有機(jī)酸提取率為16.42%。通過高效液相色譜分析，與傳統(tǒng)水浸泡法相比，酶輔助離子液體提取法得到的有機(jī)酸（檸檬酸）含量提高了2.50%。此外，酶輔助離子液體有效地縮短了提取時(shí)間，提高了山楂有機(jī)酸的提取率。Liu 等[58]也提出了一種基于離子液體的酶輔助提取杜仲綠原酸的新方法?？偠灾?，經(jīng)過酶處理的細(xì)胞壁在離子液體溶液中進(jìn)行提取，降低了傳質(zhì)屏障，提高了提取效率。離子液體具有良好的溶解性能，可溶解有機(jī)和無機(jī)物質(zhì)。與普通有機(jī)溶劑相比，離子液體的極性、疏水性、黏性和溶劑混溶性可以通過改變陽離子、陰離子和取代基進(jìn)行調(diào)整。與其他傳統(tǒng)提取技術(shù)相比，酶-離子液體輔助提取法在產(chǎn)量和效率方面具有優(yōu)勢，是一種有前景且有效的技術(shù)，可在更短的時(shí)間內(nèi)保證更高的產(chǎn)量。

4 酶輔助提取天然活性物質(zhì)存在的問題與展望

綜上所述，植物天然活性物質(zhì)的提取方法有很多。與傳統(tǒng)提取法相比，酶輔助提取工藝具有很多技術(shù)上的優(yōu)越性，在高效、綠色天然活性物質(zhì)提取的可持續(xù)發(fā)展方面表現(xiàn)出巨大潛力。然而，隨著酶輔助提取在植物活性物質(zhì)提取中的研究和應(yīng)用增多，部分不足之處受到了重視和關(guān)注。例如：1）部分酶制劑的價(jià)格高，用量大，導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加；2）適用材料、代謝物和所需酶（酶種類、酶解溫度、時(shí)間、pH 值、濃度）的最佳工藝對于酶輔助提取法的高效應(yīng)用至關(guān)重要；3）在酶輔助提取同時(shí)，含有多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)較多；4）產(chǎn)生大量的有機(jī)酸、多肽等活性物質(zhì)的廢水，然而現(xiàn)階段對廢水中有價(jià)值的副產(chǎn)物進(jìn)行直接回收研究較少。

目前，本課題組已經(jīng)建立了一種生物酶原位定向降解植物細(xì)胞壁提取天然活性物質(zhì)的技術(shù)路線。即通過專用菌種的篩選、生物酶的原位代謝和細(xì)胞壁的定向生物降解、提取工藝再優(yōu)化等步驟，成功地解決了酶的選擇、用量和比例等難題，并解決了生產(chǎn)成本高的問題。充分利用酶輔助提取的優(yōu)勢，在靈芝、黃芪、桔皮等多種中藥材的活性物質(zhì)提取中得到良好的應(yīng)用效果[59]。對于提取液中的雜質(zhì)，在后期可以結(jié)合大孔樹脂純化工藝進(jìn)行處理。對于酶處理后產(chǎn)生的廢水，可進(jìn)一步用于沼氣或堆肥生產(chǎn)，或用于更有價(jià)值的應(yīng)用，如食品和飼料原料的生產(chǎn)。此外，酶輔助提取技術(shù)與其他方法聯(lián)合運(yùn)用，能夠彌補(bǔ)單獨(dú)使用的不足，揚(yáng)長避短。綜上，酶輔助提取技術(shù)具有簡單、高效和溫和的提取條件，為工業(yè)化應(yīng)用拓展提供了發(fā)展基礎(chǔ)，相信在未來酶輔助提取技術(shù)將會有廣闊的發(fā)展前景。