摘 要：目的：建立茶飲料中咖啡因、茶多酚總量、兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素的一測多評法。方法：采用HPLC法，以咖啡因為內參物，計算茶多酚總量，其余5種多酚物質的相對校正因子，并考察相對校正因子的穩(wěn)定性，比較外標法和一測多評法對茶飲料中7個指標的測定結果。結果：6種被測物質的相對校正因子分別為兒茶素0.34、沒食子酸1.41、表兒茶素0.86、表沒食子兒茶素沒食子酸酯0.80、表沒食子兒茶素1.53、茶多酚總量133.91。相對校正因子在不同含量樣品下的RSD為2.95%～8.78%，均小于10%，穩(wěn)定性良好。一測多評法和外標法所得茶飲料中7個指標的含量在統(tǒng)計學上無明顯差異。結論：建立的一測多評法準確、可靠，可為茶飲料的質量控制提供參考。

關鍵詞：茶飲料；色譜法；一測多評；茶多酚；咖啡因

Determination of Caffeine， Total Amount of Tea Polyphenols and Their Five Main Components in Tea Beverages by Using a One Test Multiple Evaluation Method

LI Yuhong， CHEN Jia*， WEI Zhichao， YU Zheyuan

（Zhangye Quality Inspection and Testing Institute， Zhangye 734000， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of caffeine， total amount of tea polyphenols， catechin， gallic acid， epicatechin， epicatechin gallate and epicatechin in tea beverages. Method： HPLC was used to calculate the total amount of tea polyphenols and the relative correction factors of other 5 polyphenols， and to investigate the stability of the relative correction factors. The results of 7 indexes in tea beverage were compared between external standard method and one test and multiple evaluation method. Result： The relative correction factors of the 6 tested substances were catechin 0.34， gallic acid 1.41， epicatechin 0.86， epicatechin gallate 0.80， epicatechin 1.53， and total tea polyphenols 133.91， respectively. RSD of relative correction factors in different samples ranged from 2.95% to 8.78%， all of which were less than 10%， indicating good stability. There was no significant difference in the contents of 7 indexes in tea beverages obtained by one test and multiple evaluation method and external standard method. Conclusion： The established method is accurate and reliable， and can provide reference for the quality control of tea beverage.

Keywords： tea beverage; chromatography; one test with multiple evaluations; tea polyphenols; caffeine

茶文化在我國擁有悠久的歷史和豐富的內涵，作為世界上最大的茶葉生產國，我國茶資源十分豐富。隨著社會的發(fā)展和人們生活水平的提高，茶文化也得到了長足的發(fā)展。茶飲料在繼承我國傳統(tǒng)飲茶文化的前提下，作為一種飲用便捷，同時兼具傳統(tǒng)茶葉提神解渴功效的飲品，越來越受到消費者的青睞。茶飲料一般是指采用茶葉的濃縮液、萃取液、茶粉為主要原料加工而成的飲料，具有茶葉的獨特風味，其含有的茶多酚是重要的生理活性物質，有抗氧化、抗癌、降低血糖血壓、防治心血管疾病以及抗衰老等多種保健功能[1-4]。根據《茶飲料》（GB/T 21733—2008）的規(guī)定[5]，茶飲料按產品風味分為調味茶飲料、茶飲料（茶湯）、復（混）合茶飲料及茶濃縮液4類，目前市場上主要以調味茶飲料為主。該標準對不同茶飲料中茶多酚類物質總量以及咖啡因含量進行了明確的規(guī)定。

茶多酚為混合物[6-7]，最主要的成分是多酚類化合物，還含有兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素等多酚類物質。GB/T 21733—2008標準規(guī)定，茶多酚的測定采用分光光度法[5]。雖然該方法可以根據多酚類物質與亞鐵離子的特異性顯色反應對茶多酚進行定量，但過程較為煩瑣，實驗人員的操作方式、顯色時間和顯色條件等對實驗結果可能產生明顯影響，為大量樣品的檢驗帶來不便。本文采用液相色譜法，實現了對咖啡因、茶多酚中主要組分兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素的定量分析，并找到了其與茶多酚總量間的定量關系，有效避免了紫外分光光度法帶來的試劑用量大、系統(tǒng)誤差大的弊端，提高了準確度和檢驗效率。

茶飲料中主要生物活性成分為咖啡因和茶多酚，在國標GB/T 21733—2008中也將這兩種主要成分作為質量控制指標，咖啡因和茶多酚均是由茶葉天然代謝生成的物質，所以可以預見，上述成分間存在相關性。一測多評法（QAMS法）[8]是利用天然樣品不同成分內在含量關系和比例關系，通過只測定一個或幾個成分，實現對相關的其他多個成分的同步測定。因此，為了提高茶飲料中茶多酚的分析效率，同時兼顧檢驗成本，本研究嘗試采用一測多評法，通過對茶飲料中茶多酚總量，咖啡因及茶多酚主要組分兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素進行定量分析，找到茶飲料中咖啡因與茶多酚總量、兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素之間存在的關系，從而得到相對校正因子，旨在以咖啡因為標準物，建立茶多酚總量、兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素的一測多評法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

現制現售綠茶飲料，購買于本地市場。

沒食子酸標準品、兒茶素標準品、咖啡因標準品、表兒茶素標準品、表沒食子兒茶素沒食子酸酯標準品和表沒食子兒茶素標準品，純度均≥98%，阿拉丁試劑有限公司；福林酚試劑（分析純），上海國藥集團；甲醇（色譜純），上海麥克林；甲酸（色譜純），上海國藥集團；無水乙醇（分析純），上海國藥集團；實驗用水為密理博純水系統(tǒng)（美國）制得的超純水。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜（LC-20AD，配備二極管陣列檢測器與Labsolution工作站），日本島津；分析電子天平（賽多利斯GL323-1SCN），奧豪斯國際貿易（上海）有限公司；超聲波清洗機（HN-30AL），上海漢諾；紫外-可見分光光度計（I9），海能未來技術集團股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 茶多酚總量的測定

（1）樣品制備。樣品按GB/T 21733—2008附錄A 3.1.2進行制備。稱取25 g樣品于50 mL離心管中，加入15 mL 95%乙醇，渦旋混勻。靜置15 min后，轉移至50 mL容量瓶并加水定容至刻度線，濾紙過濾后備用。

（2）茶多酚含量測定。按GB/T 21733—2008附錄A 3.2進行測定。在540 nm波長下分別測定試液底色的吸光度和試液顯色后的吸光度。茶多酚總量的計算公式為

X=（A1-A2）×1.957×2×K×1 000/m（1）

式中：X為樣品中茶多酚含量，mg·kg-1；A1為試液顯色后的吸光度；A2為試液底色的吸光度；1.957為用10 mm比色皿，當吸光度等于0.50時，1 mL茶湯中的茶多酚含量相當于1.957 mg；K為稀釋倍數；

m為測定時稱取試液的質量，g。

1.3.2 兒茶素、沒食子酸、咖啡因、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素的測定

（1）樣品制備。參照康明艷等[9]的方法，稱取20 g茶飲料于50 mL離心管中，加入80%乙醇稀釋并定容至刻度，渦旋1 min，過0.45 μm濾膜后，作為供試品溶液待用。

（2）標準溶液的配制。精密稱取兒茶素、沒食子酸、咖啡因、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素標準品10 mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成100 μg·mL-1的混合標準品儲備溶液；分別用經過檢定的合適規(guī)格移液器吸取標準品儲備液50 μL、100 μL、150 μL、200 μL、250 μL、300 μL、600 μL、800 μL和1 000 μL于進樣小瓶中，用水稀釋至1 mL，制成5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、15 μg·mL-1、20 μg·mL-1、25 μg·mL-1、30 μg·mL-1、60 μg·mL-1、80 μg·mL-1和100 μg·mL-1的上述組分混合標準品工作溶液。

1.3.3 HPLC二極管陣列色譜條件

檢測波長：280 nm；液相色譜柱：安捷倫-USHKB03750-C18（4.6 mm×150 mm，4 μm）；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；流動相：甲醇∶乙腈∶冰醋酸∶水=230∶60∶2∶708；流速：1.0 mL·min-1；分析時間：18 min。

1.3.4 校正因子的確定

相對校正因子的確定借鑒了王敏等[10]的方法，根據茶飲料的成分進行進一步優(yōu)化以適用本次研究。按照1.3.2～1.3.3外標法定量得到咖啡因、兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素的濃度；1.3.1紫外法得到茶多酚總量的濃度。以咖啡因（純度≥98%）為標準物（s），建立兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素和茶多酚總量的相對校正因子（Relative Correlation Factor，RCF）。相對校正因子的計算公式為

RCF=Ci/Cs（2）

式中：Ci為相應的多酚物質的濃度，μg·mL-1；Cs為標準物的濃度，μg·mL-1。

在確定保留時間穩(wěn)定的基礎上，采用絕對含量法，計算待測成分與標準物的絕對含量比值，并以此作為確定校正因子的依據。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 流動相的選擇

利用HPLC分析測定時，不僅要考慮兒茶素、沒食子酸和咖啡因之間的分離情況，還要考慮樣品中其他成分對待測組分的干擾，因此在色譜條件下，應選擇合適的流動相，使咖啡因、兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素在合理的時間內與樣品中其他組分完全分離[11]。實驗中流動相的選擇參照《茶飲料和調味茶飲料中咖啡因和5種兒茶素類（兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素）含量的測定 高效液相色譜方法》（DB22/T 1671—2012）[12]，以甲醇-乙腈-冰醋酸-水作為流動相，這是因為表沒食子兒茶素沒食子酸酯在甲醇中的穩(wěn)定性較差，24 h后會部分轉化成其他兒茶素類化合物[13]，而乙腈可以減小表沒食子兒茶素沒食子酸酯的降解速度，使表沒食子兒茶素沒食子酸酯能夠分離出來；而冰醋酸可以抑制共聚物的生成，減少樣品中其他組分的干擾，進一步改善分離效果。

2.1.2 色譜波長的選擇

借鑒莫燕霞等[14]的方法，選擇280 nm作為兒茶素、沒食子酸、咖啡因、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素的定量波長?；旌蠘藴势芳皹悠飞V圖見圖1。

2.1.3 線性關系

取“1.3.2（2）標準溶液配制”項下的混合標準品工作溶液，上機進行測定，進樣量為10 μL，測定兒茶素、沒食子酸、咖啡因、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素的峰面積，用外標法進行定量，以組分濃度（X）與峰面積（Y）建立線性回歸方程。由表1可知，6種被測組分在5～100 μg·mL-1線性關系良好。

2.1.4 重復性與精密度

按照“1.3.2樣品制備”處理6份樣品溶液，“1.3.3色譜條件”進行上機測定，分別計算咖啡因、兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素的峰面積，試驗測定6次。結果表明，被測樣品中各組分峰面積的RSD分別為咖啡因4.31%、兒茶素4.36%、沒食子酸3.79%、表兒茶素4.21%、表沒食子兒茶素沒食子酸酯3.11%、表沒食子兒茶素2.98%，各組分的RSD均≤5.0%，表明該方法的重復性良好。根據樣品中各組分的含量，確定取30 μg·mL-1的混合標準品溶液，按照“1.3.3”色譜條件，連續(xù)測定6次，測量精密度。結果表明，

6次測定中各組分峰面積的RSD分別為咖啡因2.04%、兒茶素1.99%、沒食子酸1.79%、表兒茶素2.14%、表沒食子兒茶素沒食子酸酯2.31%、表沒食子兒茶素1.37%，各組分的RSD均≤5.0%，表明該方法的精密度良好。

2.1.5 回收率與準確度

準確稱取20 g已知各組分含量的茶飲料，加入1 mL濃度為100 μg·mL-1的混合標準品溶液，制成相當于含本底值基礎上增加100 μg的加標樣品，按照“1.3.2”項下方法對上述加標樣品進行處理后，上機測量，回收率結果如表2所示。

由表2可知，各組分的回收率在90.0%～95.0%，平均值為93.2%，各組分回收率在90.0%～105.0%，表明該方法的準確性良好。

2.2 一測多評法的評價

2.2.1 相對校正因子的評價

按“1.3.2（1）”項制備4份樣品，定容體積分別為50 mL、100 mL、150 mL、200 mL，制成4份不同稀釋倍數的樣品，測定咖啡因、兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素；按“1.3.1（1）”項制備4份樣品，定容體積分別為50 mL、100 mL、150 mL和200 mL，制成4份不同稀釋倍數的樣品，測定茶多酚總量。按“1.3.4”項方法確定相對校正因子，考察其不同稀釋倍數下校正因子的穩(wěn)定性。由表3可知，6種被測組分的RSD值分別為兒茶素6.35%、沒食子酸2.95%、表兒茶素8.44%、表沒食子兒茶素沒食子酸酯8.78%、表沒食子兒茶素5.91%、茶多酚總量4.33%；其中表沒食子兒茶素沒食子酸酯的RSD值最大，為8.78%，沒食子酸的RSD值最小，為2.95%，得到各組分的RSD均≤10.0%，說明在不同含量的樣品中，該校正因子具有穩(wěn)定性。

2.2.2 一測多評法（QAMS）和傳統(tǒng)方法的比較

如表4所示，15批綠茶飲料樣品（S1～S15）按照傳統(tǒng)方法“1.3.1”項進行分析測定，計算茶多酚含量，“1.3.2～1.3.3”項進行分析測定，分別計算咖啡因、兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素的含量。再對15批綠茶飲料樣品按照QAMS法進行分析測定，其中標準物咖啡因按“1.3.2～1.3.3”項進行分析測定，其他待測組分按照QAMS方法進行計算（計算公式為Ci=RCF×Cs）。兩種方法結果無明顯差異。一測多評法（QAMS）適用于綠茶飲料中咖啡因、兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素和茶多酚總量的測定。

3 結論與討論

3.1 傳統(tǒng)法和一測多評法（QAMS）的結果分析

通過比較兩種方法發(fā)現，傳統(tǒng)法存在以下缺點。①對于復雜基質樣品可能存在干擾物質，使部分組分不能完全分離，而影響測定結果。②吸收指數法對顯色時間要求嚴格，部分樣品本身存在顏色干擾，準確性不如液相色譜外標法定量。因此，選擇QAMS法更加準確、高效，適合大批量樣品的快速測定，為茶飲料的市場監(jiān)控帶來便利。

3.2 內標物、測定指標及檢測方法的選擇

茶多酚作為混合物，主要包括黃烷醇類、花色苷類、黃酮類、黃酮醇類和酚酸類等，其中主要的揮發(fā)性成分兒茶素類化合物占60%～80%，包括兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素、沒食子酸和咖啡因等一系列具有相似結構的成分。因表兒茶素沒食子酸酯含量較低，本次研究選擇兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素、沒食子酸和咖啡因作為茶多酚含量測定指標。根據被測物性質，咖啡因相對更穩(wěn)定，所以選擇咖啡因作為QAMS法的標準物。相對于紫外分光光度法，采用液相色譜對上述成分進行定量，可以更為準確、高效地判定綠茶飲料品質。

3.3 QAMS法用于茶飲料的質量評價

本研究以咖啡因為標準物，建立5種多酚類物質和茶多酚總量的一測多評方法，并通過評價校正因子的穩(wěn)定性和實際樣品的測定，驗證了該方法的可行性。研究結果顯示，各組分相對校正因子穩(wěn)定性良好，相對標準偏差均小于10%。可見各成分的相對校正因子的穩(wěn)定性均較好。

HPLC法與質譜法[15]相比，其優(yōu)勢在于使用了二極管陣列檢測器，經濟適用性強，穩(wěn)定性好，適合大范圍推廣，同時結合二極管陣列檢測器可以測量光譜的特性，在檢測中也可以起到輔助定性的作用。

本研究所建立的QAMS法相較于傳統(tǒng)方法[15-16]有以下優(yōu)勢。①用一種組分作為內標物去定量分析其他組分，節(jié)省了標準品，實驗成本降低。②省去了配制混合標準品過程，不再借助指數吸收法對茶多酚總量進行定量，實驗效率大幅提升。③由計算多種成分變?yōu)橛嬎阋环N成分，降低了計算錯誤率，提高了實驗的準確性。綜上所述，QAMS測定綠茶飲料生物活性成分穩(wěn)定性良好，為現制現售綠茶飲料的質量控制和質量評價提供了有益參考。

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基金項目：2021年度甘肅省市場監(jiān)督管理局重點科研項目（SSCJG-SP-202116）。

作者簡介：李玉紅（1990—），女，甘肅張掖人，本科，助理工程師。研究方向：食品藥品檢驗檢測及品質評價。

通信作者：陳佳（1990—），女，甘肅張掖人，本科，助理工程師。研究方向：食品藥品檢驗檢測及品質評價。E-mail：305117349@qq.com。