摘 要：以乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間及料液比為考察因素，以總黃酮提取率為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)紫斑牡丹籽粕總黃酮提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，紫斑牡丹籽粕總黃酮的最佳提取工藝為乙醇濃度67%、提取溫度74 ℃、提取時(shí)間133 min、料液比1∶36（g∶mL）。在該工藝條件下，紫斑牡丹籽粕中總黃酮提取率達(dá)到8.63%，工藝可行性較高，可為紫斑牡丹籽粕中總黃酮提取提供有效參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：紫斑牡丹籽粕；總黃酮；提取工藝；響應(yīng)面分析

Optimization of Extraction Process of Flavonoids from Paeonia rockii Seed Meal by Response Surface Methodology

TAO Bo， MA Yuqin

（Department of Biotechnology， Linxia Modern Vocational College， Linxia 731100， China）

Abstract： Ethanol concentration， extraction temperature， extraction time and solid-liquid ratio were selected as factors to be examined， and the total flavonoids extraction rate was used as an indicator to optimize the extraction process of total flavonoids from Paeonia rockii seed meal through single factor experiments and response surface methodology. The results showed that the optimal extraction process of total flavonoids from Paeonia rockii seed meal was ethanol concentration 67%， extraction temperature 74 ℃， extraction time 133 min， and solid-liquid ratio"1∶36 （g∶mL）. Under this condition， the extraction rate of total flavonoids from the seed meal of Paeonia rockii reached 8.63%， and the feasibility of the process was high， which can provide an effective reference basis for the extraction of total flavonoids from the seed meal of Paeonia rockii.

Keywords： Paeonia rockii seed meal; total flavonoids; extraction process; response surface methodology

紫斑牡丹除作為觀賞性花卉植物外，其花、皮具有一定的活血化瘀、抗病毒、抗菌等藥用價(jià)值，相關(guān)研究表明其中黃酮類化合物是重要的活性物質(zhì)[1]，紫斑牡丹籽油中含量較高的α-亞油酸具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、美容防輻射等功效[2]，目前也作為保健食品原料正在逐漸被開發(fā)利用[3]，但紫斑牡丹籽粕卻成為工業(yè)廢料而未能有效利用。本文旨在研究紫斑牡丹籽粕中總黃酮的提取工藝路線，為進(jìn)一步提高紫斑牡丹種子的利用率提供理論依據(jù)，使其經(jīng)濟(jì)價(jià)值得到更好的發(fā)揮。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫斑牡丹籽粕由臨夏河州牡丹農(nóng)業(yè)科技有限公司贈(zèng)送，烘干粉碎備用。

無水乙醇、石油醚（60～90 ℃）、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉和無水三氯化鋁均為分析純；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：153-18-4）。

1.2 儀器與設(shè)備

NBL-124e型電子天平，艾德姆衡有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SUS304中藥粉碎機(jī)，慈溪丁帥電器公司；SHZ-D2型循環(huán)水真空泵，上海力辰邦西儀器設(shè)備有限公司；V-5100B型可見分光光度計(jì)，元析儀器有限公司；SHA-CA型恒溫振蕩器，常州潤華電器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紫斑牡丹籽粕預(yù)處理

將干燥后的紫斑牡丹籽粕粉碎過篩后裝入燒杯，按1∶3（V/V）加入石油醚封口，脫脂1.5 h（3次），至石油醚無色后抽濾干燥待用[4]。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg置于棕色容量瓶（100 mL），以濃度70%乙醇溶解并定容至刻度，即得濃度為0.1 mg·mL-1對(duì)照品原液。將對(duì)照品原液稀釋為系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法[5]，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，在波長510 nm處測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 總黃酮提取工藝單因素試驗(yàn)

總黃酮提取工藝單因素試驗(yàn)設(shè)置4因素5水平，以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，分別考察乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%、80%）、提取時(shí)間（30 min、60 min、90 min、120 min和150 min）、提取溫度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g∶mL）對(duì)總黃酮提取率的影響[6]。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

選擇乙醇濃度（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）、料液比（D）4個(gè)因素作為自變量，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析軟件Design Expert-10.0對(duì)總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化[7]并測(cè)定總黃酮含量。響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

按1.3.2操作，在510 nm處測(cè)定蘆丁系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得回歸方程y=8.75x+0.000 7，R2=0.999 6。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1～圖4可知，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最高，為7.58%；當(dāng)提取溫度為70 ℃時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最高，為7.73%；當(dāng)料液比為1∶30（g∶mL）時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最高，為7.89%；當(dāng)提取時(shí)間為120 min時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最高，為8.36%。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面法回歸模型及方差分析

通過Box-Behnken進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用Design Expert-10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，建立數(shù)學(xué)模型，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸，得到乙醇濃度（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）、料液比（D）對(duì)紫斑牡丹籽粕總黃酮提取率（Y）的二次多項(xiàng)回歸模型為Y=8.61+0.26A+0.13B+0.27C+0.24D+0.12AB+0.14AC+0.44AD-0.11BC+0.13BD-0.01CD-0.43A2-0.30B2-0.38C2-0.51D2由表2可知，模型P＜0.000 1，表明該模型極顯著。模型R2=0.927 6，說明有92.76%的響應(yīng)值變化來源于所選自變量，因變量與自變量之間具有顯著線性關(guān)系。模型失擬項(xiàng)P=0.071 4＞0.05，不顯著；模型信噪比為10.29，表明模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合良好并可較好地反映試驗(yàn)結(jié)果。變異系數(shù)為2.4%，表明試驗(yàn)具有良好的穩(wěn)定性。此外，根據(jù)二次多項(xiàng)回歸模型方程方差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)紫斑牡丹籽粕總黃酮提取率主次影響的排序?yàn)镃＞A＞D＞B。

2.3.2 響應(yīng)面因素交互作用分析

通過Design Expert-10軟件繪制出乙醇濃度（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）、料液比（D）的交互作用響應(yīng)面曲線圖。等高線為響應(yīng)曲面圖的投影，等高線趨于圓形表明2個(gè)因素之間的交互作用相對(duì)較弱；等高線趨于橢圓且角度越大表明2個(gè)因素之間的交互作用相對(duì)較強(qiáng)。由圖5可知，乙醇濃度和料液比交互作用的等高線呈橢圓形，表明乙醇濃度和料液比的交互作用相對(duì)較強(qiáng)；乙醇濃度和提取時(shí)間、乙醇濃度和提取溫度、提取時(shí)間和料液比的等高線趨于圓形，表明其因素之間的交互作用相對(duì)較弱。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

利用Design- Expert-10.0軟件分析得到紫斑牡丹籽粕總黃酮最優(yōu)提取工藝為乙醇濃度66.87%、提取溫度73.59 ℃、提取時(shí)間133.42 min、料液比1∶35.86（g∶mL），總黃酮提取率理論值為8.86%?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)條件，將最優(yōu)提取工藝條件調(diào)整為乙醇濃度67%、提取溫度74 ℃、提取時(shí)間133 min、料液比1∶36（g∶mL），在此次條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到提取率為8.63%，與響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析模型預(yù)測(cè)理論值基本吻合；總黃酮含量達(dá)到8.54%。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，通過Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)紫斑牡丹籽粕總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳提取工藝為乙醇濃度67%、提取溫度74 ℃、提取時(shí)間133 min、料液比1∶36（g∶mL），紫斑牡丹籽粕總黃酮提取率達(dá)到8.63%，總黃酮含量達(dá)到8.54%。該提取工藝成本較低，可行性高，為進(jìn)一步研究紫斑牡丹籽粕總黃酮提供了可靠的理論依據(jù)。

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基金項(xiàng)目：2021年甘肅省高等學(xué)校創(chuàng)新基金（2021B-568）。

作者簡介：陶波（1989—），男，甘肅張掖人，碩士，講師。研究方向：動(dòng)物病理學(xué)及中獸藥研發(fā)。