都佳寅 王 寧 閆 卉

1 天津市南開醫(yī)院口腔科 300110; 2 天津中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔科

長期以來,微生物研究的主要手段依賴純培養(yǎng)技術(shù)。據(jù)文獻(xiàn)報道,環(huán)境中只有約5%的微生物能夠被分離和純化,而口腔中可培養(yǎng)的細(xì)菌也只占50%。因此,用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)和鑒定方法不足以反映生態(tài)環(huán)境中的真實(shí)情況,嚴(yán)重限制了認(rèn)識口腔微生物的視野。近年來,現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的成熟為微生物生態(tài)學(xué)研究提供了新的方法,促進(jìn)了口腔微生物學(xué)研究的進(jìn)一步發(fā)展[1]。常見的技術(shù)有限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記技術(shù)(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)、變性梯度凝膠電泳(Denatured gradient gelelectrophoresis,DGGE)及隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(Random amplified polymorphic DNA,RAPD)等。如何提取高質(zhì)量的DNA,同時最大限度地減少DNA的損失,是成功應(yīng)用這些技術(shù)的關(guān)鍵問題。由于不同細(xì)菌樣本所含細(xì)菌的種類及數(shù)量不同,同一樣本采用不同的DNA提取方法所得結(jié)果可能不同。因此,許多學(xué)者針對不同的樣本特性,制定了各種具有針對性的DNA提取方法,以滿足不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡男枰?并減少假陽性或假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。目前,對于口腔致病菌DNA的提取,不同的實(shí)驗(yàn)選擇不同的方法,因此所得結(jié)果的可比性較差。本文綜述目前常見的應(yīng)用于口腔的分子標(biāo)記技術(shù),為口腔微生物不同的研究目的和需求選擇合適的技術(shù)提供參考。

1 限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記技術(shù)

限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記技術(shù)(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)是指樣品DNA被限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生的DNA片段長度的變異性。傳統(tǒng)RFLP技術(shù)的基本原理是用限制性內(nèi)切酶消化樣品基因組DNA,產(chǎn)生大量限制性片段,不同樣品限制性片段的長度及數(shù)目不同,電泳后得到特異性圖譜,再結(jié)合Southern雜交,檢出RFLP。目前,該技術(shù)有兩種改進(jìn)方法,PCR-RFLP和末端限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(T-RFLP),以克服對基因組酶切后形成過于復(fù)雜的條帶難于分析的問題。PCR-RFLP酶切經(jīng)PCR擴(kuò)增的特異性DNA片段。T-RFLP是在PCR-RFLP基礎(chǔ)上對引物的5'端用熒光物質(zhì)標(biāo)記,得到帶有熒光標(biāo)記的末端限制性DNA片段(Terminal restriction DNA fragments,T-RFs),用DNA自動測序儀進(jìn)行檢測獲得峰值圖,了解群落的組成、某菌種的相對數(shù)量及樣品之間的相似性等[2]。

PCR-RFLP和T-RFLP技術(shù)的核心問題在于引物—酶組合的選擇,不同的組合影響圖譜的特異性,在近源菌種鑒別時更為重要[3]。T-RFLP技術(shù)所得圖譜無法進(jìn)行雜交或直接克隆分析。在分析近緣微生物時,當(dāng)擴(kuò)增片段靠近熒光標(biāo)記端的切點(diǎn)一樣時,無法鑒定至種甚至是屬的水平。可分別應(yīng)用幾種內(nèi)切酶對同一分析樣品分別進(jìn)行消化,綜合分析多個圖譜,提高檢出率。

2 單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)

單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)(Single-stranded Conformational Polymorphisms,SSCP)是基于DNA構(gòu)象差別來檢測多態(tài)性的方法?；驹硎遣煌膯捂淒NA具有序列特異性,形成的空間構(gòu)象不同,在非變性聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速率不同,得到不同的電泳圖譜。

SSCP的主要優(yōu)點(diǎn)是操作簡便、成本低、適合大樣本篩查;引物無須GC夾,也不需要灌制梯度凝膠;在100～300bp的單鏈DNA點(diǎn)突變檢出率可達(dá)97%,而300～450bp時的檢出率僅為67%[4];同時該技術(shù)不能預(yù)測單鏈DNA遷移速度,難以估計(jì)其凝膠中的條帶位置;不能識別突變位置,且當(dāng)堿基互換不影響單鏈DNA的空間構(gòu)象時,其檢出率只有57%[5]。有學(xué)者利用裂解酶片段長度多態(tài)性技術(shù)(Cleavase fragment length polymorphism,CFLP),RFLP-及SSCP-PCR三種方法檢測結(jié)核分枝桿菌的基因突變,SSCP和CFLP可檢測短目標(biāo)序列中的所有突變,CFLP在檢測長目標(biāo)序列中的突變時也非常具有優(yōu)勢[6]。

3 變性梯度凝膠電泳

基本原理為變性梯度凝膠電泳(Denatured gradient gelelectrophoresis,DGGE)時,不同序列的DNA片段在各自相應(yīng)的變性劑濃度下變性,使其在聚丙烯酰胺中的電泳速度急劇下降,停留在相應(yīng)的變性劑梯度位置,染色后在凝膠上獲得條帶圖譜。電泳條帶的數(shù)目、位置和強(qiáng)度即可反映樣品中微生物的種類及相對構(gòu)成比。

目前,該技術(shù)在口腔微生物研究中該技術(shù)被廣泛應(yīng)用,具有加樣量小、分辨率高、重復(fù)性好、成本低、操作簡便快速等優(yōu)點(diǎn)。DGGE通常根據(jù)細(xì)菌16SrDNA序列中保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物,對可變區(qū)做PCR擴(kuò)增。但16SrDNA更適對屬以上進(jìn)行分類,對于屬內(nèi)種間分類分辨率較低。T?pp等[7]利用鏈球菌屬的rnpB基因序列對鏈球菌49個菌屬的79個菌株進(jìn)行了分類鑒定,認(rèn)為其序列的差異可用于菌種區(qū)分。為提高DGGE對序列差異的分辨率,通常在引物的3’端加上30～50個堿基“G-C夾板”,從而顯著提高長度超過500bp的DNA序列差異的檢出率。此外,通過圖譜分析軟件對條帶位置和強(qiáng)度進(jìn)行分析,所得結(jié)果不能直接反映樣品的數(shù)量,只反映彼此的相對數(shù)量趨勢且往往存在誤差,需要結(jié)合雜交技術(shù)或測序分析等得到更詳盡的信息。Hakim等[8]研究發(fā)現(xiàn)DGGE只能對微生物群落中數(shù)量超過1%的優(yōu)勢種群進(jìn)行分析;PCR擴(kuò)增所需G-C堿基對含量至少達(dá)40%。

4 核糖體基因間隔序列分析

除16SrDNA,原核生物DNA中還有5SrDNA和23SrDNA。編碼這些rRNA的基因按順序排列在一條核DNA上,其編碼順序?yàn)?6S、23S和5SrRNA。核糖體基因間隔序列分析(Ribosomal intergenic spacer analysis,RISA)技術(shù)研究位于16SrRNA和23SrRNA基因間的間隔區(qū)序列(Intergenic Spacer Region,ISR),其中還含有編碼tRNA的tDNA序列,對其進(jìn)行擴(kuò)增稱為tDNA-PCR技術(shù)。不同種屬細(xì)菌間的基因間隔序列存在差異,同一菌種不同菌株的ISR不同,因此RISA技術(shù)被廣泛用于菌種的亞分類以及近源種研究中,表現(xiàn)出更顯著的序列尤其是長度多態(tài)性[9]。

該方法敏感性高,重復(fù)性好,與DGGE相比,RISA的引物無須GC夾。有時染色并不敏感,分辨率較低。有學(xué)者采用RISA結(jié)合異源雙鏈核酸分子分析技術(shù)研究牙齦卟啉單胞菌基因多態(tài)性,認(rèn)為基于rNDA操縱子的ISR可更好地鑒定不同菌株,并同時從混雜菌群中鑒定特定菌種內(nèi)的一系列菌株[10]。

5 RAPD-PCR、任意引物PCR標(biāo)記技術(shù)(Arbitrary primer PCR,AP-PCR)和基因組重復(fù)序列PCR(Repetitive-element PCR,rep-PCR)

許多文獻(xiàn)將AP與RAPD歸為同一種技術(shù)。基本原理源于基因組DNA分子內(nèi)部存在間隔的顛倒重復(fù)序列(Inverted repeat),因此在兩條模板單鏈上各有一個隨機(jī)引物的結(jié)合部位,經(jīng)PCR后產(chǎn)生若干單引物擴(kuò)增產(chǎn)物,由于不同DNA的顛倒重復(fù)序列數(shù)目及間隔長度的差異,經(jīng)凝膠電泳產(chǎn)生特異圖譜。兩者的主要區(qū)別在于:所需隨機(jī)引物長度不同,AP通常需要第三個引物,如M13通用引物,第一個PCR循環(huán)所需引物濃度較高;AP技術(shù)PCR過程分為兩個階段。首先在不嚴(yán)格的條件下使引物與模板錯配復(fù)性,形成可擴(kuò)增序列,然后在嚴(yán)格條件下擴(kuò)增,電泳后產(chǎn)生指紋圖譜;基于DNA重復(fù)序列的標(biāo)記技術(shù)包括腸桿菌基因間保守重復(fù)序列標(biāo)記(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR,ERIC-PCR)、基因外重復(fù)回文序列PCR標(biāo)記(Repetitive extragenic palindromic sequence PCR,REP-PCR),BOX-PCR標(biāo)記及腸炎沙門氏菌重復(fù)序列PCR標(biāo)記(Salmonella serotype Enteritidis repeat element,SERE-PCR)。ERIC序列,即腸桿菌基因間保守重復(fù)序列,長度為126bp,在不同細(xì)菌中的分布位置及拷貝數(shù)不同[11],經(jīng)凝膠電泳產(chǎn)生特異圖譜;很多微生物基因組DNA中包含貫穿整個基因組的高度重復(fù)短DNA序列,一般1～10bp,這些短串重復(fù)序列可區(qū)分到種或者菌株的水平?；谶@些序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法就叫REP-PCR[12]。BOX片段是另一個原核生物基因組重復(fù)序列,大小為154bp,由boxA(57bp)、boxB(43bp)和boxC(50bp)3種不同的亞單位組成,其中只有boxA存在菌屬、種、株水平的分布差異及表現(xiàn)出多拷貝和高保守性[13]。SERE與ERIC相似,為腸炎沙門氏菌重復(fù)序列,并廣泛存在于細(xì)菌及古菌基因組中[14]。

RAPD技術(shù)操作簡便,無須專門設(shè)計(jì)引物,沒有種屬限制,無須知道樣本序列信息。為確保退火時雙鏈的穩(wěn)定性,引物G+C含量應(yīng)>40%。雖然RAPD技術(shù)本身耗時短成本低,但在分析前,往往需要篩選大量的引物[15]。對實(shí)驗(yàn)條件敏感,重復(fù)性和穩(wěn)定性差?？赏ㄟ^優(yōu)化反應(yīng)條件或結(jié)合序列特征化擴(kuò)增區(qū)域標(biāo)記技術(shù)(Sequence Characterized Amplified Region,SCAR)來克服此缺點(diǎn)[16-17]。ERIC技術(shù)與普通RAPD技術(shù)相比,引物長度長,退火溫度高于52℃,因此圖譜穩(wěn)定,重復(fù)性高。有學(xué)者采用傳統(tǒng)RFLP、RAPD及核糖體分型(Ribotyping)技術(shù),比較腦膿腫患者及其牙周袋中星座鏈球菌的遺傳多態(tài)性,傳統(tǒng)RFLP分辨率最差且產(chǎn)生條帶多不便于后續(xù)分析,另外兩種技術(shù)結(jié)果相似[18-19]。采用RAPD及RiboPrinter核糖體分型系統(tǒng)對乳桿菌屬內(nèi)種間鑒定時,認(rèn)為RAPD的敏感性較高,但實(shí)驗(yàn)步驟較復(fù)雜耗時較長。有學(xué)者用BOX-、ERIC-和REP-PCR對同一樣本分別進(jìn)行指紋分析,三者結(jié)果相似度很高,但想得到更精細(xì)的系統(tǒng)進(jìn)化樹,可將三者聯(lián)合應(yīng)用[20]。還有學(xué)者首次采用ERIC技術(shù)對具核梭桿菌種內(nèi)株間鑒定,并與AP技術(shù)相對比,發(fā)現(xiàn)兩者的分辨率均較高[21]。除此以外,利用分子標(biāo)記技術(shù)對凝固酶陰性葡萄球菌菌種鑒定,并將tDNA-PCR及ERIC-PCR兩種分子生物學(xué)方法的鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)的Auto Scan-4微生物分析儀和API Staph鑒定系統(tǒng)進(jìn)行比較,一致率為95%[22]。用ERIC-、REP-、SERE-及BOX-PCR對草綠色鏈球菌進(jìn)行屬內(nèi)種間及種內(nèi)株間鑒別時發(fā)現(xiàn),前三者所得結(jié)果非常相似,而BOX-PCR不能檢測出口腔鏈球菌,因此沒有進(jìn)行進(jìn)一步的比較。同時認(rèn)為,BOX-PCR適合于革蘭氏陰性細(xì)菌的種水平鑒定,前三者適用于革蘭氏陽及陰性細(xì)菌的株水平鑒定, 但不適用于種水平鑒定[23]。

6 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性標(biāo)記技術(shù)

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性標(biāo)記技術(shù)(Amplified fragment length polymorphism,AFLP)為限制性酶切片段的選擇擴(kuò)增來顯示片段多態(tài)性的方法。具體步驟為基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切后,形成分子量大小不等的限制性片段,再將雙鏈人工接頭(Artificial adapter)連接在黏性末端,形成一個帶接頭的特異片段,并作為PCR的模板,擴(kuò)增片段電泳形成特異性圖譜[24]。

AFLP綜合了PCR及RFLP的優(yōu)點(diǎn),無須預(yù)知樣本基因組信息。DNA用量少,可靠性好,分辨率高,重復(fù)性高。但該技術(shù)費(fèi)用昂貴,過程復(fù)雜,對技術(shù)操作人員的技術(shù)水平要求較高,擴(kuò)增時可能產(chǎn)生假陰性及假陽性結(jié)果。AFLP的核心問題在于限制性內(nèi)切酶的選擇,研究發(fā)現(xiàn)EcoRI-MseI 和 ApaI-TaqI 非常適合于G+C含量較低和較高的菌種。對含量在40～50mol %的菌種,可用HindⅢ-TaqI組合。AFLP在區(qū)分緣菌株方面也非常具有潛力。有學(xué)者選用黃單胞菌屬180株菌株,對AFLP、rep-PCR(BOX、ERIC、REP)及DNA-DNA雜交三種細(xì)菌分類方法比較,結(jié)果表明三者有較好的一致性[20]。

7 定量逆轉(zhuǎn)錄PCR

定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse transcriptase PCR,RT-PCR)包括兩個基本過程:mRNA的反轉(zhuǎn)錄和定量PCR。定量PCR的基本原理是在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期,產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系。因此可根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的量確定目標(biāo)基因的表達(dá)水平。根據(jù)定量測定的時間,定量RT-PCR可分為實(shí)時定量RT-PCR(Real time quantitative,real-time RT-PCR)和終點(diǎn)定量RT-PCR(End point measure quantitative,RT-PCR)。real-time RT-PCR具有全封閉、自動化、不需凝膠電泳、重復(fù)性好及精確定量等優(yōu)勢,在口腔微生物領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。但PCR前核酸的提取效率,反應(yīng)過程中任一因素的細(xì)微變化均可導(dǎo)致最終結(jié)果的巨大差異[25]

8 熒光原位雜交技術(shù)

熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescence in situ hybridization,FISH)基本原理是用熒光材料將一種核酸單鏈標(biāo)記成探針,在微生物核酸的原有位置進(jìn)行雜交。采用激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)和落射熒光顯微鏡(EFM)獲得微生物在形態(tài)學(xué)、數(shù)量及空間分布等方面的信息,對樣品進(jìn)行定性定量分析[26]。

FISH技術(shù)操作簡便,實(shí)驗(yàn)成本相對較低。但探針接近靶區(qū)的能力,探針的敏感性、特異性和穩(wěn)定性等問題還需要進(jìn)一步改善。除此以外,有學(xué)者將掃描電鏡(SEM)、傳遞電子顯微鏡(TEM)與FISH-CLSM聯(lián)合應(yīng)用,更好地顯示出菌體—細(xì)胞外基質(zhì)—菌體所處環(huán)境三者本身的結(jié)構(gòu)及相互的空間結(jié)構(gòu)關(guān)系[27-28]。微觀放射自顯影集成技術(shù)(Microautoradiography fluorescence in situ hybridization,MAR-FISH)還能反映出不同微生物的生物代謝情況;酪胺信號放大熒光原位雜交技術(shù)(Tyramide signal amplification fluorescence in situ hybridization,TSA-FISH)可以顯著增強(qiáng)信號強(qiáng)度提高靈敏度,并縮短探針長度[29]。TSA還可與基因芯片技術(shù)合用,起到與TSA-FISH相似的信號增強(qiáng)作用。

9 抑制消減雜交技術(shù)

抑制消減雜交技術(shù)(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)是一種比較不同群體中差異表達(dá)基因的技術(shù)。首先將待測樣本cDNA(如高毒力菌株)和驅(qū)逐樣本cDNA(如低毒力菌株)分別用同一種限制性內(nèi)切酶消化,再將兩者變性后經(jīng)過兩次雜交復(fù)性,使差異表達(dá)的序列片段得到富集。通過第一輪具有抑制作用的PCR擴(kuò)增,使共同表達(dá)序列得到抑制,差異表達(dá)的序列片段得到顯著擴(kuò)增,再經(jīng)過第二輪巢式PCR,極大地提高了差異表達(dá)的目片段的特異性及豐度。

SSH技術(shù)可檢測低豐度表達(dá)基因,假陽性率低,高敏感性及一次反應(yīng)可檢出幾十或成百差異表達(dá)的基因。但需要幾微克mRNA,同時兩樣本之間要有相似的遺傳背景[30]。

10 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)(Gene chip)是將DNA探針列陣固定于固相基質(zhì)上,將待測樣品的DNA/RNA片段用熒光或其他方法標(biāo)記后作為靶分子,與基因芯片上的探針列陣雜交。由于列陣中特定位置上的核苷酸序列是已知的,所以對每一位點(diǎn)上的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測,即可對樣品的遺傳信息進(jìn)行定性定量分析。雜交信號常用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測,并用專用軟件記錄分析后輸出結(jié)果。

該技術(shù)直接以序列差異作為標(biāo)記,具有高通量、并行性及自動化等優(yōu)點(diǎn),特別在基因相互作用和調(diào)控關(guān)系的研究方面具有獨(dú)特優(yōu)勢,被認(rèn)為是應(yīng)用前景最好的遺傳標(biāo)記技術(shù)。但成本昂貴、影響雜交動力學(xué)的因素等還有待深入研究。目前有學(xué)者應(yīng)用肽核酸(Peptide nucleic acid,PNA)代替DNA制作探針以解決雜交時芯片上的探針自身形成二級甚至是三級結(jié)構(gòu)的問題。同時認(rèn)為,PNA-DNA的結(jié)合比DNA-DNA的結(jié)合更加牢固[31]。還有學(xué)者將SSH技術(shù)與基因芯片相結(jié)合,彌補(bǔ)互相缺陷。SSH能夠有效篩查低豐度差異表達(dá)的基因,還能分離和鑒定未知基因,而這些是基因芯片無法完成的。差異表達(dá)基因若通過Northern blot來驗(yàn)證,其工作繁重且效率低?；蛐酒夹g(shù)可以彌補(bǔ)這點(diǎn)不足。除此以外,口腔致病菌生物信息資源庫(The Bioinformatics Resource for Oral Pathogens,BROP),可向研究者提供芯片序列等相關(guān)信息。

綜上所述,口腔微生物在維持口腔健康方面發(fā)揮著重要作用。一系列新型分子生態(tài)學(xué)技術(shù)的引用,為基因?qū)用嫔仙钊敕治隹谇晃⑸锾峁┝藦恼麄€群落—屬—種—株—特定基因鑒定和表達(dá)及與宿主相互關(guān)系的研究方法,極大地促進(jìn)了口腔微生物學(xué)的發(fā)展。這些方法不僅可對微生物進(jìn)行定性定量分析,還可進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,甚至是微生物群落生態(tài)變化的功能性試驗(yàn),監(jiān)控菌落生態(tài)系統(tǒng)的動態(tài)變化,了解微生物與宿主之間的相互關(guān)系。其中的許多試驗(yàn)方法不僅特異性高,高通量,而且操作簡便,節(jié)省時間。但每種方法還存在各種問題,適用范圍也有所不同,需根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的實(shí)驗(yàn)方法。