楊鐮,鄧靜,朱建倉,王天楊,吳寶珠,易宇文,喬明鋒,鐘世榮*,吳華昌*

1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院,四川 宜賓,644000)2(四川旅游學(xué)院 烹飪科學(xué)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實驗室,四川 成都,610100)

耙豌豆是四川的特色醬料,是以豌豆為原料,經(jīng)高壓蒸制或煮制而成的一種調(diào)味品,因其軟爛綿密、豆香鮮美而深受四川地區(qū)人民的喜愛。耙豌豆廣泛應(yīng)用于豆湯飯、豌雜面、豆湯魚、蹄花湯等傳統(tǒng)家庭菜肴中。目前耙豌豆均為傳統(tǒng)家庭或小作坊式生產(chǎn),產(chǎn)品品質(zhì)良莠不齊,安全性有待提高,另外經(jīng)簡單蒸煮工藝制作的耙豌豆風(fēng)味不足,并伴有豆腥味[1-2]。安琪酵母(Saccharomycescerevisiae)發(fā)酵性能好,能快速啟動發(fā)酵反應(yīng),廣泛應(yīng)用于面包、酒類等發(fā)酵制品[3]。魯氏酵母(Zygosaccharomucesrouxii)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、假絲酵母(Candida)和畢赤酵母(Pichia)等酵母菌作為發(fā)酵過程中重要的功能菌群,在傳統(tǒng)發(fā)酵豆類食品的發(fā)酵過程中起主要增香作用[4]。發(fā)酵是食品增香的有效方法,酵母菌作為傳統(tǒng)發(fā)酵食品的常用微生物,能夠產(chǎn)生豐富的蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和糖分解酶[5]。這些酶通過代謝糖類、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì),形成氨基酸、酸類和醇類等小分子呈味物質(zhì),賦予產(chǎn)品特殊發(fā)酵香氣,豐富產(chǎn)品風(fēng)味[6]。李志江等[7]用Z.rouxii發(fā)酵大豆豆醬,豆醬的感官和理化品質(zhì)顯著提高,豆醬的揮發(fā)性香氣成分明顯增加。龐惟俏等[8]運(yùn)用Z.rouxii和耐鹽表皮葡萄球菌復(fù)合發(fā)酵的寶泉醬具有較好的發(fā)酵風(fēng)味。

風(fēng)味是發(fā)酵食品的重要品質(zhì)特征,揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是風(fēng)味的重要組成成分。電子鼻[9]是模擬人體的嗅覺,利用氣體傳感器陣列的響應(yīng)值來識別氣味的電子系統(tǒng),其具有響應(yīng)時間短、檢測快速、測定范圍較廣、重復(fù)性好,能挖掘人鼻不能嗅聞的氣體等優(yōu)點(diǎn),在食品行業(yè)發(fā)揮著越來越重要的作用,但電子鼻無法鑒定具體揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[10-11]。而GC-MS是分離、鑒定物質(zhì)的有效工具。電子鼻和GC-MS在豆醬整體氣味輪廓及物質(zhì)的定性定量領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。龐惟俏等[8]運(yùn)用電子鼻結(jié)合GC-MS區(qū)別了3種優(yōu)勢菌種對寶泉醬的香氣成分的影響。CHEN等[12]通過GC-MS標(biāo)記了瀏陽豆豉中的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。

本研究運(yùn)用5種常用產(chǎn)香酵母菌(S.cerevisiae、Pichia、Saccharomycescerevisiae、Zygosaccharomucesrouxii和Candida)對耙豌豆進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵5 d。通過電子鼻和GC-MS對不同酵母菌發(fā)酵的耙豌豆的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析,并結(jié)合主成分分析和偏最小二乘-判別分析(partial least square-discriminant analysis, PLS-DA)模型分析5種酵母菌發(fā)酵耙豌豆的香氣組成差異,采用變量重要性投影(variable importance in the projection, VIP)確定不同酵母菌發(fā)酵耙豌豆中的關(guān)鍵香氣物質(zhì),旨在為開發(fā)發(fā)酵型耙豌豆產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白豌豆,北京金禾綠源農(nóng)業(yè)科技有限公司;S.cerevisiae,安琪酵母股份有限公司;S.cerevisiae、Z.rouxii,實驗室保藏菌株;季也蒙畢赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)、近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis),唐紅梅等[13]由腌菜中篩選;麥芽汁培養(yǎng)基,廣東中山百微生物技術(shù)有限公司;馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar, PDA)培養(yǎng)基,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SQ680氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Elite-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),美國珀金埃爾默儀器有限公司;FOX4000電子鼻,法國Alpha MOS公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化

將凍藏于-60 ℃的5株酵母菌株分別接種于已滅菌處理的麥芽汁液體培養(yǎng)基中,搖床培養(yǎng)(30 ℃,170 r/min)24 h。將活化后的酵母菌接種于PDA培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)2 d。挑取單菌落于麥芽汁液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)(30 ℃,170 r/min)36 h,調(diào)整菌種懸液濃度為1.0×108CFU/mL。

1.3.2 樣品的制備

用蒸餾水泡發(fā)豌豆12 h,取300 g泡發(fā)后的豌豆加入1 000 mL錐形瓶中,按料液比為1∶0.9(g∶mL)加入蒸餾水270 mL。將豌豆進(jìn)行121 ℃,15 min蒸煮處理,冷卻后即為耙豌豆。將5種酵母菌菌懸液以2%接種量分別接種于耙豌豆中,移入培養(yǎng)箱中30 ℃固態(tài)發(fā)酵5 d。S.cerevisiae、Pichia、S.cerevisiae、Z.rouxii和Candida發(fā)酵耙豌豆樣品分別命名為A、B、C、D和E,未發(fā)酵耙豌豆樣品命名為F。發(fā)酵結(jié)束后,將樣品放入-60 ℃條件下儲藏備用。

1.3.3 電子鼻檢測

每份取1.0 g發(fā)酵耙豌豆樣品,置于10 mL頂空瓶中。70 ℃加熱5 min,進(jìn)樣針吸取1 mL頂空氣體進(jìn)樣分析。載氣(合成干燥空氣)流速150 mL/min,數(shù)據(jù)采集時間120 s,延滯時間300 s。檢測結(jié)束后,以18個傳感器的響應(yīng)值進(jìn)行統(tǒng)計分析。每個樣品設(shè)置10組平行,選取穩(wěn)定后的3組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

1.3.4 GC-MS檢測

樣品前處理:取發(fā)酵耙豌豆樣品4.0 g裝入20 mL頂空瓶,用GC-MS專用瓶蓋密封,裝入自動進(jìn)樣器,備用。

萃取及進(jìn)樣條件:萃取溫度70 ℃,進(jìn)樣針溫度75 ℃,傳輸線溫度75 ℃,萃取時間1 800 s,干吹120 s,解析10 s,頂空瓶加壓/釋壓120 s,捕集阱保持240 s,捕集阱循環(huán)4次。

氣相條件:載氣(99.999% He),流速1.0 mL/min。由室溫升至80 ℃保持2 min,然后以4 ℃/min升至180 ℃,保持3 min,再以5 ℃/min升至230 ℃,保持5 min。

質(zhì)譜條件:EI離子源,電子轟擊能量70 eV,離子源溫度230 ℃,電子倍增電壓1 650 V;質(zhì)量掃描范圍:45～450m/z;標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧文件。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用軟件SPSS 26.0進(jìn)行方差分析;用Origin 2021軟件對電子鼻數(shù)據(jù)進(jìn)行分析;采用SIMCA 14.0對GC-MS定量結(jié)果進(jìn)行PLS-DA、聚類分析及VIP值計算;利用R語言(R 4.2.3)繪制Upset圖和熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵耙豌豆電子鼻檢測分析

由圖1-a可知,6種耙豌豆樣品對18個傳感器的特征響應(yīng)值均在1.2以下,且對LY 2/LG、LY 2/G、LY 2/AA、LY 2/Gh、LY 2/gCTI、LY 2/gCT傳感器不敏感,在傳感器PA/2、P 30/1、P 40/2和P 30/2上的響應(yīng)值較高,結(jié)合表1可知,乙醛類、醇類、甲硫醇和α-松油醇類化合物是其主要揮發(fā)性物質(zhì)。發(fā)酵耙豌豆(A、B、C、D、E)與未發(fā)酵耙豌豆(F)的傳感器響應(yīng)值差異較大,表明酵母菌發(fā)酵對耙豌豆揮發(fā)性風(fēng)味有影響,發(fā)酵耙豌豆與未發(fā)酵耙豌豆整體風(fēng)味差異較大。A與B樣品在傳感器上的響應(yīng)值差異最小,初步判定S.cescerevisiae與M.guilliermondii發(fā)酵耙豌豆的整體風(fēng)味較相似。

表1 電子鼻傳感器性能描述Table 1 Performance description of electronic nose sensors

為了進(jìn)一步確定不同酵母菌發(fā)酵耙豌豆的香氣差異,通過主成分分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,由圖1-b可知,PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為84.8%和13.5%,累積貢獻(xiàn)率大于80%,表明兩個主成分可以呈現(xiàn)發(fā)酵耙豌豆的香氣特征信息。5種發(fā)酵耙豌豆(A、B、C、D和E)與未發(fā)酵耙豌豆(F)的距離較遠(yuǎn),表明發(fā)酵耙豌豆與未發(fā)酵耙豌豆整體香氣差異較大。A、B和D樣品在PC 1的距離較近,C與F的距離最遠(yuǎn),表明S.cerevisiae、Pichia和Z.rouxii發(fā)酵耙豌豆的整體風(fēng)味相似,S.cerevisiae發(fā)酵耙豌豆和未發(fā)酵耙豌豆的整體風(fēng)味差異最大。

2.2 發(fā)酵耙豌豆中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分分析

由電子增強(qiáng)出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036377)和圖2可知,6種發(fā)酵耙豌豆樣品中共檢測出69種揮發(fā)性物質(zhì),包括酯類、酸類、醇類、醛類、烴類、酮類及其他化合物。醇類和酸類是主要物質(zhì)。與未發(fā)酵耙豌豆對比,發(fā)酵耙豌豆(A、B、C、D和E)中醇類物質(zhì)的相對含量和種類數(shù)量均增加。醇類物質(zhì)是由乳酸菌及酵母菌在發(fā)酵過程中,通過氨基酸脫羧、脫氫或脂代謝產(chǎn)生[14]。醇類物質(zhì)共27種,相對含量最高,各樣品的醇類物質(zhì)相對含量為32.69%～64.77%;其次是酸類物質(zhì),共15種,各樣品的相對含量為15.14%～53.43%。醇類和酸類物質(zhì)的相對含量遠(yuǎn)高于其他類化合物。烴類、醛類、酯類、酮類和其他類化合物分別為4、6、7、2和8種,烴類、醛類和其他類化合物的相對含量較低,這也同ZHANG等[15]發(fā)酵大豆醬的研究結(jié)果一致。E樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類數(shù)量最多,多于未發(fā)酵耙豌豆14種,表明Candida發(fā)酵耙豌豆能提高耙豌豆風(fēng)味的豐富度。

a-物質(zhì)相對含量;b-物質(zhì)種類數(shù)量

醇類物質(zhì)賦予了耙豌豆醇香風(fēng)味,由電子增強(qiáng)出版附表1可知,同未發(fā)酵耙豌豆相比,發(fā)酵耙豌豆(A、B、C、D、E)中異戊醇、異丁醇和2-甲基丁醇的相對含量均上升。異戊醇主要由S.cerevisiae通過合成代謝途徑和Ehrlich途徑合成,使發(fā)酵耙豌豆口感醇厚,增強(qiáng)香氣復(fù)雜度[16],其對豆豉形成特有醬香風(fēng)味有顯著貢獻(xiàn)[17]。2-甲基丁醇的含量在A、C、D和E 4個樣品中相對含量上升較多,分別增加到2.86%、3.27%、2.60%和2.93%,賦予發(fā)酵耙豌豆甜香、麥芽香,其也是醬油、黃豆醬中的揮發(fā)性香氣物質(zhì)[18]。A、D樣品中乙醇的含量均較高,分別為24.14%和8.69%,因此S.cerevisiae和Z.rouxii發(fā)酵耙豌豆醇香、花香較濃郁,乙醇來源于酵母菌對氨基酸和糖類化合物的發(fā)酵代謝[19]。還原糖和氨基酸態(tài)氮水平的升高為酵母菌提供了物質(zhì)基礎(chǔ),使醇類富集[20]。A中異丙醇含量較高,而D中異戊醇含量較高,因此S.cerevisiae發(fā)酵耙豌豆呈現(xiàn)水果香氣,Z.rouxii發(fā)酵耙豌豆呈現(xiàn)果香、麥芽香氣。E中異丙醇的含量最高,為53.91%,賦予Candida發(fā)酵耙豌豆?jié)庥羲銡?這也是Candida發(fā)酵耙豌豆與其他耙豌豆樣品香氣差異顯著的原因,與電子鼻結(jié)果也相符合。

酸類物質(zhì)賦予耙豌豆溫和的酸味和香氣。酸性化合物的產(chǎn)生與微生物密切相關(guān),在發(fā)酵過程中,微生物降解蛋白質(zhì)和碳水化合物產(chǎn)生對風(fēng)味貢獻(xiàn)顯著的小肽、氨基酸和糖類,并進(jìn)一步代謝形成揮發(fā)性有機(jī)酸[21]。與未發(fā)酵耙豌豆相比,A、B和C的酸類物質(zhì)相對含量均上升。B、C中甲酸的相對含量顯著上升,分別高于未發(fā)酵耙豌豆19.86%和21.92%。D中迭氮酸含量最高且為36.31%,呈現(xiàn)刺激性氣味。

酯類化合物可通過有機(jī)酸和醇類酯化反應(yīng)得到。未發(fā)酵耙豌豆樣品中酯類物質(zhì)相對含量為1.63%,酵母發(fā)酵耙豌豆樣品中酯類物質(zhì)含量均增加。A、B、C、D和E樣品中酯類物質(zhì)相對含量分別為4.68%、2.21%、4.39%、10.85%和2.83%。D中的乳酸乙酯賦予發(fā)酵耙豌豆朗姆酒、奶油香氣。酯類物質(zhì)中乙酸乙酯和3-甲基苯酚甲酯的相對含量較高,其中A和C中的乙酸乙酯含量較高,賦予發(fā)酵耙豌豆水果香氣,可能是由于S.cerevisiae和S.cerevisiae所產(chǎn)的乙醇和乙酸較高,而乙酸乙酯含量與乙酸含量直接相關(guān)[22]。

醛類物質(zhì)賦予發(fā)酵豆類食品特殊風(fēng)味[23]。發(fā)酵耙豌豆中醛類物質(zhì)種類及相對含量都較少。發(fā)酵耙豌豆(A、B、C、D和E)中己醛的相對含量均下降,己醛是豆腥味的主要物質(zhì)[24-25]。表明酵母菌發(fā)酵能減弱耙豌豆的豆腥味。

為可視化6種發(fā)酵耙豌豆揮發(fā)性物質(zhì)的差異,對69種揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行熱圖分析。圖3-b是高階韋恩Upset圖,能夠更直觀的表現(xiàn)出多個樣品之間的交互情況。圖中左下角的柱狀圖表示不同發(fā)酵耙豌豆樣品的揮發(fā)性物質(zhì)的種類數(shù),上方柱狀圖和下方點(diǎn)線圖表示不同樣品之間交集數(shù)量和交集形式[26]。在下方點(diǎn)線圖中,集合參與一個交集,則黑色圓填充相應(yīng)的矩陣單元格,反之則顯示淺灰色圓。每一列中最上面和最下面的黑色圓之間用黑線連接,表示集合之間的相交關(guān)系[27-28]。由圖3-a和圖3-b可知,6種發(fā)酵耙豌豆中揮發(fā)性物質(zhì)的含量差異較大,共有揮發(fā)性物質(zhì)僅為5種,包括乙酸乙酯、甘油三亞油酸酯、1-甲氧基-丁烯、鈣磷酸和甲乙醚。丙二醇、2-羥乙基甲酸酯、5-乙炔酸、乙基烯丙基醚、牛磺酸和4-甲氧基-丁醇等物質(zhì)在A和B中的相對含量都較高,表明S.cerevisiae和Pichia發(fā)酵耙豌豆的整體風(fēng)味較相似,且與電子鼻分析結(jié)果相符合。E中相對含量較高的揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量最多,而A、B和C樣品中數(shù)量較少,表明Candida發(fā)酵能提高耙豌豆風(fēng)味的豐富度。3-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯在未發(fā)酵耙豌豆中的含量最低,在發(fā)酵耙豌豆(A、B、C、D和E)中含量均增加,這些酯類和醇類物質(zhì)分子量小且易揮發(fā),對耙豌豆的香氣貢獻(xiàn)為濃郁的果香和甜味。

a-聚類熱圖;b-物質(zhì)種類Upset圖

2.3 發(fā)酵耙豌豆中揮發(fā)性物質(zhì)PLS-DA

PLS-DA是一種有監(jiān)督的分析方法,能對數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理,實現(xiàn)復(fù)雜數(shù)據(jù)的可視化、判別和預(yù)測。模型中R2X=0.977,R2Y=0.984,Q2=0.948接近1.0表明模型穩(wěn)定可靠[29]。圖4-b是判別模型經(jīng)過200次置換檢驗的結(jié)果,Q2的回歸線與Y軸的交點(diǎn)在負(fù)半軸,說明模型有效,沒有過擬合,可用來反映發(fā)酵耙豌豆的風(fēng)味情況[30]。A樣品位于第1象限,B、C位于第2象限,E和F位于第3象限,D位于第4象限。發(fā)酵耙豌豆(A、B、C、D)和未發(fā)酵耙豌豆(F)之間分布較離散,各樣品之間有較為明顯的區(qū)分,說明S.cerevisiae、Pichia、S.cerevisiae和Z.rouxii發(fā)酵耙豌豆的整體風(fēng)味具有一定的差異。6種發(fā)酵耙豌豆在PLS-DA的分散點(diǎn)圖上聚類良好,組內(nèi)差異小。E與F樣品聚集度較高,D與F離散程度最大,表明Candida發(fā)酵和未發(fā)酵耙豌豆間的整體風(fēng)味相似度較高,而Z.rouxii發(fā)酵與未發(fā)酵耙豌豆的風(fēng)味差異最大。

2.4 發(fā)酵耙豌豆特征香氣物質(zhì)分析

為明確不同酵母菌發(fā)酵耙豌豆風(fēng)味差異的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì),通過計算VIP確定各物質(zhì)對發(fā)酵耙豌豆風(fēng)味的貢獻(xiàn)度。VIP>1的風(fēng)味物質(zhì)具有較大的貢獻(xiàn),定義其為差異標(biāo)志物[31]。由圖5可知,共篩選出12種VIP>1的香氣物質(zhì),分別為4種醇類(異丙醇、乙醇、2-甲基丁醇和異戊醇)、3種酸類(甲酸、L-乳酸、迭氮酸)、2種酯類(乙酸乙酯、3-甲基苯酚甲酯)、1種醛類(甲氧基乙醛)、1種酮類(1-甲氧基-2-丙酮)和1種其他類物質(zhì)(二甲醚)。其中甲酸的VIP值最高,表明甲酸對發(fā)酵耙豌豆的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大,LIN等[32]同樣發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)發(fā)酵豆類調(diào)味品在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量甲酸、丙酸等有機(jī)酸。結(jié)合電子增強(qiáng)出版附表1可知,C中甲酸的相對含量最高,主要呈辛辣氣味,給S.cerevisiae發(fā)酵耙豌豆帶來不舒適的風(fēng)味。乙酸乙酯在C中相對含量最高,賦予耙豌豆水果香氣和醇香,乙酸乙酯也被認(rèn)為是豆豉中水果香味的重要來源[12]。乙酸乙酯與合成前體物質(zhì)乙酸含量直接相關(guān),可能是S.cerevisiae發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸和乙醇酯化形成的。2-甲基丁醇主要是醬油、黃豆醬中的揮發(fā)性香氣物質(zhì),能夠賦予耙豌豆麥芽、酒香。

圖5 不同發(fā)酵耙豌豆揮發(fā)性成分VIP圖Fig.5 VIP chart of volatile components of different fermented pulpy peas

3 結(jié)論

本研究對產(chǎn)香酵母發(fā)酵耙豌豆的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行研究,電子鼻分析結(jié)果表明,5種酵母菌發(fā)酵耙豌豆的整體香氣與未發(fā)酵耙豌豆的差異較大,其中S.cescerevisiae與M.guilliermondii發(fā)酵耙豌豆的整體風(fēng)味較相似。GC-MS共檢測出69種物質(zhì),包括27種醇類、15種酸類、7種酯類、6種醛類、4種烷烴類、2種酮類和8種其他類化合物。其中醇類、酸類和酯類為主要揮發(fā)性物質(zhì),相對含量遠(yuǎn)高于其他類物質(zhì)。5種發(fā)酵耙豌豆的揮發(fā)性香氣成分差異顯著,與未發(fā)酵耙豌豆對比,發(fā)酵耙豌豆(A、B、C、D和E)中醇類和酯類物質(zhì)的相對含量顯著上升,且醇類物質(zhì)的種類數(shù)量均增多。Candida發(fā)酵耙豌豆(E)樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類最多,達(dá)到了38種,提高了耙豌豆風(fēng)味的豐富度。結(jié)合PLS-DA模型,篩選出12種VIP>1的揮發(fā)性標(biāo)志物,包括甲酸、異丙醇、乙醇、2-甲基丁醇、異戊醇、L-乳酸、迭氮酸、乙酸乙酯、3-甲基苯酚甲酯、甲氧基乙醛、1-甲氧基-2-丙酮和二甲醚,多為醇類物質(zhì)。醇類物質(zhì)中異丙醇的VIP值最高,對發(fā)酵耙豌豆的風(fēng)味貢獻(xiàn)最大,賦予耙豌豆水果香氣。本研究通過酵母菌發(fā)酵提高了耙豌豆風(fēng)味的豐富度,為開發(fā)耙豌豆產(chǎn)品和促進(jìn)發(fā)酵耙豌豆品質(zhì)形成奠定了良好的基礎(chǔ),為發(fā)酵耙豌豆產(chǎn)品優(yōu)化提供了理論依據(jù)。