厲佳怡，王紅磊，李婭婕，郭婷婷，倪乙丹，周泉城，盛桂華

（山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255200）

水凝膠是一種具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的親水性物質(zhì)，其在吸收大量的水后依然不溶，且能夠保持交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)、鏈的纏結(jié)或結(jié)晶區(qū)域的穩(wěn)定性[1]。由于具有較好的生物相容性、生物降解性和結(jié)構(gòu)可調(diào)性，水凝膠被廣泛應(yīng)用于輸送活性物質(zhì)、組織工程、生物醫(yī)學(xué)工程等領(lǐng)域[2-4]。根據(jù)交聯(lián)類型，水凝膠可以分為化學(xué)交聯(lián)和物理交聯(lián)。其中化學(xué)交聯(lián)水凝膠雖具有較好的質(zhì)構(gòu)特性和穩(wěn)定性，但是由于存在對生物活性有害的反應(yīng)，限制了其在生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展[5-6]。相較之下，物理交聯(lián)水凝膠通過離子相互作用、蛋白質(zhì)相互作用、氫鍵等形成，在制備過程中不需要交聯(lián)劑，安全性高[7]，且其交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)具有可逆性[8]。多糖是物理交聯(lián)水凝膠常見的基質(zhì)成分之一，其能提供物理屏障，保護(hù)攜帶的物質(zhì)免受胃酸和膽汁的影響[9]。目前，常見荷載益生菌的方法有微膠囊包埋法，但在實際應(yīng)用中，常常需要多層的包埋才能避免益生菌受損[10]。物理交聯(lián)水凝膠制備工藝簡單，其特有的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及溶脹特性有助于益生菌與外界營養(yǎng)物質(zhì)的交換，便于在加工貯藏過程中維持益生菌的存活及繁殖[11]。因此，采用物理交聯(lián)水凝膠特有的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)作為載體，有望成為荷載益生菌的新方法以及新的研究方向。

殼聚糖（chitosan，CS）是目前自然界中唯一的天然陽離子多糖，含有游離的氨基，來源廣泛，具有優(yōu)異的生物相容性、生物降解性、抗菌性、成膜性等特點[12]。透明質(zhì)酸鈉（sodium hyaluronate，SH）是一種天然的高分子聚合物，有較好的生物相容性，且具有抗衰老、抗炎癥、保濕潤滑等作用[13]。由于SH分子鏈的一側(cè)暴露著大量羥基，使SH具有很強(qiáng)的親水性[14]，可以與質(zhì)子化CS鏈上的氨基結(jié)合，通過靜電相互作用形成物理交聯(lián)水凝膠。Sheila等[15]以CS和SH為原料，制備了具有自愈性能和藥物緩釋特性、可3D打印的聚電解質(zhì)水凝膠，其具有優(yōu)異的生物相容性以及抗機(jī)械損傷的耐久性。益生菌是指能夠定植于人體腸道和生殖系統(tǒng)內(nèi)對宿主有正面效益的活性微生物，具有抑制腸道炎癥、促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收、維持腸道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)等作用[16]。然而，益生菌在食品加工、后期貯存以及食用的過程中易受到各種外界環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致其活性降低甚至喪失，從而無法發(fā)揮應(yīng)有的功能特性。因此，如何保證定植在人體腸道內(nèi)益生菌的活性及數(shù)量一直是研究的重點[17]，也是本研究的主要內(nèi)容。

基于上述情況，本實驗選擇鼠李糖乳桿菌（Lactobacillusrhamnosus）以及乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）為荷載對象，以CS、SH作為主要材料，通過SH羧酸基（—COO-）和CS質(zhì)子化氨基（—NH3+）之間的靜電相互作用形成物理交聯(lián)水凝膠，對水凝膠質(zhì)構(gòu)特性、微觀結(jié)構(gòu)、孔隙率及溶脹動力學(xué)曲線進(jìn)行分析，并研究其功能特性；同時以水凝膠為載體荷載益生菌，研究益生菌及培養(yǎng)基對水凝膠質(zhì)構(gòu)特性及微觀結(jié)構(gòu)的影響，分析水凝膠的載菌性能，探究其胃腸消化特性，研究其在模擬胃腸液中的釋放動力學(xué)，探尋益生菌水凝膠的釋放機(jī)制及作用機(jī)理，以期為CS-SH物理交聯(lián)水凝膠的制備及其載菌性能提供一定的材料依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SH（分子質(zhì)量97 kDa）華熙生物科技股份有限公司；CS（脫乙酰度85%，分子質(zhì)量100 kDa）上海愛純生物科技有限公司；L.rhamnosus、P.acidilactici菌粉西安榮甄生物科技有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；乙酸、氯化鈉等其他常用分析純試劑 國藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；全溫立式振蕩培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FD-1A-50型冷凍干燥機(jī) 博醫(yī)康（北京）儀器有限公司；物性測試儀 北京微訊超技儀器技術(shù)有限公司；D8-02型X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）儀 德國Bruker公司；Nicolet 5700型傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform-infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）美國Thermo Nicolet公司；Quanta 250型場發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡 美國FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 CS-SH水凝膠的制備

參考Sheila等[15]的方法。為使CS-SH水凝膠具有較好載菌性能，需要其在實現(xiàn)高溶脹度的同時具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度[18]，前期研究了多個因素對水凝膠硬度和溶脹度的影響，通過響應(yīng)面法確定最佳條件：采用體積分?jǐn)?shù)為0.75%的醋酸溶液溶解CS，配制成1.60 g/100 mL的CS溶液，SH質(zhì)量濃度為1.60 g/100 mL，將兩種溶液按體積比1∶1混合，反應(yīng)60 min，2 000 r/min離心15 min，棄上清液，即得CS-SH水凝膠。在此條件下制備的水凝膠具有優(yōu)良的性能和適合的溶脹度，適合作為載菌體系的基礎(chǔ)材料。將新鮮制備水凝膠冷凍干燥備用。

1.3.2 益生菌水凝膠的制備

稱取一定量的益生菌凍干粉，加入無菌的MRS肉湯培養(yǎng)基（簡稱MRS）中，配制成質(zhì)量濃度為1g/L的菌懸液，37 ℃培養(yǎng)14 h。稱取0.20 g干燥水凝膠于上述溶液中，在37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)10 h至其溶脹平衡，取出后用濾紙吸干表面菌液，即得荷載益生菌L.rhamnosus、P.acidilactici水凝膠（分別記為CS-SH-LR、CS-SH-PA）。

1.3.3 水凝膠的質(zhì)構(gòu)特性

參考馮傳興等[19]的方法，將制備好的濕凝膠表面處理平滑，用TPA模式測定凝膠的硬度、彈性、內(nèi)聚性、膠黏性以及回彈性5 個指標(biāo)。TPA測試條件：P/75探頭，測試速率及測后速率為1 mm/s，壓縮程度為5 mm，停留時間為5 s。

1.3.4 水凝膠微觀結(jié)構(gòu)表征

1.3.4.1 掃描電子顯微鏡（scanningelectron microscope，SEM）分析

用液氮脆斷凍干的樣品，利用SEM觀察復(fù)合材料縱截面的形貌，加速電壓5 kV。

1.3.4.2 FT-IR分析

將樣品與溴化鉀粉末以質(zhì)量比1∶100充分混合，用球形研磨機(jī)研磨均勻，抽空下壓成透明薄片，裝入壓片夾，以溴化鉀空白壓片作對照，在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描。

1.3.4.3 XRD測試

將樣品置于15 mm×20 mm×1.5 mm的鋁片孔中，隨后壓緊進(jìn)行測定。XRD的測試條件：掃描范圍20°～80°，掃描速率為5°/min，測角精度2θ≤±0.01°，角分辨率≤±0.1，角度重現(xiàn)性為±0.000 1°。

1.3.5 水凝膠的孔隙率

參考朱孟臻[20]的方法，采用溶劑置換法測定CS-SH凝膠的孔隙率，以無水乙醇為介質(zhì)，水凝膠經(jīng)冷凍干燥后，稱其干質(zhì)量m1（g）；測量干燥凝膠顆粒的高度和直徑，計算體積V（cm3）；樣品經(jīng)無水乙醇溶脹平衡后，用濾紙吸取水凝膠表面的液體，測質(zhì)量m2（g）；無水乙醇密度為ρ（g/cm3），按式（1）計算多孔水凝膠的孔隙率：

1.3.6 水凝膠的溶脹度

參考行云逸等[21]的方法并稍作修改。將新鮮制備的CS-SH水凝膠放入-20 ℃冷凍24 h后取出，凍干48 h。將凍干后的水凝膠置于37 ℃蒸餾水中12 h以上直至質(zhì)量恒定，用濾紙吸干水分后稱質(zhì)量，按式（2）計算水凝膠的溶脹度：

式中：m3為凍干后水凝膠質(zhì)量/g；m4為溶脹平衡時水凝膠的質(zhì)量/g。

1.3.7 益生菌的荷載量及荷載率

參考Cristina等[22]的方法并稍作修改。將凍干的水凝膠放入對數(shù)生長期的L.rhamnosus、P.acidilactici菌液中，并以同生長時期等體積的菌液作為空白對照，振蕩培養(yǎng)12 h后，用平板涂布法測定菌液中的菌落總數(shù)，荷載后的菌液菌落總數(shù)記為X1（CFU），空白單因素優(yōu)化組的菌液菌落總數(shù)記為X2（CFU），荷載量及荷載率分別按式（3）、（4）計算：

1.3.8 游離益生菌的模擬胃腸液耐受性分析

參考Xiao Yao等[14]的方法并稍作修改。人工模擬胃液（simulated gastric fluid，SGF）：取16.4 mL濃鹽酸與10 g胃蛋白酶混合均勻后定容至1 000 mL，pH 2；人工模擬腸液（simulated intestinal fluid，SIF）：稱取6.8 g KH2PO4、10 g胰蛋白酶，另加3號膽鹽10 g綜合模擬腸道的腐蝕性環(huán)境，加水稀釋至900 mL，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8后，定容至1 L。

收集對數(shù)期生長的游離L.rhamnosus、P.acidilactici（分別記為LR組、PA組）并在8 000 r/min條件下離心，用生理鹽水洗滌3 次，調(diào)節(jié)終濃度約為108CFU/mL。將9 mL預(yù)熱好的SGF和SIF分別加到1 mL菌懸液中，以生理鹽水組作為對照。由于成人的胃腸道消化時間一般不超過4 h，因此各組樣品在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)4 h。孵育結(jié)束后，用MTT法測試LR與PA組的細(xì)胞存活率，用酶標(biāo)儀在492 nm波長處測其吸光度。

1.3.9 體外胃腸消化模擬

在模擬消化環(huán)境條件下研究水凝膠中L.rhamnosus與P.acidilactici的存活和釋放特性。取新鮮制得的益生菌水凝膠置于10 mL SGF中37 ℃消化2 h，并在0、20、40、60、80、100、120 min時取樣，取樣后立即稀釋涂布。以菌懸液作為空白對照，操作步驟相同。SGF消化結(jié)束后將剩余水凝膠取出轉(zhuǎn)移至37 ℃的10 mL SIF中，充分混合，在37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中消化4 h，并在0、40、80、120、160、200、240 min時取樣，取樣后立即稀釋涂布?？瞻讓φ战M經(jīng)過SGF消化后，離心取沉淀物，將其投入10 mL SIF中，充分混合，進(jìn)行腸道消化模擬。測定各組的細(xì)胞活性和菌落數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 水凝膠的質(zhì)構(gòu)特性

荷載益生菌時，為了提高益生菌的存活率及活性，將凍干后的水凝膠放入含MRS肉湯培養(yǎng)基的菌液中浸泡（記為CS-SH-MRS組），所以額外探究MRS對水凝膠結(jié)構(gòu)及理化特性的影響。內(nèi)聚性是指介質(zhì)的內(nèi)部結(jié)合強(qiáng)度[23]，由表1可知，各組之間內(nèi)聚性沒有顯著差異，說明益生菌及MRS對凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)影響較小。各組水凝膠之間的硬度、彈性、膠黏性、回彈性均存在差異，其中CS-SH-MRS組的硬度、彈性、膠黏性與CS-SH組相比均顯著降低，這可能是由于MRS對水凝膠組分之間的鍵造成影響。與CS-SH組相比，CS-SH-LR組的硬度、彈性、膠黏性、回彈性均顯著降低，CS-SH-PA組的彈性、膠黏性、回彈性也均顯著降低。然而，CS-SH-LR組和CS-SHPA組的硬度、彈性、膠黏性均高于CS-SH-MRS組，這說明MRS對水凝膠質(zhì)構(gòu)特性有顯著降低的作用，而荷載益生菌能降低MRS對水凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響，這一結(jié)果與Beckwith等[24]的研究結(jié)果相似。

表1 水凝膠及益生菌水凝膠的質(zhì)構(gòu)特性Table 1 Texture properties of free and probiotic-loaded hydrogels

2.2 水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)分析

如圖1A、B所示，CS-SH水凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較均勻，孔洞較大，孔洞壁較薄，結(jié)構(gòu)較脆，這可能與其高溶脹度、低硬度的特性有關(guān)。圖1C、E為荷載L.rhamnosus的CS-SH水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)，由圖1E可以明顯看出水凝膠壁上附有很多桿狀益生菌，這與L.rhamnosus的形態(tài)相符合；圖1D、F為荷載P.acidilactici的CS-SH水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)，P.acidilactici呈球狀，附著在CS-SH壁表面，P.acidilactici的荷載密度較L.rhamnosus更高，緊密附著在水凝膠壁上。由圖1E、F可以看出，益生菌附著在水凝膠壁上，表明CS-SH水凝膠成功荷載益生菌，且該荷載方式并未明顯改變益生菌的表面形態(tài)，CS-SH水凝膠可以為L.rhamnosus及P.acidilactici提供一個生物相容性較好的環(huán)境。

圖1 CS-SH水凝膠及CS-SH載菌水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)Fig.1 Microstructure of free and bacteria-loaded CS-SH hydrogels

2.3 水凝膠的FT-IR分析

由圖2可知，各組在3 000～3 750 cm-1處存在強(qiáng)且寬的吸收峰，該區(qū)域一般對應(yīng)O—H、N—H的伸縮振動，與CS和SH組相比，CS-SH組吸收峰紅移，為靜電相互作用導(dǎo)致的伸縮振動，這表明CS聚陽離子和SH聚陰離子之間形成離子鍵；與CS-SH組相比，CS-SH-MRS組吸收峰藍(lán)移，透光率降低，說明MRS會影響水凝膠的交聯(lián)程度，這與質(zhì)構(gòu)特性分析結(jié)果一致；CS-SH-LR組、CS-SHPA組藍(lán)移距離較少，說明益生菌有助于緩解MRS對水凝膠結(jié)構(gòu)的影響。2 700～3 000 cm-1處的吸收峰為醛基C—H的伸縮振動，荷載益生菌的CS-SH水凝膠，吸收峰減弱消失，這說明益生菌的包埋會影響水凝膠的靜電相互作用。1 500～1 680 cm-1以及1 380～1 500 cm-1處為雙鍵C＝O（酰胺I帶）的對稱伸縮振動和羧基的特征峰，均是SH的特征峰[25]，交聯(lián)后所有組別透光率均升高，其中1 500～1 680 cm-1處，與CS組相比，其余組（除SH組外）的吸收峰均紅移，可能是由于交聯(lián)后兩種材料之間的靜電相互作用導(dǎo)致；1 000～1 200 cm-1是C—O—C伸縮振動峰，為CS的特征峰[26]，各組均有此峰，與CS組相比，其余組（除SH組外）吸收峰略紅移，這可能是由于分子內(nèi)電子的躍遷。綜上所述，CS和SH通過靜電相互作用形成水凝膠，這與Sheila等[15]的研究結(jié)果一致，而MRS會降低CS、SH之間的靜電相互作用，荷載益生菌可以有效緩解該影響。

圖2 CS-SH水凝膠及CS-SH載菌水凝膠的FT-IRFig.2 FT-IR spectra of free and bacteria-loaded CS-SH hydrogels

2.4 水凝膠的XRD分析

從圖3可以看出，CS和SH在10.71°和19.94°處有較強(qiáng)的特征衍射峰，其中CS在19.94°處的強(qiáng)度較高，這可能是CS的特征衍射峰，說明CS有明顯的晶體結(jié)構(gòu)。CS和SH交聯(lián)后，兩處特征峰強(qiáng)度均降低，特別是CS-SH-MRS組和CS-SH-PA組在10.71°處的衍射峰強(qiáng)度較低，峰寬減小，說明這兩組水凝膠的結(jié)構(gòu)更松散；其余各組在兩峰處的強(qiáng)度與SH相似，說明CS和SH之間具有較強(qiáng)的相互作用，從而使得各物質(zhì)的特征衍射峰降低或者消失，同時也說明水凝膠結(jié)晶度低，為非結(jié)晶態(tài)，證明CS-SH物理交聯(lián)水凝膠具有良好的相容性[27]。

2.5 水凝膠的溶脹性能

CS-SH水凝膠的溶脹度為（743.48±24.60）%，孔隙率為（59.01±3.84）%。圖4為37 ℃ CS-SH水凝膠在蒸餾水、SGF、SIF中的溶脹動力學(xué)曲線。在溶脹初期，水凝膠迅速吸水膨脹，溶脹度增長速度較快，大約在20 min左右，水凝膠在蒸餾水和SGF中的溶脹速率逐漸減緩，并趨于平衡，最終溶脹度分別穩(wěn)定在735.28%和744.55%，即吸水能力分別為7.353 g/g和7.446 g/g。30 min后，水凝膠在SGF中溶脹度降低，這可能是因為CS在酸性條件下容易形成帶正電的陽離子，破壞了CS與SH之間的靜電相互作用，導(dǎo)致外圍不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)被破壞。在30～150 min之間，CS-SH水凝膠在SIF中的溶脹度均高于在SGF中的溶脹度。在180 min后，水凝膠的溶脹度增長速率減緩，逐漸達(dá)到平衡，這可能是由于外界的H+與CS交互達(dá)到平衡。SIF中的水凝膠溶脹度在60 min左右最高，約1 202.27%，即吸水能力為12.02 g/g。隨后，溶脹度逐漸降低并達(dá)到平衡，約為552.27%，即吸水能力為5.52 g/g。這是因為SH成功接枝到水凝膠中，賦予了CS大量的—COOH官能團(tuán)，在中性或堿性條件下—COOH會電離成—COO-，可能會導(dǎo)致水凝膠的吸水性能短暫升高，這一特性有助于載菌CS-SH水凝膠在腸液中的釋放；但在酸性條件下，—COOH基團(tuán)不易解離，而是趨向與SH鏈上的羥基形成離子鍵，從而阻止水分子進(jìn)入凝膠網(wǎng)絡(luò)，使得水凝膠的平衡溶脹度大大下降，這一特性與行云逸等[21]的研究結(jié)果相似。

圖4 CS-SH水凝膠的溶脹動力學(xué)曲線Fig.4 Swelling porosity of CS-SH hydrogel

2.6 水凝膠的荷載量及荷載率

水凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有利于與外界進(jìn)行物質(zhì)交換，是一種較好的荷載益生菌的材料[28]。如圖5所示，0.2 g干燥水凝膠的L.rhamnosus、P.acidilactici荷載量分別為1.15×109CFU和1.25×109CFU，荷載率分別為93.36%和88.04%，兩組之間的荷載量無顯著差異，這說明CS-SH水凝膠具有較好的生物相容性；但CS-SH-LR組的荷載率顯著高于CS-SH-PA組（P＜0.05），這可能是由于L.rhamnosus菌粉的濃度較低，導(dǎo)致相同時間培養(yǎng)條件下原菌液濃度較低，從而使其荷載率較高。綜上，CS-SH水凝膠具有良好的載菌性能和高生物相容性。

圖5 CS-SH載菌水凝膠的荷載量及荷載率Fig.5 Loading amounts and loading rates of probiotics into CS-SH hydrogel

2.7 模擬胃腸液耐受性分析

一般認(rèn)為，益生菌必須以足量活性狀態(tài)轉(zhuǎn)移到腸道中才能發(fā)揮其理想的益生作用，而大多數(shù)乳酸菌對胃腸道強(qiáng)酸性和高濃度膽鹽環(huán)境的耐受力普遍較弱，很難在這種惡劣環(huán)境下生存。本實驗選用L.rhamnosus、P.acidilactici測定其經(jīng)模擬胃腸液孵育后的存活率。如圖6所示，在SGF中孵育4 h后，L.rhamnosus與P.acidilactici全部喪失活性。此外，這些乳酸菌對腸道消化液也很敏感，孵育后存活的細(xì)胞分別減少94.18%和87.58%。這與大量研究結(jié)果[14,29]一致，絕大多數(shù)益生菌在通過人體胃腸道時會顯著喪失生存能力。

圖6 游離L.rhamnosus（A）和P.acidilactici（B）在模擬胃腸道中的活性Fig.6 Survival rates of free L.rhamnosus (A) and P.acidilactici (B) in simulated gastrointestinal conditions

2.8 胃腸消化模擬動力學(xué)曲線

如圖7A所示，在經(jīng)歷模擬胃腸液孵育后，LR及PA組的活菌數(shù)量均急速降低，約40 min時細(xì)胞存活率分別為3.80%以及4.23%，說明這兩種益生菌對SGF的耐受力較弱。除此之外，包封在水凝膠中的L.rhamnosus、P.acidilactici的釋放量較少，約120 min時分別為18.72%和13.16%，這意味著水凝膠可以提高益生菌在SGF中的存活率。從圖7B可以看出，游離益生菌的活性整體呈降低趨勢，在消化4 h后，細(xì)胞活性約為0.59%，而L.rhamnosus在120 min時，活性消失，說明這兩種益生菌對SIF的耐受性較差，相比之下L.rhamnosus的耐受性更差。包封后的L.rhamnosus、P.acidilactici在SIF中的活性明顯增強(qiáng)，其中CS-SH-LR組在SIF中持續(xù)釋放，細(xì)胞活性維持在20%左右，在120 min后逐漸降低，在240 min時細(xì)胞活性約為3.96%；相比之下CS-SH-PA組的細(xì)胞活性更強(qiáng)，在40 min時細(xì)胞活性達(dá)到最大值，約為46.51%，隨后細(xì)胞活性逐漸降低。

圖7 游離益生菌及CS-SH載菌水凝膠在模擬胃腸液中的動力學(xué)曲線Fig.7 Kinetic curves of free probiotics and bacteria-loaded CS-SH hydrogel in simulated gastroenteric fluid

游離益生菌及益生菌水凝膠在模擬胃腸液中連續(xù)消化的涂布結(jié)果如圖7C、D所示。與細(xì)胞活性結(jié)果不同的是，游離益生菌在SGF中消化60 min后已全部失活，這可能是由于胃液消化導(dǎo)致細(xì)胞損傷，使其無法在平板上生長形成菌落；益生菌水凝膠在120 min內(nèi)均未在平板上形成菌落（圖7C），這可能是由于水凝膠外圍不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)在消化過程中逐漸掉落，但荷載的益生菌仍黏附在水凝膠壁上，這些益生菌仍具有一定的活性，從而導(dǎo)致MTT法測定結(jié)果具有一定的細(xì)胞活性。游離益生菌在模擬腸消化過程中全部失活，而益生菌水凝膠進(jìn)入SIF時立即溶脹，釋放益生菌，在模擬腸消化初期，益生菌數(shù)量逐漸減少，這可能是由于腸液中膽鹽的作用；CS-SH-LR組以及CS-SH-PA組益生菌數(shù)量分別在80 min及120 min時逐漸增加，分別在200 min及160 min時達(dá)到最大值，菌落數(shù)分別為6.30（lg（CFU/mL））和6.12（lg（CFU/mL））（圖7D），這是由于水凝膠中益生菌在SIF中釋放繁殖，隨后活菌數(shù)便逐漸下降。

與游離益生菌相比，益生菌水凝膠在經(jīng)過模擬胃腸液連續(xù)孵育后仍能保持腸道中的細(xì)胞活力在20%以上，SIF中的菌落數(shù)均能維持在5（lg（CFU/mL））左右，有利于益生菌在人體腸道中定植。相比之下，游離的益生菌對這種連續(xù)性損傷高度敏感，幾乎沒有活菌殘留。這些結(jié)果證實了水凝膠封裝技術(shù)在L.rhamnosus、P.acidilactici應(yīng)對胃腸道挑戰(zhàn)時所提供的巨大生存優(yōu)勢。

2.9 動力學(xué)模型

益生菌水凝膠的體外釋放機(jī)制可分為3 種，分別是擴(kuò)散控制、降解溶蝕控制以及溶脹控制[30]。利用Origin軟件對CS-SH-LR組及CS-SH-PA組的腸消化涂布結(jié)果進(jìn)行擬合，建立其在SIF中釋放動力學(xué)方程。如表2所示，益生菌水凝膠的體外釋放Weibull分布方程模型擬合效果最好，CS-SH-LR和CS-SH-PA的決定系數(shù)R2分別為0.868 1以及0.907 0，釋放機(jī)制主要為表面侵蝕釋放作用[30]。

表2 CS-SH載菌水凝膠在腸液中的釋放動力學(xué)模型擬合Table 2 Kinetic models for the release of bacteria-loaded CS-SH hydrogel in simulated intestinal fluid

3 結(jié)論

本研究采用物理交聯(lián)方法制備了CS-SH水凝膠。該水凝膠設(shè)計依據(jù)是在酸性環(huán)境下CS分子鏈上的氨基易電離，帶有大量正電荷，而SH的表面帶有羧基，可以與電離的CS通過靜電相互作用結(jié)合，形成物理交聯(lián)水凝膠。將水凝膠浸沒在對數(shù)生長期的L.rhamnosus、P.acidilactici菌液中，共同培養(yǎng)12 h，即得荷載益生菌的CS-SH水凝膠。在1 500～1 680 cm-1處，與CS組相比，CS-SH水凝膠吸收峰紅移，與SH組相比，其吸收峰藍(lán)移，說明CS、SH成功通過靜電相互作用交聯(lián)。載菌性能結(jié)果表明MRS對水凝膠質(zhì)構(gòu)特性影響最大，但不影響水凝膠的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，且荷載益生菌可以緩解該影響；水凝膠結(jié)晶度低、非結(jié)晶態(tài)，載菌后水凝膠結(jié)構(gòu)更松散，各物質(zhì)之間具有良好的相容性；CS-SH水凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較均勻，孔洞較大，孔洞壁較薄，結(jié)構(gòu)較脆，益生菌附著在水凝膠壁上，形態(tài)良好。在30～150 min之間，CS-SH水凝膠在SIF中的溶脹度均高于在SGF中的溶脹度，有助于益生菌的控釋。CS-SH水凝膠對L.rhamnosus和P.acidilactici的荷載量分別為1.15×109CFU和1.25×109CFU，荷載率分別為93.36%和88.04%，兩組之間的荷載量無顯著差異，這說明CS-SH水凝膠具有較好的生物相容性，是一種較好的荷載益生菌材料；模擬胃腸消化結(jié)果顯示，CS-SH水凝膠對益生菌具有保護(hù)作用，具有較好的腸道緩釋特性，其釋放機(jī)制為表面侵蝕釋放作用。物理交聯(lián)水凝膠荷載益生菌在實際應(yīng)用中有重要意義，天然生物成分通過物理交聯(lián)合成水凝膠，并對荷載益生菌進(jìn)行靶向運輸，這可能成為益生菌遞送體系研究的突破點。