高 就，吳俊杰，焦文雅，陳宇洋，祝文軒，桑亞新，王向紅

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

姜是多年生草本植物，作為香料和藥物被世界各地廣泛消費(fèi)。姜的藥用價值主要來源于其具有的生物活性物質(zhì)，特別是姜酚及其脫水產(chǎn)物姜烯酚。6-姜烯酚（6-shogaol，6S）是姜中的主要活性成分，具有抗炎[1]、抗癌[2]、抗氧化[3]、改善阿爾茨海默癥[4]、改善肥胖[5]等藥理作用。但是6S溶解性差、生物利用度低，在體內(nèi)會被快速吸收和消除，限制其在功能食品領(lǐng)域的應(yīng)用[6]。

目前已有納米乳液[7]、脂質(zhì)體[8]、納米顆粒[9]等多種輸送載體，用于提高難溶性多酚物質(zhì)的生物利用度。其中，利用食品級基材構(gòu)建的納米顆粒作為活性物質(zhì)的輸送載體具有諸多優(yōu)勢而被廣泛關(guān)注。蛋白質(zhì)因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能特性可以用作制備納米顆粒。多酚與蛋白基納米載體結(jié)合后形成納米復(fù)合物，可提高其溶解度和在胃腸液中的穩(wěn)定性，并促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞對多酚物質(zhì)的吸收[10]。

玉米醇溶蛋白是玉米中的主要儲存蛋白，具有獨(dú)特的溶解性，不溶于水但可溶于乙醇、丙酮和pH≥11.5的堿性水溶液，易于通過反溶劑法制備納米顆粒[11]。近年來，玉米醇溶蛋白成為一種流行的植物蛋白，常被用來開發(fā)封裝和控制疏水活性物質(zhì)釋放的遞送載體，如槲皮素[12]、白藜蘆醇[13]、姜黃素[14]等。由于玉米醇溶蛋白納米顆粒穩(wěn)定性、再分散性差，通常加入穩(wěn)定劑附著在顆粒表面以改善這些問題，常用的穩(wěn)定劑有酪蛋白酸鈉（sodium caseinate，SC）[15]、殼聚糖[16]、果膠[17]等。其中SC因具有諸多優(yōu)勢而吸引了研究者的注意。除了良好的再分散性，SC能夠提高玉米醇溶蛋白納米粒子在高離子強(qiáng)度下的穩(wěn)定性，改變玉米醇溶蛋白納米粒子的等電點(diǎn)，進(jìn)而通過增強(qiáng)靜電排斥阻止納米粒子在小腸中的聚集[18]。有研究表明，在Caco-2細(xì)胞單層模型中，SC能夠促進(jìn)細(xì)胞攝取玉米醇溶蛋白納米顆粒[19]。與殼聚糖相比，以SC為外殼的玉米醇溶蛋白納米顆粒具有更好的穩(wěn)定性、再分散性和口服生物利用度[20]。

生物利用度是設(shè)計(jì)酚類物質(zhì)遞送體系的重要參考因素。評價生物利用度最有效的方法是人體實(shí)驗(yàn)，但是存在操作難度大、對樣品要求較高、涉及倫理和可及性問題而難以實(shí)施。因此常選擇其他方法代替，主要有體外模擬胃腸道消化、Caco-2細(xì)胞單層模型轉(zhuǎn)運(yùn)和藥代動力學(xué)研究。營養(yǎng)物質(zhì)攝入后需經(jīng)過口腔、胃、腸消化后被機(jī)體吸收利用。建立模擬消化模型，研究營養(yǎng)物質(zhì)的消化和釋放特性，可初步探究其生物可及性。小腸是營養(yǎng)物質(zhì)的主要吸收場所，Caco-2細(xì)胞來源于人體結(jié)腸腺癌細(xì)胞，在半透濾膜上分化形成的單層膜與人類的小腸上皮細(xì)胞相似，可以作為體外模型模擬小腸上皮細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)[21]。藥代動力學(xué)是研究物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物濃度隨時間動態(tài)變化的方法，運(yùn)用數(shù)學(xué)方法計(jì)算藥代動力學(xué)參數(shù)，通過最大血藥濃度、藥時曲線下面積（area under curve，AUC）、半衰期等判斷物質(zhì)在體內(nèi)的生物利用度。在體外模擬胃腸消化模型和小腸吸收模型的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究營養(yǎng)物質(zhì)的藥代動力學(xué)，可以更加準(zhǔn)確全面地了解營養(yǎng)物質(zhì)的生物利用度。

目前，利用蛋白基納米顆粒作為遞送載體提高6S生物利用度的研究鮮見報道。因此，本研究用反溶劑法制備負(fù)載6S的玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸鈉納米顆粒（6-shogaol-loaded zein-sodium caseinate nanoparticles，ZCP-6S），對顆粒進(jìn)行表征，利用體外模擬消化、Caco-2細(xì)胞模型和大鼠藥代動力學(xué)研究顆粒的生物可及性、細(xì)胞吸收和口服生物利用度，以期為疏水活性物質(zhì)的輸送及拓寬納米顆粒的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

Caco-2細(xì)胞購于國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺；SD大鼠體質(zhì)量為（200±10）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0008。

玉米醇溶蛋白、6S、辣椒素 上海源葉生物科技有限公司；SC 上海麥克林生化科技有限公司；胃蛋白酶（250 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）、DMEM培養(yǎng)基、HBSS緩沖液、四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清 維森特生物技術(shù)（南京）有限公司；BCA蛋白試劑盒 賽文創(chuàng)新（北京）生物科技有限公司；6 孔Transwell板 廣州潔特生物過濾股份有限公司；甲醇（色譜級）賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力攪拌器 德國IKA公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；FD5-2.5型真空冷凍干燥機(jī) SIM儀器有限公司；1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Agilent公司；Zetasizer Nano ZS90納米粒度儀 英國Malvern公司；HT7800透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）日本日立公司；IRAffinity-1S型傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier transform-infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）日本島津公司；LYZ-200 B 恒溫?fù)u床上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；MX-F 渦旋混合器美國Scilogex公司；Millicell ERS-2跨膜電阻儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 納米顆粒的制備

采用反溶劑法制備ZCP-6S[22]。將100 mg的玉米醇溶蛋白分別與50、40、20、10 mg 6S共溶于10 mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液，磁力攪拌1 h，配制不同比例的玉米醇溶蛋白-6S混合溶液。在磁力攪拌下，將該混合溶液緩慢滴入30 mL含有200 mg SC的水溶液中。持續(xù)攪拌1 h，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除溶液中的乙醇，5 000 r/min離心10 min以去除雜質(zhì)和未封裝的6S，得到納米顆粒溶液，冷凍干燥后的ZCP-6S顆粒粉末于-20 ℃保存。

1.3.2 粒徑、多分散性指數(shù)（polydisperse index，PDI）和Zeta電位的測定

使用馬爾文納米粒度電位儀測量樣品的粒徑、Zeta電位和PDI。將樣品稀釋適當(dāng)倍數(shù)后在25 ℃條件下測定，每個樣品重復(fù)測定3 次取平均值。

1.3.3 包埋率和固載率的測定

參考Zheng Dan等[22]的方法，用色譜級甲醇將納米顆粒適當(dāng)稀釋后使用HPLC檢測納米顆粒中包埋的6S含量，計(jì)算。液相色譜條件：Diamonsil C18型色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水溶液（70∶30，V/V），等度洗脫；流速為1 mL/min，柱溫為37 ℃，檢測波長230 nm，進(jìn)樣量為20 μL。包埋率和固載率分別按式（1）、（2）計(jì)算：

1.3.4 TEM觀察

使用TEM對納米顆粒進(jìn)行微觀形貌的表征。將樣品稀釋后用水滴在銅網(wǎng)上，晾干后用TEM觀察形貌。

1.3.5 FT-IR分析

采用FT-IR對6S、ZCP-6S、玉米醇溶蛋白與SC質(zhì)量比為1∶2的混合物（記為Z-SC1∶2）進(jìn)行紅外光譜分析。將樣品和溴化鉀粉末按照質(zhì)量比1∶99研磨混合后壓片測定，掃描范圍為4 000～500 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.3.6 體外模擬胃腸消化

參考Li Duoduo等[23]的方法，模擬胃腸消化模型由模擬胃液（含2 mg/mL NaCl、1.6 mg/mL胃蛋白酶，pH 2.0）和模擬腸液（含10 mg/mL膽鹽、3.2 mg/mL胰酶、1.1 mg/mL氯化鈣，pH 7.5）組成。首先取一定量的ZCP-6S和含相同質(zhì)量的游離6S作為對照，加入10 mL模擬胃液，然后在37 ℃恒溫?fù)u床中以120 r/min的轉(zhuǎn)速消化2 h。調(diào)節(jié)pH值為7.5中止消化，將胃消化液與模擬腸液等體積混合后調(diào)節(jié)混合液的pH值為7.5，在搖床中繼續(xù)消化4 h。將經(jīng)過模擬胃腸消化后的消化液10 000 r/min離心，使用HPLC測量上清液（膠束相）中6S含量，按式（3）計(jì)算生物可及性[24]：

式中：ρ為膠束層6S的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為膠束層的體積/mL；m為樣品中6S的質(zhì)量/μg。

1.3.7 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

Caco-2細(xì)胞于添加體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)箱保持37 ℃和5%CO2（后同）。待細(xì)胞融合至80%～90%時，用胰酶消化細(xì)胞后，將細(xì)胞懸液以2×104個/孔的密度接種于96 孔板中過夜使細(xì)胞貼壁。棄去舊培養(yǎng)基，加入100 μL含相同6S質(zhì)量濃度的游離6S（用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）預(yù)溶，DMSO體積分?jǐn)?shù)＜0.1%）或ZCP-6S DMEM溶液，用不含6S的空白納米顆粒（ZCP）表征載體材料的毒性。培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，再培養(yǎng)4 h，加入150 μL DMSO振搖1 min，用酶標(biāo)儀測定490 nm波長處的吸光度，按式（4）計(jì)算細(xì)胞存活率：

式中：A1為加入樣品細(xì)胞孔的吸光度；A2為未加樣品細(xì)胞孔的吸光度。

1.3.8 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞以每孔1.0×105個接種于6 孔板，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)1 周后利用顯微鏡觀察到Caco-2細(xì)胞融合至80%～90%時，可用于細(xì)胞吸收實(shí)驗(yàn)。利用HBSS緩沖液清洗細(xì)胞表面3 次，然后加入用HBSS緩沖液稀釋的ZCP-6S及游離6S溶液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1、2、4 h，然后加入預(yù)冷的HBSS緩沖液終止細(xì)胞吸收，用磷酸鹽緩沖液清洗3 遍，利用細(xì)胞裂解液在冰上將細(xì)胞裂解30 min，然后利用超聲處理，將細(xì)胞裂解液10 000 r/min離心2 min取上清液，利用液相色譜測定其中的6S含量。

1.3.9 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)

將Caco-2細(xì)胞以每孔1.0×105個接種于6 孔Transwell板中，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用電阻儀監(jiān)測細(xì)胞的跨膜電阻值，同時通過顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。第1周隔天更換培養(yǎng)液，1 周后每天更換培養(yǎng)液。培養(yǎng)至21 d后，將Caco-2細(xì)胞單層用HBSS液于37 ℃孵育30 min，再用HBSS液輕輕潤洗3 次。上室加入1.5 mL HBSS稀釋的ZCP-6S溶液和游離6S溶液作為供給液，下室加入2.5 mL空白HBSS作為接收液，在1、2、4 h 3 個時間點(diǎn)收集接收液，并補(bǔ)充等體積的HBSS，將收集液離心取上清液，利用液相色譜檢測，計(jì)算下室接受液中6S的濃度為轉(zhuǎn)運(yùn)量。

1.3.10 大鼠口服生物利用度

本研究的動物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)（審批號：2022010）。SD大鼠購買后在動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，可自由獲得食物和水。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，不禁水。將12 只大鼠隨機(jī)分為兩組，灌胃6S混懸液或ZCP-6S溶液，6S劑量為100 mg/kgmb。分別在灌胃后0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12 h從大鼠眼眶靜脈采集血液約600 μL于抗凝離心管中，4 ℃、3 500 r/min離心10 min獲得上層血漿，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用辣椒素作為?nèi)標(biāo)物，使用液-液萃取法對血漿進(jìn)行前處理[25]。取大鼠血漿200 μL與內(nèi)標(biāo)辣椒素20 μL混合后加入800 μL乙酸乙酯，渦旋振蕩2 min后10 000 r/min離心10 min獲取上清液，將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，氮?dú)獯蹈珊笥?00 μL甲醇復(fù)溶，將10 000 r/min離心10 min的上清液置于液相瓶的內(nèi)襯管中進(jìn)行檢測。使用DAS軟件對各個時間點(diǎn)的6S血藥質(zhì)量濃度進(jìn)行計(jì)算，擬合出6S原料藥組與納米顆粒組的各項(xiàng)藥代動力學(xué)參數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 粒徑、電位和PDI

有研究表明，SC與玉米醇溶蛋白質(zhì)量比為2∶1時納米顆粒具有較小的粒徑及較高的細(xì)胞攝取率[18]，因此本實(shí)驗(yàn)選擇二者的比例為2∶1。顆粒大小是生物聚合物輸送載體的一個關(guān)鍵特性，粒徑越小其穩(wěn)定性越強(qiáng)。由表1 可知，所有配方的顆粒粒徑范圍為（147.23±3.09）～（167.67±1.72）nm，與玉米醇溶蛋白納米顆粒的典型粒徑（100～400 nm）一致。所有配方納米顆粒的PDI均小于0.15，表明粒徑分布均勻。Zeta電位代表納米顆粒的表面電荷，可以間接衡量顆粒溶液的穩(wěn)定性，電位的絕對值越大顆粒溶液則越穩(wěn)定。所有配方的納米顆粒電位均為負(fù)值，表明玉米醇溶蛋白和SC之間存在靜電吸引，帶負(fù)電荷的SC包裹在帶正電荷的玉米醇溶蛋白納米顆粒表面使ZCP-6S帶負(fù)電荷，Li Duoduo等[23]報道了類似的結(jié)果。本研究所有配方納米顆粒的Zeta電位均在（-42.13±0.21）～（-23.80±0.31）mV之間，表明其穩(wěn)定性較好。

表1 玉米醇溶蛋白與6S質(zhì)量比對納米顆粒的粒徑、PDI和Zeta電位的影響Table 1 Effects of zein-to-6S ratio on particle size,PDI and zeta potential of nanoparticles

2.2 包埋率和固載率

包埋率和固載率是納米顆粒作為藥物或者營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸載體的重要指標(biāo)。如圖1所示，納米顆粒包埋率隨6S比例增加呈先增后減的趨勢，在玉米醇溶蛋白和6S質(zhì)量比為2.5∶1時包埋率最高，為（83.08±5.81）%，當(dāng)6S含量繼續(xù)增大時包埋率有所降低，說明6S的添加量超出了納米顆粒的包埋能力。而玉米醇溶蛋白比例越小，固載率就會越大，當(dāng)玉米醇溶蛋白和6S質(zhì)量比為2.5∶1時的固載率為（28.90±2.02）%。在其他封裝不同活性物質(zhì)的遞送體系中也觀察到類似結(jié)果[26]。根據(jù)以上結(jié)果，選擇玉米醇溶蛋白和6S質(zhì)量比2.5∶1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，在該比例條件下，納米顆粒的粒徑較小、固載率較高、包埋率最高。

圖1 玉米醇溶蛋白與6S的質(zhì)量比對納米顆粒包埋率和固載率的影響Fig.1 Effects of zein-to-6S ratio on encapsulation efficiency and loading efficiency of nanoparticles

2.3 TEM觀察結(jié)果

如圖2所示，納米顆粒呈球形，大部分粒子直徑在100～150 nm之間，也存在一些較小的顆粒。TEM觀察到的粒徑略小于納米粒度儀測得的粒徑（表1）。在一項(xiàng)關(guān)于果膠穩(wěn)定玉米醇溶蛋白納米顆粒的研究中也出現(xiàn)了類似的結(jié)果，這可能是由測試條件和原理差異引起，納米粒度儀測量的是水合粒徑，電鏡觀察的是干燥且去除水分后的顆粒粒徑[17]。

圖2 ZCP-6S的TEM圖像Fig.2 TEM images of ZCP-6S

2.4 FT-IR分析結(jié)果

如圖3所示，Z-SC1∶2的紅外光譜在3 309、1 667 cm-1和1 535 cm-1處顯示出典型的吸收峰，分別與O—H伸縮振動、酰胺I帶和酰胺II帶有關(guān)。酰胺I帶由肽鍵中羰基伸縮振動造成，因?yàn)橛衩状既艿鞍拙哂笑?螺旋結(jié)構(gòu)。在形成納米顆粒后，這些特征峰移動到了3 302、1 658 cm-1和1 532 cm-1處，說明玉米醇溶蛋白、SC、6S之間存在氫鍵和靜電相互作用。在6S圖譜中1 674 cm-1處產(chǎn)生的峰也是由羰基的伸縮振動產(chǎn)生。此外，6S、Z-SC1∶2、ZCP-6S分別在2 927、2 961 cm-1和2 958 cm-1處均存在C—H鍵的拉伸傾斜吸收峰。在800～1 600 cm-1之間有許多6S的連續(xù)特征吸收峰，對應(yīng)6S結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)和—OH。然而，許多特征峰在形成納米顆粒后都消失，如1 516、1 455 cm-1和1 274 cm-1處的特征峰，表明6S與蛋白質(zhì)之間形成氫鍵或發(fā)生疏水相互作用，限制了其化學(xué)鍵的伸縮振動。綜上可知，6S不是吸附在顆粒表面，而是通過非共價鍵相互作用力包封在納米顆粒中。

圖3 6S、Z-SC1∶2、ZCP-6S的紅外光譜Fig.3 Infrared spectra of 6S,Z-SC1:2 and ZCP-6S

2.5 生物可及性

生物可及性是物質(zhì)在消化過程中從食物基質(zhì)中釋放出來可以被小腸吸收的部分占攝入總量的比值[27]。如圖4所示，6S封裝在納米顆粒中后，其生物可及性從（36.31±5.82）%提高至（75.34±9.82）%。6S在水中溶解性較差，在消化液中聚集沉淀，限制了膠束化的形成，導(dǎo)致生物可及性較低，而納米顆粒能很好地溶解在消化液中。并且玉米醇溶蛋白在消化后被分解為兩親性多肽，與6S自組裝形成膠束，有利于6S的溶解，進(jìn)而提高了6S的生物可及性，此結(jié)果與Li Duoduo等[23]的研究結(jié)果一致。而利用pH值驅(qū)動法制備的玉米醇溶蛋白納米顆粒中姜黃素的釋放率在90%以上[28]。造成這些結(jié)果不同的原因，除了涂層材料的特性不同外，還與體外消化模型和納米顆粒制備方法的差異有關(guān)。

圖4 6S和ZCP-6S的生物可及性Fig.4 Bioaccessibilities of 6S and ZCP-6S

2.6 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖5所示，ZCP在6S不同質(zhì)量濃度下均沒有表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，細(xì)胞存活率均大于80%，表明載體材料本身生物相容性良好。在2.5～10 μg/mL范圍內(nèi)，游離6S和ZCP-6S的細(xì)胞存活率均高于80%，表明在這些濃度下兩者都表現(xiàn)出無細(xì)胞毒性。但是當(dāng)6S的質(zhì)量濃度增加到20 μg/mL時，ZCP-6S的細(xì)胞存活率降為（66.49±2.33）%。因此選擇6S質(zhì)量濃度為10 μg/mL進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。研究表明6S能夠顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2和HCT116的遷移和增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[29]。ZCP-6S的細(xì)胞毒性作用增加，可能是由于納米顆粒使6S能更好地被Caco-2細(xì)胞攝取。Xue Jinli等[30]的研究中也出現(xiàn)了類似現(xiàn)象，與游離姜黃素相比，姜黃素納米顆粒對Caco-2細(xì)胞具有更強(qiáng)的抑制增殖作用，被包埋的姜黃素通過內(nèi)吞作用的細(xì)胞內(nèi)化可能是納米顆粒細(xì)胞毒性增加的原因。

圖5 用6S、ZCP和ZCP-6S處理后的Caco-2細(xì)胞存活率Fig.5 Cell viability of Caco-2 cell safter treatment with 6S,ZCP or ZCP-6S

2.7 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖6所示，6S的攝取量隨時間的延長而增加，并且ZCP-6S的攝取量在每一個時間點(diǎn)都顯著高于游離的6S。處理4 h后，ZCP-6S的攝取量為（0.89±0.09）μg/mg，6S的攝取量為（0.53±0.04）μg/mg，細(xì)胞攝取量增加了（0.36±0.06）μg/mg，這表明包封在納米顆粒中的6S能更有效地被Caco-2細(xì)胞吸收。納米顆粒的攝取量取決于顆粒的粒徑、電荷和界面特性等性質(zhì)，粒徑在100～200 nm之間的納米顆粒具有最佳的Caco-2細(xì)胞攝取特性[31]。有研究表明，玉米醇溶蛋白中的某些肽可以通過激活腸上皮細(xì)胞的攝取機(jī)制提高Caco-2細(xì)胞對血紅素鐵的攝取[32]。而SC吸附在玉米醇溶蛋白納米顆粒的表面可以降低界面張力，從而改善玉米醇溶蛋白納米顆粒與細(xì)胞膜之間的相互作用。

圖6 Caco-2細(xì)胞在1、2、4 h分別對ZCP-6S和6S的攝取情況Fig.6 Uptake of ZCP-6S and 6S by Caco-2 cells at 1,2 and 4 h

2.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用Caco-2細(xì)胞單層模型模擬人小腸上皮細(xì)胞的吸收情況。電阻是評價細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型是否構(gòu)建成功的重要指標(biāo)。如圖7所示，本實(shí)驗(yàn)建立的Caco-2細(xì)胞單層模型在培養(yǎng)21 d后電阻達(dá)到475 Ω·cm2，說明模型完整性較好，可以進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。從圖8可以看出，ZCP-6S在4 h內(nèi)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力顯著優(yōu)于6S，二者的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)量均表現(xiàn)出時間依賴性。在4 h時，6S的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)量為（1.20±0.09）μg/mL，ZCP-6S的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)量達(dá)到（2.26±0.04）μg/mL，增加了（1.06±0.06）μg/mL。這一結(jié)果表明，使用納米顆粒作為載體可以提高6S在腸道的吸收。這是由于6S溶解度較低，限制了6S在Caco-2細(xì)胞中的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，而包封于納米顆粒中6S的溶解度有所提升。此外，納米顆粒較小的粒徑也有利于促進(jìn)細(xì)胞的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)[33]。ZCP-6S的細(xì)胞攝取量和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力均高于6S，這也解釋了其對Caco-2細(xì)胞具有更強(qiáng)的抑制作用。

圖7 Caco-2細(xì)胞生長不同時間的跨膜電阻Fig.7 Transmembrane resistance of Caco-2 cells at different growth times

圖8 不同時間游離6S和ZCP-6S通過Caco-2細(xì)胞單層模型的6S質(zhì)量濃度Fig.8 6S Concentrations of free 6S and ZCP-6S through Caco-2 cell monolayers at different times

2.9 藥代動力學(xué)分析

血藥質(zhì)量濃度-時間曲線如圖9所示，主要的藥代動力學(xué)參數(shù)見表2。二者的血藥質(zhì)量濃度均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，最終趨近于0 μg/mL。與6S相比，ZCP-6S的主要藥代動力學(xué)參數(shù)得到顯著改善。ZCP-6S的藥峰質(zhì)量濃度（ρmax）為（4.94±0.49）μg/mL，是6Sρmax的2 倍。與6S相比，ZCP-6S的AUC提高了2.28 倍，說明ZCP-6S的口服生物利用度顯著提高。ZCP-6S的半衰期（T1/2）和平均駐留時間（mean retention time，MRT）分別是6S的1.71 倍和1.55 倍，表明納米顆?？梢云鸬骄忈屪饔茫档土?S在體內(nèi)的消除速度。研究表明，玉米醇溶蛋白納米顆?？梢愿纳贫錀蠲匪卦谖改c道中的黏附性，并使其在大鼠體內(nèi)的口服生物利用度提高了1.95 倍[15]。玉米醇溶蛋白納米顆粒本身具有黏附性，其外層穩(wěn)定劑如SC、殼聚糖可進(jìn)一步增強(qiáng)其黏附性，使其能夠更好地吸附在腸上皮細(xì)胞上[34]。這種吸附作用可以延長6S在體內(nèi)的停留時間，從而增加其在體內(nèi)的積累量。綜上，納米顆粒可以有效地提高6S的口服生物利用度。

圖9 口服6S和ZCP-6S后血藥質(zhì)量濃度-時間曲線Fig.9 Plasma concentration-time curves after oral administration of 6S and ZCP-6S

表2 口服6S和ZCP-6S后的主要藥代動力學(xué)參數(shù)Table 2 Major pharmacokinetic parameters after oral administration of 6S and ZCP-6S

3 結(jié)論

通過反溶劑法成功制備了ZCP-6S，顆粒為球形，分布均勻，在6S、玉米醇溶蛋白、SC質(zhì)量比為1∶2.5∶5條件下其包埋率和固載率最高，為（83.08±5.81）%和（28.90±2.02）%。氫鍵、靜電和疏水相互作用是形成納米顆粒的主要驅(qū)動力。體外模擬消化結(jié)果表明，納米顆粒提高了6S在模擬胃腸液中的溶解度，使其生物可及性從（36.31±5.82）%提高至（75.34±9.82）%。納米顆粒包埋的6S與游離的6S相比，更容易被Caco-2細(xì)胞吸收，4 h內(nèi)通過Caco-2細(xì)胞單層模型的質(zhì)量濃度也由（1.20±0.09）μg/mL增加至（2.26±0.04）μg/mL?？诜o藥后，6S的AUC提高了2.28 倍，T1/2為原來的1.71 倍。綜上，玉米醇溶蛋白基納米顆粒可以作為6S有效的輸送載體，提高其生物利用度，本實(shí)驗(yàn)可為更好地發(fā)揮6S功能活性提供新思路。