張子杰，田益玲，夏君霞，馬愛進,*

（1.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001；3.河北養(yǎng)元智匯飲品股份有限公司，河北 衡水 053000）

核桃是一種廣泛分布在世界各地的堅果，在全球范圍內(nèi)被商業(yè)化種植[1]，其主要成分包括脂肪和蛋白質(zhì)[2]。在壓榨核桃油的過程中，會產(chǎn)生大量的核桃粕，其中富含各種蛋白質(zhì)[3]。核桃蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，可以滿足成年人的基本氨基酸需求。然而，與核桃蛋白相比，核桃肽具有更好的溶解性、吸濕性、乳化性和胃腸消化的穩(wěn)定性等優(yōu)良特性[4-6]。此外，核桃多肽具有多種生物功能，在抗氧化、降血脂、抗腫瘤、改善記憶和降低患阿爾茨海默癥風(fēng)險以及改善腸道菌群等方面具有顯著的效果[7-15]。

近年來，越來越多的研究致力于從植物蛋白中提取抗氧化活性肽[16]。植物抗氧化肽有諸多優(yōu)勢，如改善與氧化應(yīng)激有關(guān)的疾病[17-18]。以往的研究表明，天然抗氧化劑可以減緩食品的氧化過程[19-20]，提高質(zhì)量并延長保質(zhì)期[21-22]。將植物蛋白作為天然抗氧化肽的來源進行探索和商業(yè)化，能夠促進自然資源的可持續(xù)利用。核桃粕所富含的蛋白質(zhì)資源顯示出制備抗氧化肽的巨大潛力[23-24]。一些文獻報道了核桃多肽的抗氧化活性，如郭勇等[25]測定了長白山核桃源五肽對氧化損傷細胞的保護作用。然而，目前關(guān)于核桃多肽抗氧化作用和結(jié)構(gòu)表征的系統(tǒng)性研究報道較少。因此需要更多的研究以深入了解核桃多肽在抗氧化過程中的具體機制，并對其結(jié)構(gòu)進行進一步的表征和分析。這將有助于揭示核桃多肽的結(jié)構(gòu)特征與其抗氧化活性之間的關(guān)聯(lián)，為其進一步應(yīng)用于食品工業(yè)等領(lǐng)域提供科學(xué)依據(jù)。

本研究以核桃粕作為原料，通過復(fù)合酶酶解的方法制備核桃多肽，對其進行抗氧化性分析、結(jié)構(gòu)表征，并通過細胞實驗探索核桃多肽對氧化損傷HepG2細胞的保護作用。以期為核桃高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃粕 河北養(yǎng)元智匯飲品股份有限公司。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）測定試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性測定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性測定試劑盒、還原型谷胱甘肽酶（glutathione reductase，GSHRx）測定試劑盒、總谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；羥自由基清除能力檢測試劑盒 蘇州格銳思生物科技有限公司；胰蛋白酶、堿性蛋白酶、2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）美國Biotopped公司；過硫酸鉀 上海Aladdin公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速離心機 日本日立公司；多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；冷凍干燥機 德國Christ公司；精密pH計、電子分析天平 梅特勒托利多科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ABTS陽離子自由基清除能力測定

將0.35 mL ABTS陽離子自由基溶液（7.4 mmol/L）與0.35 mL過硫酸鉀溶液（2.6 mmol/L）混合，將其避光放置12～16 h，得到ABTS陽離子自由基工作液。用體積分數(shù)為95%的乙醇溶液稀釋混合液（體積比約1∶35），測得734 nm波長處的吸光度為0.70±0.02。每個孔中加入160 μL的ABTS陽離子自由基工作液。在樣品孔中加入40 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，輕輕混合，并在室溫條件下避光環(huán)境孵育6 min。在734 nm波長處測量吸光度[26]。用無水乙醇替代樣品作為空白組，用無水乙醇替代ABTS陽離子自由基工作溶液作為對照組，ABTS陽離子自由基清除率按式（1）計算：

式中：Ab為空白組的吸光度；As為樣品組的吸光度；Ac為對照組的吸光度。

1.3.2 DPPH自由基清除能力的測定

將100 μL樣品溶液和100 μL的0.1 mmol/L DPPH溶液（無水乙醇配制）加入到96 孔板中，混合均勻，在室溫黑暗條件下孵育30 min后，測量517 nm波長處吸光度As；用蒸餾水與DPPH溶液混合反應(yīng)作為空白組，測量吸光度Ab；無水乙醇代替DPPH溶液混合反應(yīng)，測量吸光度Ac[27]。DPPH自由基清除率按式（2）計算：

1.3.3 羥自由基清除能力的測定

使用試劑盒測定羥自由基清除能力。根據(jù)說明書設(shè)置空白組、對照組和樣品組，并依次加入試劑。在37 ℃條件下反應(yīng)20 min，測量510 nm波長處吸光度。羥自由基清除率按式（3）計算：

式中：Ab為空白組的吸光度；As為樣品組的吸光度；Ac為對照組的吸光度。

1.3.4 核桃多肽的制備

核桃粕蛋白提取采用堿提酸沉法，將脫脂核桃粕低溫粉碎、過篩，與蒸餾水以一定比例混合，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至8.6，堿溶1 h，8 000 r/min離心10 min，取上清液，調(diào)pH值至4.6，酸沉1 h，8 000 r/min離心，水洗3 次，調(diào)節(jié)pH值為7.0，冷凍干燥，得核桃蛋白。

核桃多肽制備方法參考文獻[28]并略作修改。將100 g核桃蛋白加入1.9 L去離子水中，用磁力攪拌器充分攪拌。將pH值調(diào)至8.0，加入堿性蛋白酶400 000 U和胰蛋白酶200 000 U，并在50 ℃水解4 h。在4 ℃、8 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，凍干。凍干后的核桃蛋白水解產(chǎn)物粉末在-20 ℃條件下保存。

1.3.5 核桃多肽的超濾分級

核桃蛋白水解產(chǎn)物溶液在超濾過程中通過3 個特定分子質(zhì)量超濾膜。首先，核桃蛋白水解產(chǎn)物溶液經(jīng)過截留分子質(zhì)量為10 kDa的超濾膜，允許分子質(zhì)量＜10 kDa的核桃蛋白水解產(chǎn)物通過。再使用截留分子質(zhì)量為3 kDa的超濾膜進一步分離，最后使用截留分子質(zhì)量為1 kDa的超濾膜，以獲得不同分子質(zhì)量的餾分。分別收集到＜1 kDa、1～3 kDa、3～10 kDa和＞10 kDa 4 個不同分子質(zhì)量范圍的核桃蛋白水解產(chǎn)物餾分。在真空下干燥，以獲得這些特定分子質(zhì)量范圍內(nèi)的核桃蛋白水解產(chǎn)物粉末。

1.3.6 掃描電鏡觀察

將干燥的核桃多肽樣品用導(dǎo)電膠固定在樣品座上，置于掃描電鏡觀察臺，調(diào)節(jié)掃描電鏡焦距至清晰，分別觀察放大5 000 倍和1 000 倍的圖像。

1.3.7 紫外全波長掃描

稱取核桃多肽粉末溶于蒸餾水，使其終質(zhì)量濃度為0.7 mg/mL。蒸餾水作為空白組，與多肽樣品溶液分別在200～500 nm波長范圍內(nèi)進行紫外全波長掃描。

1.3.8 熒光光譜分析

測定核桃多肽組分的熒光光譜對其結(jié)構(gòu)進行表征。稱取核桃多肽粉末溶于蒸餾水，使其終質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL。激發(fā)波長為285 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm，研究核桃多肽樣品在發(fā)射光譜300～400 nm波長范圍的熒光光譜，掃描5 次。

1.3.9 圓二色光譜分析

使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）將樣品溶解至質(zhì)量濃度0.2 mg/mL。在波長190～260 nm范圍測定圓二色光譜，步長1 nm。以PBS作為空白對照，空白對照與樣品溶液上樣量均為300 μL，測試后保存數(shù)據(jù)，計算樣品二級結(jié)構(gòu)。

1.3.10 HepG2細胞實驗

HepG2細胞在由10%胎牛血清和90%高糖DMEM培養(yǎng)基組成的DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞，加入胰酶細胞消化液進行傳代。將對數(shù)生長期的HepG2細胞在6 孔板或96 孔板上進行培養(yǎng)，用于進一步實驗。

1.3.10.1 核桃多肽對HepG2細胞存活率的影響

取生長狀態(tài)良好的HepG2細胞，消化細胞，輕輕吸打使細胞重懸。用血球計數(shù)板計算細胞濃度，之后將HepG2細胞接種到96 孔板中，密度為1×105個/mL，每孔100 μL。然后將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d。在細胞面積達到70%～80%后，吸去原來的培養(yǎng)基。設(shè)置只加培養(yǎng)基的空白組、未經(jīng)處理HepG2細胞的對照組以及在各孔中加入質(zhì)量濃度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL核桃肽溶液的樣品組，培養(yǎng)24 h。引入CCK-8溶液并進一步培養(yǎng)2 h。使用酶標(biāo)儀測量各組在490 nm波長處的OD值。細胞存活率按式（4）計算：

1.3.10.2 H2O2對HepG2細胞存活率的影響

設(shè)置只加培養(yǎng)基的空白組、未經(jīng)處理HepG2細胞的對照組以及在各孔中加入終濃度62.5、125、250、500、1 000 μmol/L H2O2溶液的模型組，培養(yǎng)4 h。引入CCK-8溶液并進一步培養(yǎng)2 h，按1.3.10.1節(jié)方法測定細胞存活率。

1.3.10.3 核桃多肽預(yù)處理對氧化損傷HepG2細胞存活率的影響

設(shè)置只加培養(yǎng)基的空白組、未經(jīng)處理HepG2細胞的對照組、未經(jīng)處理HepG2細胞的模型組以及在各孔中加入0.4、0.6、0.8 mg/mL核桃肽溶液的樣品組，培養(yǎng)24 h。吸去原有培養(yǎng)基，在模型組及樣品組中加入800 μmol/L H2O2溶液，培養(yǎng)4 h。引入CCK-8溶液并進一步培養(yǎng)2 h，按1.3.10.1節(jié)方法測定細胞存活率。

1.3.10.4 核桃多肽預(yù)處理對氧化損傷HepG2細胞內(nèi)ROS含量的影響

細胞培養(yǎng)方法同上。設(shè)置只加培養(yǎng)基的空白組、未經(jīng)處理的HepG2細胞對照組、未經(jīng)處理的HepG2細胞模型組以及在各孔中加入終質(zhì)量濃度0.4、0.6、0.8 mg/mL核桃肽溶液樣品組，培養(yǎng)24 h。吸去原有培養(yǎng)基，在模型組及樣品組中加入800 μmol/L H2O2溶液，培養(yǎng)4 h。根據(jù)ROS測定試劑盒說明書測定ROS含量。

1.3.10.5 核桃多肽預(yù)處理對氧化損傷HepG2細胞抗氧化酶活力的影響

參照1.3.10.4節(jié)設(shè)置空白組、對照組、模型組和樣品組，消化細胞。通過加入DMEM完全培養(yǎng)基（1 mL），消化反應(yīng)停止。將所得的細胞懸液移到離心管中離心，棄上清液后，重新懸浮細胞。在冰水浴中，使用300 W的細胞超聲處理，制備均勻的細胞勻漿，超聲30 s，重復(fù)4 次，每次間隔5 s。根據(jù)CAT活性測定試劑盒、SOD活性測定試劑盒、GSH-Rx活性測定試劑盒、總GSH-Px活性檢測試劑盒的說明書，在合適的條件下進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組數(shù)據(jù)進行3 次平行實驗。采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。GraphPad Prism 9.0軟件用于繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化活性

如圖1a所示，核桃蛋白水解產(chǎn)物的羥自由基清除率與0～30 mg/mL的質(zhì)量濃度呈劑量依賴性，半抑制濃度（half-maximal inhibitory concentration，IC50）值為13.20 mg/mL。這表明此蛋白水解產(chǎn)物濃度對羥自由基具有明顯的抑制作用。如圖1b所示，核桃蛋白水解產(chǎn)物對DPPH自由基的清除率在0～200 μg/mL范圍內(nèi)呈劑量依賴性，IC50值為36.07 μg/mL。結(jié)果表明，核桃蛋白水解產(chǎn)物具有清除DPPH自由基的能力。如圖1c所示，在0～150 μg/mL范圍內(nèi)，底物質(zhì)量濃度與ABTS陽離子自由基清除率之間存在顯著的劑量依賴關(guān)系。在底物質(zhì)量濃度為100 μg/mL時，水解產(chǎn)物的ABTS陽離子自由基清除率為90.13%，IC50值為52.02 μg/mL。核桃蛋白的酶解可能導(dǎo)致肽的空間構(gòu)象、氨基酸組成和分子排列的變化，從而提高清除ABTS陽離子自由基的能力。

圖1 核桃蛋白水解產(chǎn)物對羥自由基（a）、DPPH自由基（b）以及ABTS陽離子自由基（c）清除率的影響Fig.1 Hydroxyl (a),DPPH (b) and ABTS radical cation (c) scavenging capacity of walnut protein hydrolysates

2.2 核桃多肽不同分子質(zhì)量組分抗氧化活性

將超濾后得到不同分子質(zhì)量的核桃多肽進行ABTS陽離子自由基清除能力比較，結(jié)果如圖2所示。隨著核桃多肽分子質(zhì)量的逐漸減小，核桃多肽的ABTS陽離子自由基清除率呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢。其中分子質(zhì)量＜1 kDa抗氧化肽組分的ABTS陽離子自由基清除率最高，為90.95%。結(jié)果表明，核桃多肽的ABTS陽離子自由基清除率與肽分子質(zhì)量呈負相關(guān)。

圖2 不同超濾組分對ABTS陽離子自由基清除率的影響Fig.2 ABTS radical cation scavenging capacity of different ultrafiltration fractions

2.3 核桃多肽＜1 kDa組分抗氧化活性

由圖3a可知，＜1 kDa組分對羥自由基有較好的清除作用，在0～30 mg/mL范圍內(nèi)，核桃多肽組分的羥自由基清除率隨質(zhì)量濃度增大而增大，IC50值為11.47 mg/mL。核桃肽的特點是分子質(zhì)量小，含有豐富的供氫體，可以通過提供氫質(zhì)子有效減少高度氧化的自由基[29]。如圖3b所示，在底物質(zhì)量濃度0～600 μg/mL范圍內(nèi)，核桃多肽的DPPH自由基清除率隨底物質(zhì)量濃度增大而逐漸增大，IC50值為35.67 μg/mL。這可能歸因于核桃蛋白被酶解后釋放作為質(zhì)子供體的特定物質(zhì)，這些質(zhì)子供體與DPPH自由基發(fā)生反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的反磁性分子，從而顯示出強大的抗氧化活性[30]。如圖3c所示，在0～150 μg/mL范圍內(nèi)，核桃多肽的ABTS陽離子自由基清除率隨底物質(zhì)量濃度增大而增大，隨后趨于穩(wěn)定，在100 μg/mL時，其ABTS自由基清除率為90.45%，IC50值為49.72 μg/mL。核桃多肽表現(xiàn)出強大的清除ABTS陽離子自由基能力。盡管核桃多肽的抗氧化能力比VC弱，但這種天然的功能性活性物質(zhì)可以安全地長期食用，并且沒有表現(xiàn)出毒副作用。以上結(jié)果與李漢洋等[31]的研究結(jié)果一致。

圖3 ＜1 kDa核桃多肽組分對羥自由基（a）、DPPH自由基（b）以及ABTS陽離子自由基（c）清除率的影響Fig.3 Hydroxyl radical (a),DPPH radical (b) and ABTS radical cation (c)scavenging capacity of walnut peptide with molecular mass less than 1 kDa

2.4 核桃多肽＜1 kDa組分的結(jié)構(gòu)表征

2.4.1 微觀結(jié)構(gòu)觀察

由圖4可看出，核桃多肽形狀不規(guī)則、表面光滑、結(jié)構(gòu)致密，有大量粗糙紋路和孔隙，這種結(jié)構(gòu)能夠極大地增加核桃多肽的表面積。這可能是由于核桃蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)因蛋白酶酶解而被破壞，使得疏水性基團暴露在多肽表面，進而提高核桃多肽疏水性，提升抗氧化活性。分子質(zhì)量、疏水性、氨基酸組成和肽序列被認為是影響肽抗氧化活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征[32]。有研究人員對具有抗氧化活性的植物來源肽與其疏水性作用的關(guān)系進行了綜述，得出疏水性作用是多肽抗氧化活性的決定因素之一[33]。

圖4 ＜1 kDa核桃多肽組分的微觀結(jié)構(gòu)Fig.4 Microstructure of walnut peptide with molecular mass less than 1 kDa

2.4.2 紫外全波長掃描分析

如圖5所示，核桃多肽的最大吸收峰位于225 nm波長處，表明該波長范圍產(chǎn)生價電子躍遷，最大吸收峰的吸光度為8.94。這可能是因為＜1 kDa核桃多肽在酶解過程中部分肽鏈被水解，使游離氨基酸含量提高以及多肽中生色團和助色團的偏光性而形成。

圖5 核桃多肽＜1 kDa組分的的紫外全波長掃描Fig.5 Ultraviolet absorption spectrum of walnut peptide with molecular mass less than 1 kDa

2.4.3 熒光光譜掃描

有研究表明色氨酸（Trp）殘基與最大發(fā)射波長（λmax）有關(guān)[34]，如圖6所示，核桃多肽的λmax分布在345 nm處，當(dāng)λmax＞330 nm時，這說明核桃多肽中的Trp殘基主要暴露在多肽分子表面的極性環(huán)境中。同時，熒光強度與暴露在極性環(huán)境中Trp殘基的數(shù)量呈正相關(guān)。Trp殘基暴露在極性環(huán)境中的程度和數(shù)量能夠反映核桃多肽的表面疏水性，這可能是核桃多肽具備抗氧化活性的原因之一。有研究表明，Trp、脯氨酸等疏水氨基酸在消除自由基中起著重要作用[35]。

圖6 ＜1 kDa核桃多肽組分的的熒光光譜Fig.6 Fluorescence spectrum of walnut peptide with molecular mass less than 1 kDa

2.4.4 圓二色光譜分析

圓二色光譜可以表征核桃多肽的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖7、表1所示。核桃多肽的二級結(jié)構(gòu)包含多種構(gòu)象，主要為β-折疊（相對含量為36.6%）和無規(guī)卷曲（相對含量為36.5%），其中反平行式β-折疊相對含量為33.7%，平行式β-折疊為2.9%。β-折疊及無規(guī)卷曲含量較高，α-螺旋結(jié)構(gòu)（緊密的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)）含量較低，這能夠反映出多肽表面的疏水性增強。核桃多肽表現(xiàn)出一定的抗氧化能力，原因可能是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由于酶解而發(fā)生改變，肽鍵被蛋白酶切斷，使其空間結(jié)構(gòu)打開，這種結(jié)構(gòu)變化意味著蛋白質(zhì)分子內(nèi)無序結(jié)構(gòu)（β-折疊和無規(guī)卷曲）的含量變高，從而使疏水性位點暴露在多肽分子外部的極性環(huán)境中[36]。疏水性對多肽的抗氧化活性具有重要影響。當(dāng)疏水性氨基酸殘基暴露在多肽表面時，其有助于多肽在脂質(zhì)-水界面處溶解，進而更有效地清除自由基，發(fā)揮抗氧化作用[37]。

表1 核桃多肽＜1 kDa組分的二級結(jié)構(gòu)Table 1 Secondary structure composition of walnut peptide with molecular mass less than 1 kDa

圖7 核桃多肽＜1 kDa組分的的圓二色光譜Fig.7 Circular dichroism spectrum of walnut peptide with molecular mass less than 1 kDa

2.5 ＜1 kDa核桃多肽組分及H2O2對HepG2細胞存活率的影響

為了確定后續(xù)實驗中核桃多肽組分的作用濃度，通過CCK-8實驗研究了不同濃度的核桃多肽組分對HepG2細胞存活率的影響，結(jié)果見圖8a。與空白組相比，＜1 kDa核桃多肽組分的質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL時，對細胞存活率無影響。因此，選取0.4、0.6、0.8 mg/mL的＜1 kDa核桃多肽組分進行下一步實驗。

圖8 不同濃度＜1 kDa核桃多肽組分（a）及H2O2（b）對HepG2細胞存活率的影響Fig.8 Effects of walnut peptide with molecular mass less than 1 kDa (a) and H2O2 (b) on the survival rate of HepG2 cells

ROS的主要成分之一是H2O2，能夠誘發(fā)氧化應(yīng)激，破壞細胞的氧化還原平衡，在氧化應(yīng)激條件下最終導(dǎo)致細胞程序性死亡或組織損傷。如圖8b所示，經(jīng)過不同濃度H2O2孵育4 h后，隨著H2O2濃度的增加，細胞存活率持續(xù)降低，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。當(dāng)H2O2濃度為1 000 μmol/L時，細胞存活率僅為47.28%。經(jīng)過計算，細胞的IC50為804.9 μmol/L，因而選擇800 μmol/L作為后續(xù)實驗的H2O2濃度。

2.6 ＜1 kDa核桃多肽組分對氧化損傷HepG2細胞存活率及ROS的影響

如圖9a所示，與對照組相比，模型組的細胞存活率顯著降低（P＜0.05），從而證實了實驗?zāi)Ｐ统晒ⅰＳ貌煌|(zhì)量濃度的核桃多肽樣品培育24 h后，其細胞存活率呈濃度依賴性增加趨勢，這表明核桃多肽可以減輕H2O2誘導(dǎo)的細胞損傷，并保護細胞存活。當(dāng)核桃多肽質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時，可以顯著提高HepG2細胞的存活率（P＜0.05）。

圖9 ＜1 kDa核桃多肽組分對氧化損傷HepG2細胞存活率（a）及ROS水平（b）的影響Fig.9 Effect of walnut peptide with molecular mass less than 1 kDa on the survival rate (a) and ROS level (b) of oxidatively damaged HepG2 cells

ROS的過度產(chǎn)生可能破壞細胞氧化還原系統(tǒng)的平衡，導(dǎo)致組織損傷。因此，本實驗通過測定細胞內(nèi)的ROS水平評估細胞內(nèi)氧化損傷程度。如圖9b所示，與對照組相比，模型組的ROS水平度顯著增加（P＜0.05），表明實驗?zāi)Ｐ陀行Ы?。與模型組相比，0.8 mg/mL核桃多肽組的ROS水平顯著減少（P＜0.05），為107.81。這與Liu Chunlei等[29]的研究結(jié)果一致，核桃多肽能夠提高細胞存活率，減少細胞中ROS的生成。

2.7 ＜1 kDa核桃多肽組分對H2O2誘導(dǎo)HepG2細胞內(nèi)抗氧化酶的影響

如圖10a所示，模型組的SOD活性顯著降低。然而，當(dāng)用不同質(zhì)量濃度的＜1 kDa核桃肽組分預(yù)處理HepG2細胞時，SOD活性呈明顯的劑量依賴性增加，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時，SOD活力為172.20 U/mg。由此表明，＜1 kDa核桃多肽組分能夠提高HepG2細胞中SOD的活力水平，表明其具有增強細胞抗氧化活性的潛力。如圖10b所示，與對照組相比，模型組的CAT活力下降；與模型組相比，樣品組的CAT活力均提高，并隨著多肽組分濃度的增加而增加。由此表明，＜1 kDa核桃多肽組分能夠提高HepG2細胞中CAT的活力水平。GSH-Px的主要功能是清除過氧化氫和脂類氫過氧化物，從而保持細胞的穩(wěn)態(tài)。如圖10c所示，與空白組相比，模型組的GSH-Px的活力水平顯著下降；與模型組相比，經(jīng)＜1 kDa核桃多肽組分預(yù)處理樣品組的GSH-Px的活力水平均提高，并隨著多肽組分濃度提高而提高。氧化型谷胱甘肽能夠被GSHRx還原成GSH，提供清除ROS所需的還原力，從而保護生物系統(tǒng)免受氧化損傷。如圖10d所示，模型組的GSHRx的活力顯著下降；與模型組相比，樣品組的GSH-Rx活力水平均提高，并隨著多肽組分濃度提高而提高。上述結(jié)果與Zhao Fanrui等[38]的研究結(jié)果相似。

圖10 ＜1 kDa核桃多肽組分對H2O2誘導(dǎo)HepG2細胞內(nèi)抗氧化酶的影響Fig.10 Effect of walnut peptide with molecular mass less than 1 kDa on H2O2-induced antioxidant enzymes in HepG2 cells

3 結(jié)論

本實驗以核桃肽為研究對象，分析了超濾后不同分子質(zhì)量核桃肽的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量＜1 kDa核桃多肽組分的抗氧化活性最強，其羥自由基清除能力的IC50值為11.47 mg/mL、DPPH自由基清除能力的IC50值為35.67 μg/mL、ABTS陽離子自由基清除能力的IC50值為49.72 μg/mL，均呈現(xiàn)出濃度依賴性。同時，＜1 kDa核桃多肽組分對H2O2引起的HepG2細胞氧化損傷具有一定的保護作用，能夠減少HepG2細胞內(nèi)ROS含量，提高HepG2細胞內(nèi)抗氧化酶的活力水平。核桃多肽形狀不規(guī)則、表面光滑、結(jié)構(gòu)致密，有大量粗糙紋路和孔隙。核桃多肽的二級結(jié)構(gòu)以多種構(gòu)象并存，主要為β-折疊（相對含量為36.6%）和無規(guī)卷曲（相對含量為36.5%）。核桃多肽具有良好的抗氧化活性，可用于開發(fā)核桃肽功能食品，本研究對實現(xiàn)核桃粕的高值化利用有一定參考價值。