孔文迪， 陳 曦， 楊金先， 葛均青

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，福建 福州 350003)

中國具有世界上規(guī)模最大的鰻鱺養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，養(yǎng)殖區(qū)集中在福建省和廣東省，主要的養(yǎng)殖品種為日本鰻鱺(Anguillajaponica)和美洲鰻鱺(A.rostrata)等[1]。自2015 年以來，美洲鰻鱺已成為福建省主要的鰻鱺養(yǎng)殖品種。近年來，養(yǎng)殖的美洲鰻鱺陸續(xù)出現(xiàn)一種持續(xù)時間長(3～6 個月)，累計死亡率高(20%～50%)的傳染性疾病?；疾■狑~的主要發(fā)病特征為鰓絲密布針尖大小出血點，因此命名為 “出血性爛鰓”[2]。在前期研究中，利用鰻鱺卵巢細(xì)胞(eel ovary cell line, EO)，從患 “出血性爛鰓” 美洲鰻鱺體內(nèi)分離鑒定出一種新的病毒，命名為美洲鰻鱺腺瘤病毒(American eel adomavirus，AEAdoV)[2]。為進(jìn)一步研究AEAdoV 的致病性及其流行狀況，需要建立靈敏、特異的AEAdoV 檢測方法。

AEAdoV 病毒粒子為二十面體結(jié)構(gòu)，直徑75～85 nm，為無囊膜dsDNA 病毒，隸屬于羅韋病毒目(Rowavirales) 瘤病毒科(Adomaviridae) β 腺瘤病 毒 亞 科(Beta-adomaviruses)[3]。AEAdoV 與β 腺瘤病毒亞科的其他成員都編碼superfamily 3 helicases (S3H)復(fù)制酶，與花鰻腺瘤病毒(marbled eel adomavirus，MEAdoV)的S3H 基因具有同源性[4]?；谄胀≒CR 和qPCR 的分子生物學(xué)檢測方法具有特異性強(qiáng)和靈敏度高等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)病毒的檢測[5-7]。為建立AEAdoV 的分子生物學(xué)檢測方法，根據(jù)AEAdoV 的S3H 基因序列，通過比對分析，獲得了與MEAdoV 序列同源率低且與β腺瘤病毒亞科中的其他病毒成員無同源性的片段，根據(jù)該片段設(shè)計引物，構(gòu)建了AEAdoV 的普通PCR 和SYBR Green I qPCR 檢測方法，并對上述方法的靈敏性、特異性及重復(fù)性進(jìn)行了評價。利用建立的普通PCR 和qPCR 檢測方法對收集的美洲鰻鱺 “出血性爛鰓” 病料進(jìn)行了檢測，明確了AEAdoV 在鰻鱺體內(nèi)的分布情況，為深入開展該病毒的流行病學(xué)和致病機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系與病毒株

鰻鱺卵巢細(xì)胞系(EO)、鯉上皮瘤細(xì)胞系(Epithelioma papilloma cyprinid cell line, EPC)由本實驗室保存，美洲鰻鱺腺瘤病毒福建株(AEAdoV-FJ)、蛙虹彩病毒(Rana grylio virus, RGV)[8]、鰻鱺皰疹病毒(Anguillid herpesvirus, AngHV)和鯉皰疹病毒(Koi herpes virus, KHV)[9]由本實驗室分離或保存，對 蝦 白 斑 綜 合 征 病 毒(White spot syndrome virus,WSSV)、日本鰻鱺內(nèi)皮細(xì)胞壞死病毒(Japanese eel adomavirus, JEAdoV)和花鰻鱺腺瘤病毒(Marbled eel adomavirus, MEAdoV) 基因組DNA 均由本實驗室提取并保存。

1.2 主要儀器及試劑

2 ×TaqMaster Mix (Dye Plus)、DNA Marker、TaqPro SYBR qPCR Master Mix 試 劑 盒 和pCE2-TA/Blunt 載體購自諾唯贊(南京)生物科技股份有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI 購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒和血液/細(xì)胞/組織DNA 提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司。瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自廣州美基生物科技有限公司。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。主要儀器包括PCR 儀

(Applied Biosystems Veriti PCR，Thermo Fisher Scientific)、 qPCR 儀(QuantStudio 3, Thermo Fisher Scientific)、超微量紫外可見分光光度計(DA-11，DeNovix)、凝膠成像分析系統(tǒng)(WD-9413C，北京六一生物科技有限公司)等。

1.3 引物的設(shè)計與優(yōu)化

根據(jù)AEAdoV-FJ 的S3H 序列，分別設(shè)計用于普通PCR 和qPCR 特異性擴(kuò)增S3H 序列的引物對AEAdoV-FW/AEAdoV-RW 和AEAdoV-qF/AEAdoV-qR，其序列和目的片段長度見表1。

表1 普通PCR 和SYBR Green Ⅰ qPCR 引物序列Tab. 1 Primer sequences used for routine PCR and SYBR Green Ⅰ qPCR detection

1.4 普通PCR 檢測方法的建立

將AEAdoV-FJ 接種EO 細(xì)胞系，待細(xì)胞產(chǎn)生典型病變后，收集細(xì)胞，離心取上清液，用病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒提取總DNA，用引物對AEAdoV-FW/AEAdoV-RW 對提取的DNA 進(jìn)行普通PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，割膠回收并純化目的片段，并將目的片段克隆至pCE2-TA/Blunt 載體，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒后再進(jìn)行酶切、測序鑒定。反應(yīng)體系：AEAdoV-FJ 基因組DNA 1 μL，2×TaqMaster Mix 12.5 μL， AEAdoV-FW 和 AEAdoV-RW(10 μmol/L)各1 μL、加ddH2O 補(bǔ)液至25 μL；反應(yīng)程序：95 °C 預(yù)變性5 min；95 °C 變性30 s，56 °C退火30 s，72 °C 延伸20 s，共30 個循環(huán)；最后72 °C 延伸7 min。

1.5 qPCR 檢測方法的建立

取構(gòu)建的pCE2-TA/Blunt-S3H 質(zhì)粒DNA，用超微量紫外分光光度計測定其濃度和純度，用DNA/RNA Copy Number Calculator (http: //www.endmemo.com/bio/dnacopynum.php)計算單位體積(μL) DNA 樣品中質(zhì)粒的拷貝數(shù)，作為標(biāo)準(zhǔn)品，分裝后保存于-80 °C 備用。以提取的AEAdoV-FJ 基因組為模板，用引物對AEAdoV-qF/AEAdoV-qR使用TaqPro Universal SYBR qRCR Master Mix 試劑盒進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增，每個濃度設(shè)3 個重復(fù)，陰性對照用ddH2O 代替模板，制作qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線。反 應(yīng) 體 系：AEAdoV-FJ 基 因 組DNA 1 μL，2×qPCR Master Mix 10 μL，AEAdoV-qF 和AEAdoV-qR(10 μmol/L)各0.4 μL，ddH2O 8.2 μL；反應(yīng)條件：95 °C 預(yù)變性30 s；95 °C 5 s，60 °C 34 s，40 個循環(huán)。

1.6 普通PCR 和qPCR 檢測方法的特異性評價

靈敏性檢測 以梯度稀釋的pCE2-TA/Blunt-S3H 為模板，利用設(shè)計的引物對AEAdoVFW/AEAdoV-RW 和AEAdoV-qF/AEAdoV-qR 分別進(jìn)行普通PCR 和qPCR 擴(kuò)增，分析比較2 種方法所能檢測的最低AEAdoV-FJ 拷貝數(shù)。

特異性檢測 取AEAdoV-FJ、AngHV、RGV 和KHV 細(xì)胞培養(yǎng)上清液，利用病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒提取DNA，以上述病毒DNA 及實驗室保存的WSSV、JEAdoV 和MEAdoV基因組DNA 作為模板，用建立的普通PCR 和qPCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增，評價2 種檢測方法的特異性。

重復(fù)性檢測 分別取105和104拷貝/μL的pCE2-TA/Blunt-S3H 作為模板，進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增，每個濃度設(shè)3 個重復(fù)，根據(jù)閾值循環(huán)數(shù) (cycle threshold value,Ct) 的變異系數(shù)分析該方法的組內(nèi)重復(fù)性。重復(fù)實驗3 次，分析組間重復(fù)性。

1.7 普通PCR 和qPCR 檢測方法的應(yīng)用

取實驗室收集的35 份疑似美洲鰻鱺 “出血性爛鰓” 病料，取肝臟、脾臟、腎臟等內(nèi)臟組織，用血液/細(xì)胞/組織DNA 提取試劑盒提取DNA，用超微量紫外分光光度計測定其純度和濃度，分別用建立的普通PCR 和qPCR 檢測方法對樣品進(jìn)行檢測，統(tǒng)計2 種檢測方法的AEAdoV-FJ 檢出率。取AEAdoV 陽性的黑仔期美洲鰻鱺，取鰭、鰓、表皮黏液、皮膚、肌肉、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦和腸道等部位組織，分別用血液/細(xì)胞/組織DNA 提取試劑盒提取的DNA 作為模板，用建立的qPCR 方法檢測各部位的病毒載量，分析病毒的分布情況，重復(fù)3 次。采用SPSS 19.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，Duncan 氏法進(jìn)行多重比較，當(dāng)P＜0.05 時差異顯著，數(shù)據(jù)用 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)差” 表示。實驗期間，操作者嚴(yán)格遵守實驗動物福利倫理規(guī)范。

2 結(jié)果

2.1 AEAdoV S3H 基因片段的普通PCR 擴(kuò)增和克隆

取提取的AEAdoV-FJ 基因組DNA，用引物對AEAdoV-FW/AEAdoV-RW 進(jìn)行普通PCR 擴(kuò)增，獲得與預(yù)期大小一致的約300 bp 的特異性條帶(圖1-a)。進(jìn)一步回收該片段，克隆至pCE2-TA/Blunt 載體，經(jīng)單酶切及測序鑒定，獲得質(zhì)粒pCE2-TA/Blunt-S3H (圖1-b)。

圖1 AEAdoV S3H 基因片段的PCR 擴(kuò)增和克隆(a) AEAdoV S3H 基因片段的PCR 擴(kuò)增，M. DNA marker，1. AEAdoV-FJ，2. 陰性對照；(b) pCE2-TA/Blunt-S3H 的單酶切鑒定，M. DNA marker，1. Eco R I 酶切，箭頭所示為目的片段。Fig. 1 PCR amplification and cloning of AEAdoV S3H gene fragments(a) PCR amplification partial of the AEAdoV S3H gene, M. DNA marker, 1. AEAdoV-FJ, 2. negative control; (b) restriction enzyme digestion of the plasmid pCE2-TA/Blunt-S3H, M. DNA marker, 1. single enzyme digestion by Eco R I, the arrow represents the target gene.

2.2 AEAdoV SYBR Green Ⅰ qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以108～101拷貝/μL 10 倍比稀釋的質(zhì)粒pCE2-TA/Blunt-S3H 作為模板，用引物對AEAdoVqF/AEAdoV-qR 進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增，用質(zhì)?？截悢?shù)與Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，質(zhì)粒拷貝數(shù)與Ct值的線性關(guān)系為y=-3.206x+38.140，相關(guān)系數(shù)R2為0.999，擴(kuò)增效率為105.067%，線性關(guān)系較好。熔解曲線圖顯示，不同拷貝數(shù)質(zhì)粒的熔解曲線均只有1 個熔解峰，Tm值為85.33～85.78 °C，表明反應(yīng)均為特異性擴(kuò)增，無非特異性擴(kuò)增或引物二聚體產(chǎn)生(圖2)。

圖2 AEAdoV SYBR Green Ⅰ qPCR 檢測的熔解曲線Fig. 2 Melting curve plot of the AEAdoV SYBR Green Ⅰ qPCR assay

2.3 AEAdoV 普通PCR 和SYBR Green ⅠqPCR 檢測方法的特性評價

以108～100拷貝/μL 10 倍比稀釋的質(zhì)粒pCE2-TA/Blunt-S3H DNA 作為模板，分別進(jìn)行普通PCR和SYBR Green Ⅰ qPCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示，普通PCR 的最低檢出的病毒拷貝數(shù)為100 個(圖3-a)，而SYBR Green I qPCR 的最低檢出為10 個(圖3-b)，表明SYBR Green I qPCR 法比PCR 法的靈敏性高10 倍。

圖3 AEAdoV 普通PCR 和SYBR Green I qPCR 檢測的靈敏性(a) AEAdoV 普 通PCR 檢 測的 靈敏 性，M. DNA marker，1～9 依 次為108～100 個拷貝的重組質(zhì)粒，10 為陰性對照；(b) AEAdoV 的SYBR Greeen I qPCR 檢測靈敏性，1～9 依次為108～100 個拷貝的重組質(zhì)粒，10 為陰性對照。Fig. 3 Sensitivity of routine PCR assay and SYBR Green I qPCR assay for the detection of AEAdoV(a) AEAdoV routine PCR assay, M. DNA marker，lanes 1-9 represent recombinant plasmid ranging from 108-100 copies, lane 10. negative control;(b) detection sensitivity of the AEAdoV qPCR assay, plot 1-9 represent recombinant plasmid ranging from 108-100 copies, lane 10. negative control.

以 AEAdoV-FJ、 AngHV、 RGV、 KHV、WSSV、JEAdoV 和MEAdoV 的 基 因 組DNA 和pCE2-TA/Blunt-S3H 重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行普通PCR 和SYBR Green I qPCR 擴(kuò)增的特異性檢測。普通PCR 結(jié)果顯示，AEAdoV-FJ 和pCE2-TA/Blunt-S3H 均擴(kuò)增出特異性目的條帶，AngHV、RGV、KHV、WSSV、JEAdoV 和MEAdoV則均呈陰性(圖4-a, b)。qPCR 結(jié)果顯示，AEAdoVFJ 和pCE2-TA/Blunt-S3H 均有擴(kuò)增曲線產(chǎn)生，而其他模板均無特異性擴(kuò)增信號(圖4-c, d)。上述結(jié)果表明，建立的AEAdoV 普通PCR 和SYBR Green I qPCR 檢測方法特異性良好。

圖4 AEAdoV 的普通PCR 和SYBR Green I qPCR 檢測特異性(a)用細(xì)胞擴(kuò)繁的病毒進(jìn)行AEAdoV 的普通PCR 特異性檢測，M. DNA marker，1. AEAdoV-FJ，2. pCE2-TA/Blunt-S3H，3. AngHV，4. RGV，5. KHV，6. 陰性對照；(b)以組織提取的病毒DNA 為模板進(jìn)行AEAdoV 的普通PCR 特異性檢測，M. DNA marker，1. AEAdoV-FJ，2. pCE2-TA/Blunt-S3H，3. WSSV，4. JEAdoV，5. MEAdoV，6. 陰性對照；(c)以細(xì)胞擴(kuò)繁的病毒DNA 為模板進(jìn)行AEAdoV 的qPCR 特異性檢測，M. DNA marker，1. AEAdoV-FJ，2. pCE2-TA/Blunt-S3H，3. AngHV，4. RGV，5. KHV，6. 陰性對照；(d)以組織提取的病毒DNA 為模板進(jìn)行AEAdoV 的qPCR 特異性檢測，M. DNA marker，1. AEAdoV-FJ，2. pCE2-TA/Blunt-S3H，3. WSSV，4. JEAdoV，5. MEAdoV，6. 陰性對照。Fig. 4 Detection specificity of the AEAdoV routine PCR assay and SYBR Green I qPCR assay(a) detection specificity of the AEAdoV routine PCR assay using cell propagated viral DNA. M. DNA marker, 1. AEAdoV-FJ, 2. pCE2-TA/Blunt-S3H,3. AngHV, 4. RGV, 5. KHV, 6. negative control; (b) detection specificity of the AEAdoV routine PCR assay using tissue extracted viral DNA. M. DNA marker, 1. AEAdoV-FJ, 2. pCE2-TA/Blunt-S3H, 3. WSSV, 4. JEAdoV, 5. MEAdoV, 6. negative control; (c) detection specificity of the AEAdoV qPCR assay using cell propagated viral DNA. M. DNA marker, 1. AEAdoV-FJ, 2. pCE2-TA/Blunt-S3H, 3. AngHV, 4. RGV, 5. KHV, 6. negative control; (d)detection specificity of the AEAdoV qPCR assay using tissue extracted viral DNA. M. DNA marker, 1. AEAdoV-FJ, 2. pCE2-TA/Blunt-S3H, 3. WSSV,4. JEAdoV, 5. MEAdoV, 6. negative control.

分別取105和104個拷貝的重組質(zhì)粒進(jìn)行SYBR Green I qPCR 的重復(fù)性檢測。結(jié)果顯示，組內(nèi)變異系數(shù)均小于1%，分別為0.08%和0.47%；組間變異系數(shù)均小于2%，分別為1.50%和0.22%(表2)，表明qPCR 方法的重復(fù)性好，可保證檢測結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。

表2 AEAdoV SYBR Green I qPCR 檢測的重復(fù)性Tab. 2 Detection repeatability of the AEAdoV SYBR Green I qPCR assay

2.4 AEAdoV 普 通 PCR 和 SYBR Green I qPCR 方法的應(yīng)用

分別用建立的普通PCR 法和SYBR Green I qPCR 法對收集的35 份疑似鰻鱺 “出血性爛鰓” 病料進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，普通PCR 法共檢出29份陽性樣品，陽性檢出率為82.8%；而qPCR 法檢出34 份陽性樣品，陽性檢出率為97%，AEAdoV檢出率高于普通PCR 法。

用建立的AEAdoV SYBR Green I qPCR 方法檢測AEAdoV 感染鰻鱺主要組織內(nèi)的AEAdoV 含量，結(jié)果顯示，在檢測的所有組織中均可檢測到AEAdoV，其中心臟、肝臟、鰓和鰭的AEAdoV含量較高，心臟中的含量可達(dá)109.12±1.42拷貝，與其他組織均差異極顯著(P＜0.001)，而體表(黏液和皮膚)以及脾臟含量相對較低(102.61±0.38～103.53±0.08)，顯著低于其他組織(P＜0.05) (圖5)。

圖5 AEAdoV 在感染鰻鱺主要組織內(nèi)的分布情況1. 心 臟，2. 肝 臟，3. 鰓，4. 鰭 條，5. 腎 臟，6. 腸 道，7. 脾 臟，8. 黏液，9. 皮膚，10. 腦，11. 肌肉。不同字母表示差異顯著(P＜0.05)。Fig. 5 Distribution of AEAdoV in the main tissues of the infected eels 1. heart, 2. liver, 3. gill, 4. fin, 5. kidney, 6. intestine, 7. spleen, 8. mucus,9. skin, 10. brain, 11. muscle; different letters mean significant differences (P＜0.05).

3 討論

近年來，美洲鰻鱺 “出血性爛鰓” 頻發(fā)，已經(jīng)成為養(yǎng)殖美洲鰻鱺的重要疾病[10-11]。其臨床病征，與日本鰻鱺內(nèi)皮細(xì)胞壞死病毒(JEAdoV)和花鰻鱺腺瘤病毒(MEAdoV)引起的內(nèi)皮細(xì)胞壞死癥(VECNE)類似[12-14]。為研究AEAdoV 的流行情況和病原學(xué)情況，本研究建立了AEAdoV 的普通PCR 和SYBR Green Ⅰ qPCR 檢測方法。結(jié)果顯示，普通PCR 檢測方法和qPCR 檢測方法對AEAdoV都具有良好的特異性，與幾種常見的水生動物DNA病毒(AngHV、RGV、KHV、WSSV、JEAdoV、MEAdoV)無交叉反應(yīng)；qPCR 法重復(fù)性佳，組間和組內(nèi)變異系數(shù)均小于2%；qPCR 檢測方法可以檢測到10 個病毒拷貝數(shù)，其檢測靈敏度高于普通PCR；在臨床樣品的應(yīng)用檢測中，AEAdoV 的qPCR 檢測陽性檢出率遠(yuǎn)高于普通PCR 檢測，證明該方法更加靈敏、有效。AEAdoV 在 “出血性爛鰓” 病料中的高檢出率表明，AEAdoV 在患 “出血性爛鰓” 的美洲鰻鱺中普遍存在，與疾病的發(fā)生存在正相關(guān)關(guān)系。AEAdoV 對于魚體的致病力，以及是否存在其他病原共感染，需要深入研究。

腺瘤病毒存在潛伏感染特性，病毒在宿主體內(nèi)長期存在而不致病，如MEAdoV[15]、JEAdoV[16]等。前期研究顯示，美洲鰻鱺腹腔注射AEAdoV 35 d 后，可檢測到病毒，但魚體無可見表觀癥狀和病理變化[2]。因此，推斷AEAdoV 可潛伏感染，難以通過體表病理變化判斷魚體的感染狀況。建立AEAdoV 的qPCR 檢測方法，可在病毒潛伏期以及無臨床癥狀的魚體中準(zhǔn)確檢測AEAdoV，有利于盡早發(fā)現(xiàn)病毒感染，從而采取積極的防控措施，同時也有助于避免引入潛伏感染AEAdoV的苗種，減少病毒的傳播。

明確病毒在不同組織的分布情況，對于研究病毒的致病機(jī)制和入侵規(guī)律具有重要意義[17-20]。鰻鱺在感染AngHV 后，鰓和皮膚黏液內(nèi)的病毒含量遠(yuǎn)高于其他組織，表明上述器官可能是AngHV入侵和感染的主要靶器官[5,21]。本研究顯示，感染AEAdoV 的美洲鰻鱺內(nèi)臟組織中的AEAdoV 相對含量較高，特別是心臟中AEAdoV 含量遠(yuǎn)高于其他組織，而體表(黏液和皮膚)的病毒含量相對較低，因此可以判斷體表并非AEAdoV 感染和增殖的主要組織。當(dāng)病毒在某組織中含量較高時，會引起相應(yīng)組織發(fā)生病變，如魚呼腸孤病毒(piscine reovirus, PRV)，主要分布在大西洋鮭 (Salmo salar)的心臟中，可引起魚體發(fā)生心肌炎癥，造成包括心臟蒼白、心包出血、腹水等[22-23]等病變。但在感染了AEAdoV 的美洲鰻鱺組織(如心臟、肝臟)中，并未觀察到類似病變，AEAdoV 的致病性還需要進(jìn)一步的研究。此外，了解AEAdoV 在魚體內(nèi)的分布狀況，可指導(dǎo)疑似病例檢測樣品的采集；采集心臟等內(nèi)臟組織進(jìn)行檢測，可以有效降低假陰性的概率，提高檢測的準(zhǔn)確性。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）