繩秀珍， 王錦誠(chéng)， 唐小千， 邢 婧， 遲 恒， 戰(zhàn)文斌

(中國(guó)海洋大學(xué)，水產(chǎn)動(dòng)物病害與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003)

魚類生活的水環(huán)境富含病原微生物，絕大多數(shù)病原經(jīng)過黏膜表面侵入魚體引發(fā)疾病。黏膜相關(guān) 淋 巴 組 織(mucosal-associated lymphoid tissue，MALTs)是魚類發(fā)揮黏膜免疫功能并維持局部穩(wěn)態(tài)的主體，是魚體抵御病原入侵的第一道防線。先前MALTs 的研究主要聚焦于鰓、腸道和皮膚黏膜相關(guān)淋巴組織[1-7]，但近年來，魚類鼻黏膜相關(guān) 淋 巴 組 織 (nasal-associated lymphoid tissue，NALT)得到國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注并取得突破性進(jìn)展，也逐漸被接納為魚類的第四大黏膜相關(guān)淋巴組織。NALT 存在特殊于其他黏膜相關(guān)淋巴組織的免疫細(xì)胞與分子機(jī)制，在魚類黏膜免疫研究中占據(jù)重要地位。研究表明，NALT 是魚類鼻腔中富含髓樣和淋巴樣細(xì)胞的彌散狀組織，作為嗅覺器官中主要的黏膜免疫誘導(dǎo)部位，在抗原處理和免疫激活中發(fā)揮重要作用[8]。目前，學(xué)者已通過組織病理學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)和生物信息學(xué)等研究方法，對(duì)以虹鱒(Oncorhynchus mykiss)為主的數(shù)種魚類的NALT 展開多層次的分析，同時(shí)以NALT 為作用靶點(diǎn)，實(shí)施魚類疫苗鼻內(nèi)注射的接種策略并評(píng)估其免疫保護(hù)效果。本文梳理了魚類NALT 的發(fā)現(xiàn)及復(fù)雜組織結(jié)構(gòu)、免疫細(xì)胞與分子網(wǎng)絡(luò)、病原侵染誘導(dǎo)的NALT 免疫應(yīng)答以及鼻內(nèi)接種的保護(hù)效果，旨在闡述魚類NALT 的免疫應(yīng)答和黏膜防御機(jī)制，探究鼻內(nèi)免疫策略及效果，以期為新型黏膜疫苗的設(shè)計(jì)與研發(fā)提供參考。

1 魚類NALT 的發(fā)現(xiàn)

脊椎動(dòng)物的嗅覺器官不僅發(fā)揮化學(xué)感覺器作用，也具備抵御病原入侵的能力。其中，NALT在嗅覺器官中執(zhí)行免疫防御功能，維持局部黏膜穩(wěn)態(tài)[9]。作為一種古老而保守的黏膜免疫系統(tǒng)，NALT 不局限存在于高等脊椎動(dòng)物。研究表明，從硬骨魚、兩棲類到哺乳動(dòng)物，NALT 逐漸向 “淋巴組織器官化” 方向進(jìn)化。作為低等脊椎動(dòng)物，硬骨魚的NALT 為彌散狀，不具有完整的淋巴結(jié)構(gòu)，稱為彌散狀鼻黏膜相關(guān)淋巴組織(diffuse NALT，D-NALT)。肺魚在進(jìn)化生物學(xué)研究中占據(jù)重要位置，學(xué)者發(fā)現(xiàn)非洲肺魚(Protopterus annectens)存在包囊化的鼻咽淋巴細(xì)胞聚集體(encapsulated nasal lymphoid aggregates)[10]。在 哺 乳 動(dòng) 物 與 鳥 類中，存在組織結(jié)構(gòu)良好、可辨識(shí)的NALT，稱為組織化的黏膜相關(guān)淋巴組織(organized NALT，ONALT)[9,11-14]。從進(jìn)化免疫學(xué)的角度考慮，NALT結(jié)構(gòu)隨進(jìn)化地位升高漸趨復(fù)雜，向包囊化、團(tuán)塊狀的形態(tài)進(jìn)化，極大提高了NALT 中免疫監(jiān)視能力與免疫細(xì)胞互作效率，使得免疫機(jī)能更為完善。

2014 年，Irene Salinas 研 究 團(tuán) 隊(duì) 首 次 在 硬 骨魚虹鱒中發(fā)現(xiàn)NALT[8]。研究表明，虹鱒NALT 由淋巴樣細(xì)胞和髓樣細(xì)胞組成彌散狀結(jié)構(gòu)，缺乏哺乳動(dòng)物鼻咽組織中成形的扁桃體和腺樣體結(jié)構(gòu)。但在2022 年，該團(tuán)隊(duì)報(bào)道了新的發(fā)現(xiàn)，即虹鱒鼻腔中存在從鼻孔最背側(cè)開口延伸到鼻腔腹側(cè)的淋巴細(xì)胞聚集體，由約56% CD4+T 細(xì)胞、24% IgM+B 細(xì) 胞、16% CD8α+T 細(xì) 胞 和4% IgT+B 細(xì) 胞 組成[15]。這是在硬骨魚中，首次對(duì)O-NALT 的結(jié)構(gòu)展開描述，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，虹鱒O-NALT 在鼻內(nèi)疫苗免疫后成為B 細(xì)胞增殖與凋亡的活躍場(chǎng)所，并表達(dá)哺乳動(dòng)物生發(fā)中心(germinal center，GC)特征的分子標(biāo)記，推測(cè)該特殊部位可能作為虹鱒早期適應(yīng)性免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)位點(diǎn)。但NALT 局部免疫是否能夠誘導(dǎo)魚體全身黏膜組織的效應(yīng)性應(yīng)答及其對(duì)系統(tǒng)性免疫應(yīng)答的影響仍有待研究。

2 魚類嗅覺器官的形態(tài)結(jié)構(gòu)

脊椎動(dòng)物的嗅覺系統(tǒng)，在解剖學(xué)上屬于一類跨物種保守的感覺系統(tǒng)，魚類嗅覺系統(tǒng)由嗅覺器官和嗅球組成。魚類通過受自主神經(jīng)纖維支配的嗅覺器官探測(cè)氣味信號(hào)與環(huán)境變化，從而開展進(jìn)食、交配、聯(lián)絡(luò)和危險(xiǎn)感知等生存行為[9,16-17]。除了良好的化學(xué)感知能力，魚類的嗅覺器官同時(shí)具備抵御病原的特殊解剖學(xué)與形態(tài)學(xué)構(gòu)造。獨(dú)特的組織結(jié)構(gòu)使魚類嗅覺器官成為研究病原體侵染和免疫-中樞神經(jīng)互作的理想模型。

2.1 魚類嗅覺器官的解剖學(xué)研究

在解剖學(xué)上，魚類的嗅覺器官經(jīng)前鼻孔和后鼻孔與外界相通，直接暴露于復(fù)雜的水環(huán)境中。在肌肉泵動(dòng)、水流推動(dòng)和支持細(xì)胞纖毛的擺動(dòng)下，嗅覺器官被水環(huán)境中的病原或信號(hào)分子充分浸潤(rùn)，尤其是關(guān)鍵部位——嗅囊。作為一對(duì)內(nèi)陷的構(gòu)造，嗅囊多開口于頭部背前方，被軟骨緊密保護(hù)，由嗅囊膜(olfactory sac membrane)、嗅軸(rachis)和嗅板(olfactory lamellae)組成，唯一的嗅上皮位于嗅囊中[16]。大量形態(tài)類似于鰓絲的嗅板結(jié)構(gòu)為魚類嗅覺器官與外界物質(zhì)的交流提供了廣闊的黏膜表面積，有利于魚類行使嗅覺功能和免疫防御功能。

2.2 魚類嗅覺器官的形態(tài)學(xué)研究

因物種或環(huán)境差異，硬骨魚嗅覺器官的形態(tài)多變。出于對(duì)嗅覺功能、環(huán)境脅迫和物種進(jìn)化等目標(biāo)的研究，諸多學(xué)者對(duì)多種魚類的嗅覺器官開展了形態(tài)學(xué)以及超微結(jié)構(gòu)觀察[17-24]，例如，對(duì)大口黑鱸(Micropterus salmoides)嗅覺器官的組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，大口黑鱸嗅囊為 “扇形蓮花狀” 結(jié)構(gòu)，其中嗅上皮由神經(jīng)上皮(感覺上皮)和黏膜上皮(非感覺上皮)中的5 類功能各異的細(xì)胞組成，即嗅覺感覺神經(jīng)元、支持細(xì)胞、基底細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和黏液細(xì)胞[24]。斑馬魚(Danio rerio)嗅覺器官包括數(shù)個(gè)排列有序的片層(嗅板)，形成雙側(cè)對(duì)稱的 “玫瑰花結(jié)” (rosettes)結(jié)構(gòu)，片層嗅上皮側(cè)部為非感覺上皮區(qū)；中部是連續(xù)感覺上皮區(qū)，該區(qū)域?yàn)榈湫偷募購?fù)層柱狀上皮，主要由嗅覺感覺神經(jīng)元、基底細(xì)胞和支持細(xì)胞組成[16]。魚類NALT 具備其他MALTs 所需的細(xì)胞與分子特征，即黏膜處的B 淋巴細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞形成一個(gè)動(dòng)態(tài)白細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，彌散狀分布于鼻黏膜的上皮層和固有層[1]，從而為抗體分泌和細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)提供了解剖學(xué)、生理學(xué)和免疫學(xué)基礎(chǔ)。

2.3 魚類嗅覺器官的神經(jīng)-免疫微環(huán)境

魚類嗅覺器官中神經(jīng)上皮與黏膜上皮交錯(cuò)分布，神經(jīng)系統(tǒng)以復(fù)雜的方式調(diào)節(jié)黏膜免疫。魚類嗅覺感覺神經(jīng)元作為雙極性感覺神經(jīng)，從基底層延伸到上皮細(xì)胞的頂端區(qū)域。黏膜頂端的嗅覺感覺神經(jīng)元檢測(cè)到水中的氣味和抗原信號(hào)后，將信號(hào)向基底層投射，嗅神經(jīng)軸突在基底層中聚集，再延伸投射到嗅球作進(jìn)一步信息加工。該過程在斑馬魚和斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus punctatus)嗅覺感受器細(xì)胞類型和功能的研究中被闡釋[25-26]。

神經(jīng)元可能積極參與并整合到魚類的黏膜免疫反應(yīng)中。Sepahi 等[27]證明了一種神經(jīng)-免疫互作機(jī)制，即嗅覺器官中隱窩神經(jīng)元細(xì)胞表面表達(dá)的原肌球蛋白受體激酶A (TrkA)可與病毒糖蛋白產(chǎn)生相互作用，從而介導(dǎo)抗病毒反應(yīng)，破壞該相互作用，則足以阻斷神經(jīng)元活化和鼻腔抗病毒免疫應(yīng)答。可見硬骨魚嗅覺感覺神經(jīng)元作為病原的第一接觸者，在鼻-中樞神經(jīng)系統(tǒng)(nasal-CNS axis)協(xié)同抗病毒免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能[28]。由此可以預(yù)測(cè)，神經(jīng)-免疫相互作用可能同樣普遍存在于魚類其他黏膜部位，抗原觸發(fā)的快速神經(jīng)元反應(yīng)對(duì)魚類黏膜免疫的激活存在重要影響。未來，魚類嗅神經(jīng)-免疫領(lǐng)域具備較為突出的研究前景，魚類NALT 中的免疫細(xì)胞與相鄰的嗅覺感覺神經(jīng)元之間獨(dú)特的合作機(jī)制有待被揭示，嗅覺器官局部的 “神經(jīng)-免疫” 通訊微環(huán)境值得深入研究。

3 魚類NALT 的免疫應(yīng)答

3.1 魚類NALT 的免疫細(xì)胞與分子網(wǎng)絡(luò)

在高等動(dòng)物中，NALT 是濾泡相關(guān)上皮(FAE)、高內(nèi)皮小靜脈生發(fā)中心、抗原遞呈細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞富集區(qū)組成的有機(jī)系統(tǒng)。人類(Homo sapiens) O-NALT 包括Waldeyer 氏環(huán)，其由3 種扁桃體排列成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，即位于舌根的舌扁桃體以及位于鼻咽頂后壁的腺樣體和腭扁桃體[14]。小鼠(Mus musculus)位于鼻咽導(dǎo)管兩側(cè)的成對(duì)淋巴組織結(jié)構(gòu)在功能上被認(rèn)為與人類的Waldeyer 氏環(huán)相當(dāng)[29]。學(xué)者鑒定出大鼠(Rattus norvegicus)與新西蘭兔(Oryctolagus cuniculus)NALT 中M 細(xì)胞(微褶皺細(xì)胞，microflod cells)特異性表面標(biāo)記物，并證明其與腸派爾集合淋巴結(jié)(Peyer patch)中M 細(xì)胞功能相似，可主動(dòng)攝取腔內(nèi)顆粒抗原，從而啟動(dòng)免疫反應(yīng)初始步驟[30-31]。NALT 中的抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting cells，APCs)，包括樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)和巨噬細(xì)胞，對(duì)誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)黏膜免疫反應(yīng)至關(guān)重要?？扇苄钥乖纱┻^鼻黏膜，在巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞作用下被遷徙到淋巴結(jié)。而顆粒狀抗原則通過M 細(xì)胞攝取后轉(zhuǎn)運(yùn)至下方的免疫細(xì)胞，并可被引流到淋巴結(jié)得到進(jìn)一步加工與處理[32-34]。

在高等動(dòng)物中，NALT 免疫細(xì)胞與分子組成被闡釋地較為清晰，但硬骨魚NALT 的免疫組分及功能存在較大的研究空缺。已知魚類NALT 由彌漫性的淋巴細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)組成，其中IgT+B 細(xì)胞在虹鱒NALT 中占B 細(xì)胞總數(shù)的51.5%，IgM+B 細(xì)胞占比為48.5%。相較于存在于固有層的腸道B細(xì)胞，以上兩種B 細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)主要存在于虹鱒的嗅上皮層內(nèi)，在鼻黏膜上皮頂端區(qū)域觀察到多聚免疫球蛋白受體(pIgR)富集現(xiàn)象[8]。細(xì)菌熒光原位雜交結(jié)果顯示，大量的共生菌在虹鱒鼻腔黏液中定殖，這些共生菌被sIgM、sIgT 和sIgD 包裹，學(xué)者推測(cè)嗅覺器官中IgM+、IgT+和IgD+B 細(xì)胞的組成比例在很大程度上被鼻腔黏膜屏障所獨(dú)有的抗原環(huán)境所塑造[8]。虹鱒鼻腔嗅板外側(cè)富含杯狀細(xì)胞[8]，而杯狀細(xì)胞分泌的黏蛋白可有效抑制黏膜病原微生物的繁殖與侵染。值得注意的是，CD8α+T 細(xì)胞和MHC Ⅱ+細(xì)胞在虹鱒嗅板的黏膜上皮頂端聚集，彌散分布在神經(jīng)上皮區(qū)域附近，推測(cè)由于黏膜上皮頂端CCL19、ICAM-1 和VCAM-1的表達(dá)高于神經(jīng)上皮，CD8α+T 細(xì)胞和MHC Ⅱ+細(xì)胞被此類趨化因子和黏附因子招募并滯留在嗅板頂端局部[35]。另外MHC Ⅱ+細(xì)胞還特異性分布在神經(jīng)上皮外側(cè)臨近空腔處，特殊的分布使MHCⅡ+細(xì)胞得以快速獲取鼻腔抗原[35]，推測(cè)其可能像哺乳動(dòng)物樹突狀細(xì)胞一樣將樹突結(jié)構(gòu)穿過嗅上皮延伸到鼻腔，直接采集鼻腔內(nèi)抗原，繼而快速啟動(dòng)鼻黏膜局部的免疫應(yīng)答[36]。目前，魚類NALT中尚未報(bào)道M 細(xì)胞的存在，作為鼻內(nèi)免疫后誘導(dǎo)黏膜免疫的抗原攝取的重要環(huán)節(jié)，M 細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞在魚類NALT 中的存在情況和免疫特性需進(jìn)一步研究，開發(fā)并應(yīng)用特異性抗體、凝集素等分子標(biāo)記物對(duì)NALT 抗原攝取過程開展追蹤和評(píng)估意義重大。

除了具備與鰓、腸道和皮膚等黏膜相關(guān)淋巴組織相似的免疫組分外，諸多未知的免疫細(xì)胞與分子不斷在魚類NALT 中被發(fā)現(xiàn)。例如，趨化因子作為信使，在鼻腔和全身淋巴組織之間發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的生物學(xué)作用。Sepahi 等[37]發(fā)現(xiàn)，趨化因子CK12a 是鼻黏膜免疫的重要調(diào)控因子，鼻內(nèi)接種趨化因子CK12a 重組蛋白后，可引發(fā)虹鱒嗅板固有層膨大，繼而招募CD8α+T 細(xì)胞與MHC Ⅱ+細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)。此外，虹鱒鼻內(nèi)接種傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)減毒活疫苗后，NALT 形成和功能維持所必需的CCL19 與DNA 結(jié)合抑制物2 (ID2)表達(dá)持續(xù)上調(diào)[8]。有學(xué)者通過多種形態(tài)學(xué)手段在虹彩鯊(Epalzeorhynchos frenatum)嗅覺器官中鑒定出6 個(gè)發(fā)育階段的小棒細(xì)胞(rodlet cells)[38]。而虹彩鯊鼻腔中的另外一種間充質(zhì)來源的間質(zhì)細(xì)胞——特絡(luò)細(xì)胞(telocytes)，被發(fā)現(xiàn)可與處于不同發(fā)育階段的小棒細(xì)胞建立直接接觸，從而調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶9 (MPP-9)在小棒細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)一步影響免疫細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和遷移能力[39]。由于生活環(huán)境與進(jìn)化程度的差異，魚類存在特殊而又保守的黏膜防御機(jī)制，但目前我們對(duì)魚類NALT 中復(fù)雜的免疫細(xì)胞和分子網(wǎng)絡(luò)仍缺乏全面了解。

3.2 魚類NALT 的局部免疫應(yīng)答

魚類鼻腔的開放性使得其成為病原入侵起點(diǎn)及靶器官，目前已知多種病原可通過鼻腔入侵魚體，如海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)[40]、鮰愛德華氏菌(Edwardsiella ictaluri)[41]、IHNV[42]、病毒性出血敗血癥病毒(VHSV)[43]和神經(jīng)壞死病病毒(NNV)[44]等。文獻(xiàn)表明，海豚鏈球菌和鮰遲鈍愛德華氏菌可以將魚類鼻腔作為致病的起始部位，進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)或全身感染[40-41]。為保護(hù)嗅覺器官免受水傳播病原體的侵害，魚類在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過程中形成了NALT。虹鱒NALT 積極發(fā)揮局部免疫應(yīng)答，分泌免疫球蛋白識(shí)別并包裹共生菌，從而調(diào)節(jié)鼻黏膜菌群。利用特異性抗體對(duì)分離的鼻腔細(xì)菌開展免疫熒光分析， 發(fā)現(xiàn)66%的鼻腔細(xì)菌被黏膜免疫球蛋白包裹，在被包裹的細(xì)菌中，IgM 與IgT 包裹菌均占16%，剩余34%的細(xì)菌由IgM 和IgT 雙重包裹[8]。與嗅覺器官存在顯著差異，虹鱒腸道和皮膚黏膜大多數(shù)共生菌被IgT 包裹[45-46]，這說明魚類嗅覺器官中，可能存在不同于其他黏膜部位的細(xì)菌群落，后期需結(jié)合鼻腔局部免疫應(yīng)答情況分析NALT 與共生菌的動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)。

作為嗅覺器官的第一道防線，NALT 可產(chǎn)生針對(duì)特定抗原的免疫響應(yīng)。柱狀黃桿菌(Flavobacterium cloumnare)和多子小瓜蟲(Ichthyophthirius multifiliis)浸泡感染后，虹鱒嗅覺器官均可檢測(cè)到明顯的組織病理改變和局部適應(yīng)性免疫[47-48]，其中IgT+B 細(xì)胞快速響應(yīng)并增殖，在鼻腔黏液檢測(cè)出柱狀黃桿菌與IgT 的特異性反應(yīng)，這些結(jié)果證實(shí)了魚類NALT 與其他MALTs 功能相似，通過專用的黏膜免疫球蛋白的抗體庫在魚類黏膜表面發(fā)揮免疫防御作用。虹鱒嗅覺器官IgM+和IgT+B細(xì)胞抗體庫(antibody repertoire)在個(gè)體之間存在較大的異質(zhì)性，但與脾臟相比，嗅覺器官B 細(xì)胞抗體庫總體上規(guī)模較小，IgM 和IgT 的多樣性有限，以少數(shù)擴(kuò)增的克隆型為主[49]。虹鱒NALT 的IgM庫主要偏向于1 個(gè)或2 個(gè)免疫球蛋白重鏈可變基因(IGHV)家族，而IgT 庫則略顯多樣化，體現(xiàn)了微生物對(duì)B 細(xì)胞庫多樣性不可忽視的塑造作用，在這一點(diǎn)上，NALT 中IgM 和IgT 庫顯示出與人類和小鼠腸道黏膜IgM 和IgA 庫相似的特征[50-51]。NALT 可緩沖病原對(duì)嗅覺器官的影響，對(duì)鼻黏膜穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要。鯉(Cyprinus carpio)在感染鯉春病毒血癥病毒(SVCV)后，轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示，NALT 中多種免疫基因表達(dá)上調(diào)，病毒感染和繼發(fā)細(xì)菌感染的相關(guān)信號(hào)通路開啟，最終NALT 和微生物群之間的動(dòng)態(tài)相互作用促進(jìn)嗅覺器官達(dá)到新的穩(wěn)態(tài)[52]。

4 魚類鼻黏膜疫苗接種的研究進(jìn)展

4.1 鼻內(nèi)接種疫苗的優(yōu)勢(shì)

學(xué)者很早便意識(shí)到，鼻內(nèi)免疫是誘導(dǎo)高等動(dòng)物黏膜免疫的一種有效途徑[53-54]，在所有已知的黏膜接種策略中，鼻內(nèi)接種疫苗同時(shí)可能是產(chǎn)生全身特異性免疫應(yīng)答最有效的途徑。首先，高等脊椎動(dòng)物鼻黏膜表面具有大量纖毛，表面積大，上皮層薄，含豐富微血管，可保證疫苗被快速吸收。同時(shí)，由于鼻黏膜高度血管化，其可在物理、化學(xué)或病原刺激下迅速改變血管的通透性，因此嗅覺器官與體液循環(huán)的解剖聯(lián)系比其他黏膜更為緊密[33-34,55]，這可能導(dǎo)致免疫應(yīng)答后，淋巴細(xì)胞能被快速地募集到鼻黏膜局部。值得注意的是，與傳統(tǒng)注射法相比，鼻內(nèi)接種具備無創(chuàng)性的優(yōu)勢(shì)。鼻腔非酸性環(huán)境，可降解疫苗的酶含量和黏膜表面積遠(yuǎn)低于消化道等黏膜部位，疫苗所需劑量顯著減少。大量臨床結(jié)果表明，鼻內(nèi)接種可影響肺部的黏膜免疫強(qiáng)度，從而有效預(yù)防肺部感染[56]，這也是流行性感冒鼻吸式疫苗研發(fā)的理論基礎(chǔ)之一。鼻吸式疫苗可產(chǎn)生與注射疫苗類似的保護(hù)作用[57]，證實(shí)了哺乳動(dòng)物鼻腔黏膜是一處良好而特殊的黏膜免疫位點(diǎn)。

在哺乳動(dòng)物中，每種黏膜相關(guān)淋巴組織都存在一定程度的區(qū)室化。學(xué)者將黏膜抗原被攝取后刺激B、T 淋巴細(xì)胞的位點(diǎn)稱作黏膜誘導(dǎo)部位/組織(inductive mucosal site/tissue)，而將效應(yīng)細(xì)胞外滲、滯留和分化并發(fā)揮免疫功能，如分泌特異性抗體的位點(diǎn)稱為黏膜效應(yīng)位點(diǎn)(effector mucosal site/tissue)。哺乳動(dòng)物中存在共同黏膜免疫系統(tǒng)(common-mucosal immune system, CMIS)，即以 一處MALT 作為誘導(dǎo)位點(diǎn)加以刺激，作為效應(yīng)位點(diǎn)的遠(yuǎn)端MALT 可被激活并做出應(yīng)答[54]，如呼腸孤病毒(reovirus)對(duì)小鼠經(jīng)鼻給藥，在小鼠呼吸道和腸道中也可檢測(cè)出呼腸孤病毒特異性IgA。不像哺乳動(dòng)物的MALTs 存在明顯分區(qū)，硬骨魚的MALTs 存在一定程度的連續(xù)性，再加上缺乏引流淋巴結(jié)和明顯的O-MALT (至今僅在虹鱒上被報(bào)道)[1,15]，因此是否存在共同黏膜免疫系統(tǒng)還有待研究，魚類黏膜免疫的誘導(dǎo)/效應(yīng)部位也有待系統(tǒng)闡釋。同時(shí)，在魚類局部黏膜刺激或接種后，能否在其他部位產(chǎn)生免疫應(yīng)答，以及產(chǎn)生免疫應(yīng)答的分子基礎(chǔ)尚不明確。

4.2 魚類鼻內(nèi)接種疫苗后的免疫應(yīng)答

在魚類疫苗和免疫學(xué)領(lǐng)域，無創(chuàng)鼻疫苗接種提供了一種新的免疫策略，現(xiàn)僅在虹鱒中有較多報(bào)道。對(duì)虹鱒開展鼻內(nèi)免疫可引發(fā)NALT 強(qiáng)烈的抗菌與抗病毒的局部免疫應(yīng)答[8]。經(jīng)IHNV 減毒活疫苗鼻內(nèi)接種后的第4 天，虹鱒NALT 中白細(xì)胞介素、干擾素、趨化因子、補(bǔ)體因子、黏蛋白、抗菌肽和toll 樣受體等參與先天免疫的基因表達(dá)發(fā)生了顯著改變，部分神經(jīng)元和嗅覺相關(guān)基因的表達(dá)顯著上調(diào)，嗅板固有層擴(kuò)大，髓樣細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞浸潤(rùn)。第14 天，促炎細(xì)胞因子的表達(dá)恢復(fù)到基礎(chǔ)水平，但參與適應(yīng)性免疫反應(yīng)的基因表達(dá)水平相較于第4 天顯著提高。其中，IgM 基因表達(dá)上調(diào)最為顯著，而IgT 與IgD 的表達(dá)無顯著變化，說明在虹鱒鼻黏膜局部，IgM 發(fā)揮重要的抗病毒作用[8]。Magadan 等[49]應(yīng)用5′ RACE 和基于深度測(cè)序的方法，探究了腹腔注射和鼻內(nèi)接種腸炎紅嘴病(enteric red mouth, ERM)滅活疫苗后虹鱒抗體庫的改變情況，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)和局部水平的免疫均可誘導(dǎo)虹鱒嗅覺器官B 細(xì)胞免疫應(yīng)答并改變抗體庫組成。腹腔注射疫苗后，NALT 中IgM庫多樣性增加，IgT 庫多樣性無顯著變動(dòng)。而在鼻內(nèi)接種疫苗后，虹鱒的脾臟和NALT 中的B 細(xì)胞庫克隆結(jié)構(gòu)改變，產(chǎn)生了不同的IgM 和IgT 庫動(dòng)態(tài)變化，其中NALT 中IgM 庫IGHV6 和IGHV11的表達(dá)量趨于增加，而IgT 庫中IGHV8 的表達(dá)量增加，并在脾臟中誘導(dǎo)了顯著的IgT 反應(yīng)。ELISA結(jié)果表明，與腹腔注射相比，ERM 疫苗鼻內(nèi)接種引起的特異性IgM 全身的抗體反應(yīng)較弱[49]。以上研究結(jié)果說明了在鼻內(nèi)接種疫苗后，NALT 可發(fā)揮以免疫球蛋白為基礎(chǔ)的特異性免疫應(yīng)答，然而，NALT 局部免疫應(yīng)答的細(xì)胞與分子機(jī)制仍不明晰，鼻內(nèi)接種對(duì)魚體系統(tǒng)免疫及可能存在的共同黏膜免疫的誘導(dǎo)規(guī)律仍需進(jìn)一步研究。

4.3 魚類疫苗鼻內(nèi)接種的免疫保護(hù)效果

鼻內(nèi)接種可發(fā)揮理想的免疫保護(hù)作用。數(shù)據(jù)表明，鼻內(nèi)注射與傳統(tǒng)肌肉注射的免疫保護(hù)效果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，虹鱒鼻內(nèi)接種疫苗后的存活率與對(duì)照組(未暴露于病毒)相似，鼻內(nèi)接種ERM 滅活疫苗后第7 天的存活率大于92%，遠(yuǎn)高于未接種疫苗組60%存活率，在第28 天時(shí)，鼻內(nèi)接種組得到100%的免疫保護(hù)效果，可有效預(yù)防腸炎紅嘴病[8]。另外，分別在鼻內(nèi)接種和肌肉接種IHNV 減毒活疫苗6 個(gè)月后對(duì)虹鱒開展IHNV 攻毒，測(cè)得鼻內(nèi)免疫組累積死亡率為58%，肌肉免疫組的累積死亡率為72%，兩組累積死亡率均顯著低于未接種疫苗的對(duì)照組(97%)，證明鼻內(nèi)接種疫苗可產(chǎn)生長(zhǎng)期免疫保護(hù)效果[58]。另外，分別在鼻內(nèi)接種和腹腔接種滅活的ERM 菌液6 個(gè)月后對(duì)虹鱒開展魯氏耶爾森菌(Yersinia ruckeri)攻毒，兩組的累積死亡率分別為63%和23%。相較于腹腔免疫，鼻內(nèi)免疫的保護(hù)效果較差，這可能由于鼻內(nèi)接種疫苗量未達(dá)到最佳保護(hù)抗原劑量從而導(dǎo)致抗原刺激不足[58]，而最佳保護(hù)抗原劑量不明確是魚類黏膜疫苗設(shè)計(jì)面臨的關(guān)鍵挑戰(zhàn)之一，有待進(jìn)一步研究。此外，為評(píng)價(jià)不同生長(zhǎng)階段魚類的鼻內(nèi)免疫效果，研究人員選取孵化后70、30 和24 d的幼齡虹鱒，鼻內(nèi)注射IHNV 減毒活疫苗和ERM滅活疫苗，結(jié)果顯示，孵化后70、30 和24 d 虹鱒在IHNV攻毒后的存活率分別為95%、100%和97.5%；在魯氏耶爾森菌攻毒后存活率分別為82.5%、87.5%和77.5%[59]。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了虹鱒鼻內(nèi)疫苗接種的可行性和有效性，提示在幼齡魚上及時(shí)鼻內(nèi)接種減毒活疫苗，可降低因病死亡率。

考慮到生產(chǎn)實(shí)際中，養(yǎng)殖魚類可能同時(shí)感染多種病原，有學(xué)者使用兩種病原的多價(jià)疫苗，對(duì)虹鱒單鼻腔/雙鼻腔分別開展鼻內(nèi)接種[60]。將IHNV和ERM 疫苗混勻接種至虹鱒雙鼻孔后，檢測(cè)到與單種疫苗接種單鼻孔時(shí)相似的免疫保護(hù)作用。嘗試將IHNV 疫苗接種到虹鱒左鼻孔，ERM 疫苗接種到右鼻孔，得到了優(yōu)于先前兩組的良好效果[60]。推測(cè)硬骨魚雙鼻腔分別接種異種疫苗可能觸發(fā)協(xié)同作用，提高免疫保護(hù)效果，是一種新穎而有效的魚類疫苗接種策略。

鑒于嗅覺器官中神經(jīng)元和NALT 存在復(fù)雜的 “神經(jīng)-免疫” 相互作用，開展鼻內(nèi)接種疫苗對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的安全性評(píng)估十分關(guān)鍵。減毒活疫苗，尤其如IHNV 這類嗜神經(jīng)病毒，可通過嗅球抵達(dá)大腦，破壞宿主的神經(jīng)系統(tǒng)[28,43]。盡管鼻黏膜是許多抗原進(jìn)入中樞神經(jīng)的途徑，但嗅覺器官NALT 被證明可有效清除抗原，從而保護(hù)魚類中樞神經(jīng)系統(tǒng)。虹鱒初次經(jīng)鼻接種IHNV 減毒活疫苗后，至少4 d 仍可在嗅覺器官中檢測(cè)到抗原，隨后NALT 通過多種機(jī)制清除剩余抗原，例如免疫細(xì)胞浸潤(rùn)后攝取抗原。然而，相較于初次免疫，二次免疫4 d 后，83.3%的虹鱒嗅覺器官中未檢出IHNV，說明鼻內(nèi)免疫已觸發(fā)局部免疫記憶，從而快速清除抗原[61]，上述研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了魚類鼻內(nèi)疫苗接種的安全性。

5 魚類NALT 研究及鼻內(nèi)疫苗接種的挑戰(zhàn)與意義

魚類黏膜免疫應(yīng)答機(jī)制是國(guó)際前沿科學(xué)問題和熱點(diǎn)問題。鼻黏膜相關(guān)淋巴組織是魚類黏膜免疫的重要組成部分，近年來逐漸被重視，不斷深入的研究揭示了NALT 是保守而高效的局部黏膜免疫位點(diǎn)，在細(xì)菌、病毒和寄生蟲感染后可產(chǎn)生快速而精準(zhǔn)的免疫應(yīng)答。相較于高等脊椎動(dòng)物，魚類NALT 的研究存在理論基礎(chǔ)薄弱、研究對(duì)象局限(僅虹鱒等極少數(shù)魚類)、細(xì)胞與分子機(jī)制不明等問題。相較于消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)，我們對(duì)魚類嗅覺系統(tǒng)的黏膜免疫研究尚顯不足，對(duì)魚類NALT 復(fù)雜的細(xì)胞和分子網(wǎng)絡(luò)仍缺乏全面了解，對(duì)魚類鼻黏膜抗原攝取和免疫球蛋白分泌過程及其效應(yīng)機(jī)制知之甚少。為彌補(bǔ)研究短板，以鼻黏膜相關(guān)淋巴組織為模型，闡明魚類MALTs 的局部免疫應(yīng)答機(jī)制，對(duì)于提高魚類MALTs 的認(rèn)知維度至關(guān)重要。從進(jìn)化角度而言，硬骨魚生存在相較于陸生動(dòng)物更為復(fù)雜的水環(huán)境中，低等脊椎動(dòng)物硬骨魚彌散性NALT 與高等脊椎動(dòng)物組織性NALT 在結(jié)構(gòu)與功能上存在聯(lián)系與差異。闡釋NALT 由彌散性向組織性結(jié)構(gòu)的進(jìn)化過程，以及環(huán)境變化對(duì)其進(jìn)化程度的影響，對(duì)于物種起源研究具有重大意義。

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)高密度、集約化、規(guī)模化高速發(fā)展，病害已成為產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的重大挑戰(zhàn)。魚類接種疫苗既可以防控水產(chǎn)病害發(fā)生，又可以減少生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)和水產(chǎn)品食品安全等問題[62]。魚類疫苗接種策略屬于疫苗學(xué)領(lǐng)域的重要范疇，典型的疫苗接種方式包括肌肉注射、腹腔注射和浸泡免疫。隨著魚類鼻內(nèi)接種逐漸進(jìn)入公眾視野，并從高效性、安全性和適用性等多種角度驗(yàn)證了鼻內(nèi)接種疫苗的可行性，為深入開展鼻內(nèi)免疫接種策略及效果研究，以及新型黏膜疫苗的設(shè)計(jì)與研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

嗅覺器官中神經(jīng)上皮與黏膜上皮交錯(cuò)分布，NALT 中B 細(xì)胞、T 細(xì)胞、黏液細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞等免疫細(xì)胞與神經(jīng)元存在微妙的空間聯(lián)系，使得鼻內(nèi)接種后NALT 可產(chǎn)生強(qiáng)烈的局部免疫應(yīng)答，通過神經(jīng)-免疫互作影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，繼而誘發(fā)固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的全身響應(yīng)。硬骨魚鼻腔是一對(duì)溝通外環(huán)境的獨(dú)立腔室，不與呼吸系統(tǒng)相連，因此，以嗅覺器官為模型，開展鼻內(nèi)接種疫苗，可揭示局部與全身免疫應(yīng)答的聯(lián)系。以往的部分研究結(jié)果表明，鼻內(nèi)接種疫苗，可誘發(fā)脾臟及全身黏膜組織抗體庫的變化，這提示魚類中幾種MALTs 間可能存在密切的物質(zhì)交流，MALTs 與系統(tǒng)免疫間可能通過某些未知機(jī)制溝通。哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在的共同黏膜免疫系統(tǒng)在硬骨魚中是否存在以及存在形式如何，需要進(jìn)一步探究。相信未來隨著MALTs 中淋巴細(xì)胞遷移、分化以及功能的研究不斷深入，魚類 “共同黏膜免疫系統(tǒng)” 的存在形式及協(xié)調(diào)機(jī)制將被說明。

綜上所述，魚類NALT 是保守而又特殊的黏膜免疫相關(guān)淋巴組織，病原刺激NALT 可觸發(fā)嗅覺器官局部和魚體系統(tǒng)性免疫應(yīng)答。魚類NALT研究起步較晚，其中細(xì)胞與分子組成和免疫應(yīng)答機(jī)制尚不清楚，鼻內(nèi)接種疫苗后局部與系統(tǒng)免疫應(yīng)答情況仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。開展魚類NALT 免疫應(yīng)答的細(xì)胞與分子機(jī)制研究，無論對(duì)闡明魚類黏膜免疫防御機(jī)制，還是對(duì)新型黏膜疫苗的設(shè)計(jì)和應(yīng)用，都至關(guān)重要。

（作者聲明本文無實(shí)際或潛在的利益沖突）