牛東紅， 王宏蕾， 李家樂,3*

(1. 上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306；2. 上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306；3. 上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306)

大多數(shù)海洋貝類終生生活在受各種理化因子影響的復(fù)雜海洋環(huán)境中，其中鹽度對海洋貝類的生存、發(fā)育和繁殖至關(guān)重要[1-2]。海洋貝類對鹽度的耐受能力不同，可以將其劃分為狹鹽性和廣鹽性貝類[3]。典型的狹鹽性貝類，如鮑 (Haliotis) 、紫石房蛤 (Saxidomus purpuratus) 、西施舌 (Mactra antiquata) 和合浦珠母貝(Pinctada fucata) 等，對鹽度的變化較為敏感，適合鹽度相對穩(wěn)定的環(huán)境。而廣鹽性貝類，如縊蟶 (Sinonovacula constricta) 、近江牡蠣 (Crassostrea rivularis) 、菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum) 等，對鹽度脅迫的耐受能力強，適合鹽度波動較大的環(huán)境。廣鹽性貝類能夠快速進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)，以適應(yīng)短暫的鹽度脅迫，而狹鹽性貝類由于其滲透調(diào)節(jié)能力較弱，在受到鹽度脅迫時，往往會出現(xiàn)心率紊亂、足部伸長、活動遲緩和對外界刺激反應(yīng)遲鈍等現(xiàn)象[4-5]。狹鹽性和廣鹽性之間并沒有明確的界限，適宜的鹽度能夠促進(jìn)海洋貝類的生長發(fā)育，鹽度一旦超出適應(yīng)范圍就會阻礙生長，使其出現(xiàn)各種應(yīng)激性反應(yīng)，造成組織損傷甚至死亡[6-8]。因此，絕大部分未經(jīng)馴化或改良的海洋貝類都不具備長期適應(yīng)鹽度脅迫的能力，在長時間的鹽度脅迫中往往會大量死亡[9]。部分廣鹽性貝類，在經(jīng)過馴化和改良后，能夠增強其對鹽度脅迫的適應(yīng)能力。例如，向鹽堿水中添加含有K+的肥料有助于提高紫貽貝 (Mytilus edulis) 幼蟲的滲透調(diào)節(jié)能力，使其更好地適應(yīng)內(nèi)陸高鹽水環(huán)境[10]。經(jīng)過低鹽馴化后縊蟶的滲透壓調(diào)節(jié)、能量代謝和免疫反應(yīng)能力增強，能夠較長時間地適應(yīng)低鹽環(huán)境[11-12]。廣鹽性貝類對鹽堿水中的堿度以及極端Na+/K+和Ca2+/Mg2+濃度比具有較強的耐受性，對于這一類貝類的研究有助于深入解析海洋貝類適應(yīng)鹽度脅迫的機(jī)制[13-15]。目前，很多研究從不同角度探討了這一機(jī)制。研究表明，海洋貝類適應(yīng)鹽度脅迫是由多種生物學(xué)過程介導(dǎo)，包括行為變化、滲透調(diào)節(jié)、能量代謝和免疫反應(yīng)等[16-18]。大部分海洋貝類在受到急性鹽度脅迫時會緊閉外殼，關(guān)閉閥門、進(jìn)水管和出水管，與外界環(huán)境隔絕，以在短時間內(nèi)抵御急性鹽度變化[19]。之后，海洋貝類通過調(diào)節(jié)體內(nèi)一系列的生理活動，例如，加快無機(jī)離子轉(zhuǎn)運、增加內(nèi)分泌激素、增強能量代謝以及激活抗氧化和細(xì)胞抗凋亡系統(tǒng)等，平衡細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，維持細(xì)胞正常的生理功能，以應(yīng)對外界鹽度脅迫[20-21]。本文綜述了有關(guān)滲透調(diào)節(jié)、能量代謝調(diào)控、免疫調(diào)控以及組學(xué)技術(shù)在海洋貝類適應(yīng)鹽度脅迫機(jī)制中的研究和應(yīng)用，為進(jìn)一步探究海洋貝類的鹽度耐受機(jī)制，開發(fā)鹽堿水等極端鹽度水域中的貝類養(yǎng)殖業(yè)提供理論支持。

1 海洋貝類的滲透調(diào)節(jié)機(jī)制

1.1 無機(jī)滲透調(diào)節(jié)

海洋貝類的滲透調(diào)節(jié)方式為變滲型，體內(nèi)滲透壓保持在接近外界滲透壓的狀態(tài)，其中無機(jī)離子和離子轉(zhuǎn)運蛋白在滲透調(diào)節(jié)過程中起著主導(dǎo)作用[22]。通常細(xì)胞外液的滲透壓是由Na+和Cl-決定，細(xì)胞內(nèi)液滲透壓由K+決定。當(dāng)受到外界滲透壓力時，Na+和K+電壓門控通道能夠在毫秒內(nèi)激活，細(xì)胞內(nèi)外Na+、Cl-、K+和Ca2+等無機(jī)離子的含量會迅速發(fā)生變化，參與維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡，以及多種生物學(xué)過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，與細(xì)胞膜上的離子轉(zhuǎn)運蛋白共同構(gòu)成了復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)外滲透調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[23]。在這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，Na+、Cl-、K+通過含量變化參與調(diào)節(jié)細(xì)胞膜相關(guān)受體的表達(dá)，而Ca2+則主要起著信號傳導(dǎo)作用[24]。在鹽度脅迫下，紫貽貝鰓組織中的鈣激活，K+通道基因、Ca2+通道基因和Cl-通道基因表達(dá)量均顯著上調(diào)[25-26]。Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因表達(dá)上調(diào)可誘導(dǎo)鈣門控K+通道的活性升高，并且Ca2+能夠與細(xì)胞膜表面的磷酸鹽結(jié)合，參與調(diào)控維持細(xì)胞體積有關(guān)的膜活性，同時作為第二信使與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM) 中的受體相互作用，增強對Na+、Cl-、K+的轉(zhuǎn)運能力[26-27]。無機(jī)離子的轉(zhuǎn)運伴隨著離子轉(zhuǎn)運蛋白活性的改變，其中以鰓組織中的變化最為顯著[28]。常見的幾種離子轉(zhuǎn)運蛋白，Na+-K+-ATPase (NKA) 、V-H+-ATPase(V-ATPase) 和碳酸酐酶(carbonic anhydrase，CA) 等被證實在滲透調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用[29-31]。高鹽脅迫下，縊蟶血液中Na+、K+、Cl-濃度先升高后穩(wěn)定，低鹽脅迫下Na+、K+、Cl-濃度先降低后穩(wěn)定。CA 的表達(dá)在低鹽(鹽度5) 和高鹽脅迫(鹽度35) 時升高，表明CA 能夠在縊蟶適應(yīng)鹽度脅迫過程中參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外Na+、K+、Cl-的濃度[32]。紫石房蛤在急性低鹽脅迫(鹽度15) 下，NKA 酶活性升高，其血淋巴中無機(jī)離子的濃度會隨NKA 酶活性的變化而發(fā)生改變[33]。在皺紋盤鮑 (H.discus hannai)中，NKA 酶活性會隨鹽度的升高而增加，隨鹽度的降低而降低，與NKAα和β亞基基因的表達(dá)情況相對應(yīng)[34]。NKA基因的表達(dá)會受到腺苷酸環(huán)化酶催化ATP 生成的環(huán)腺苷酸(cAMP) 的影響，其cAMP 濃度與NKA 酶的活性成正相關(guān)[35]。除了離子轉(zhuǎn)運蛋白外，海洋貝類的胞內(nèi)蛋白和非離子轉(zhuǎn)運膜蛋白是參與滲透調(diào)節(jié)的第二類蛋白，例如，水通道蛋白(aquaporin，AQPs) 、細(xì)胞骨架肌動蛋白(actin cytoskeleton) 和微管蛋白(tubulin) 等[36]。水通道蛋白家族具有相同NPA 結(jié)構(gòu)域，以四聚體形式存在于細(xì)胞膜表面，是水分子跨膜運輸進(jìn)出細(xì)胞的重要通道[37]。在鹽度脅迫下，海洋貝類各組織中的水通道蛋白會顯著表達(dá)[38-39]。低鹽脅迫(鹽度3.5) 下縊蟶各組織中編碼AQP1、AQP8 和AQP11 基因的表達(dá)顯著升高，而高鹽脅迫(鹽度35) 只有AQP2 和AQP11 的表達(dá)增加，縊蟶能夠通過不同水通道蛋白之間的相互協(xié)調(diào)作用，共同維持著細(xì)胞內(nèi)外的水穩(wěn)態(tài)[40]。與此同時肌動蛋白和微管蛋白能夠與水通道蛋白共同參與維持細(xì)胞體積，對細(xì)胞骨架進(jìn)行修復(fù)，維持細(xì)胞正常的生理功能[41]。

1.2 有機(jī)滲透調(diào)節(jié)

在鹽度脅迫下，游離氨基酸(free amino acids,FAA) 的合成代謝與無機(jī)離子轉(zhuǎn)運共同參與細(xì)胞內(nèi)外的滲透調(diào)節(jié)[42]。其中，?；撬崮軌騾⑴c包括滲透調(diào)節(jié)和能量代謝在內(nèi)的多種生物學(xué)過程，在游離氨基酸中占比較高[43-44]。牛磺酸合成的主要途徑是通過半胱氨酸雙加氧酶(cysteine dioxygenase，CDO) 將L-半胱氨酸的巰基氧化為3-磺基-1-丙氨酸，之后通過脫羧酶(cysteine sulfinic acid, CASD)的作用生成亞?；撬幔詈罄门；撬崦摎涿笇⑵溲趸膳；撬醄45]。在高鹽脅迫時，?；撬峥梢宰鳛榈孜锉谎趸?，增強線粒體合成ATP 以及呼吸鏈(electron transport chain) 傳遞電子的能力，增強能量代謝[46]。牛磺酸獲得的另一途徑是通過?；撬徂D(zhuǎn)運體(taurine transporter，TAUT) 對外源性牛磺酸進(jìn)行吸收[47]。在鹽度脅迫下，添加外源性牛磺酸有助于增強長牡蠣 (Crassostrea gigas) 的滲透調(diào)節(jié)能力，提高長牡蠣對鹽度脅迫的耐受能力[48]。縊蟶幼貝在適應(yīng)低鹽和高鹽脅迫時，?；撬岷蛠喤；撬岷铣赊D(zhuǎn)運相關(guān)的CSAD和TAUT基因表達(dá)均顯著上調(diào)，表明?；撬嵩诤Ｑ筘愵愡m應(yīng)鹽度脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用[49]。

除?；撬嵬?，其他游離氨基酸在海洋貝類的滲透調(diào)節(jié)過程中同樣發(fā)揮著調(diào)控作用[50]。鹽度脅迫會影響游離氨基酸的種類和含量，其中最主要的游離氨基酸有丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸和脯氨酸[51]。丙氨酸和谷氨酸是參與調(diào)節(jié)軟體動物細(xì)胞體積的重要物質(zhì)，可以通過還原胺化反應(yīng)瞬間產(chǎn)生胺，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡[52]。此外，丙氨酸和谷氨酸還可以參與像三羧酸循環(huán)(TCA) 、糖代謝以及碳水化合物和脂質(zhì)代謝等產(chǎn)能過程[53]。甘氨酸可以通過代謝降解為胺和二氧化碳，還可以通過絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(erine hydroxymethyltransferase, SHMT) 途徑轉(zhuǎn)換成絲氨酸，參與滲透調(diào)節(jié)[54]。在低鹽脅迫下，砂海螂 (Mya arenaria oonogai) 體內(nèi)共有12 種游離氨基酸的含量發(fā)生較為明顯的變化，甘氨酸是其體內(nèi)最為豐富的游離氨基酸，變化最顯著，占比約60%，在鹽度變化時(鹽度5～15) ，丙氨酸的濃度會迅速升高，在其他游離氨基酸中占比最高[55]。脯氨酸的合成代謝主要是通過D-P5C 合成酶(P5CS) 和P5C還原酶(P5CR) 的2 次連續(xù)還原后，通過D1-吡咯啉-5-羧酸鹽(D-1-P5C) 合成。脯氨酸的降解則是通過脯氨酸脫氫酶(PHD) 和P5C 脫氫酶(P5CHD) 的催化作用來進(jìn)行，能夠促進(jìn)能量代謝等生物學(xué)過程[56]。在高鹽脅迫下，控制脯氨酸合成的P5CS基因上調(diào)，鰓組織中脯氨酸的積累，是縊蟶適應(yīng)高鹽脅迫的重要方式[57]。

2 海洋貝類的能量代謝調(diào)控

海洋貝類在適應(yīng)鹽度脅迫時需要提高能量代謝以滿足細(xì)胞內(nèi)外無機(jī)離子和小分子有機(jī)物的轉(zhuǎn)運合成，與ATP 合成和分解有關(guān)的產(chǎn)能過程增強。研究發(fā)現(xiàn)，鹽度脅迫會顯著提高長牡蠣的呼吸代謝水平，在低鹽和高鹽度脅迫下，耗氧率(oxygen consumption rate, OR) 顯著升高，其體內(nèi)與呼吸代謝相關(guān)的酶活性升高，糖酵解功能增強[58-59]。通常與能量代謝相關(guān)的過程有糖酵解、三羧酸循環(huán)以及電子傳遞鏈等[60]。在鹽度脅迫下，編碼AMPK 活 化 蛋 白 激 酶 (AMP-activated protein kinase) 和磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK) 的 基 因 會 顯 著上調(diào)[61]。AMPK 是細(xì)胞中的能量感受器，可以快速調(diào)控與產(chǎn)生ATP 相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這些通路包括脂肪酸氧化和自噬等[62]。同時AMPK 可通過直接磷酸化這些過程中的關(guān)鍵酶，或者通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子抑制需要消耗ATP 的生物合成等過程，為滲透調(diào)節(jié)提供能量[63-64]。在合浦珠母貝、長牡蠣和縊蟶等的研究中均發(fā)現(xiàn)了編碼該酶的基因在鹽度脅迫下的表達(dá)顯著上調(diào)，伴隨細(xì)胞內(nèi)葡萄糖含量會顯著降低，且在高鹽脅迫下消耗的葡萄糖量要遠(yuǎn)高于低鹽脅迫[65-67]。而PEPCK 是催化糖異生過程中不可缺少的酶，在鹽度脅迫下，通過增加該酶在細(xì)胞內(nèi)的含量，增強糖異生過程，促進(jìn)非碳水化合物(乳酸、丙酮酸、甘油、生糖氨基酸等) 轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟牵瑸闈B透調(diào)節(jié)提供能量，是海洋貝類適應(yīng)鹽度脅迫時能量代謝中重要的調(diào)控方式[68]。除了糖酵解和糖異生途徑，在自然環(huán)境中，低鹽脅迫還能夠激活FoxO 信號通路和催產(chǎn)素信號通路中相關(guān)基因的表達(dá)，這兩種信號通路都是胰島素信號傳導(dǎo)和葡萄糖代謝過程中的重要調(diào)節(jié)因子，并且FoxO 轉(zhuǎn)錄因子還能夠調(diào)節(jié)貝類抗氧化防御相關(guān)基因的表達(dá)，對于海洋貝類在受到鹽度脅迫時細(xì)胞中的能量穩(wěn)態(tài)和活性氧清除過程中起著重要的調(diào)控作用[69-70]。在增強能量代謝的同時，海洋貝類也會對機(jī)體中各組織生長發(fā)育所需的能量進(jìn)行重新分配。近江牡蠣在鹽度20～35，翡 翠 貽 貝 (Perna viridis) 和 波 紋 巴 非 蛤(Paphia undulata) 在鹽度為30～35，其貝殼鈣化率隨鹽度的升高而降低[71]。貽貝在受到低鹽脅迫，其貝殼鈣化速率和機(jī)體內(nèi)各個組織生長發(fā)育速率明顯減緩[72]。綜上，海洋貝類通過增強能量代謝和改變能量分配方式來適應(yīng)鹽度脅迫，從而導(dǎo)致海洋貝類出現(xiàn)生長緩慢，甚至是逆生長等現(xiàn)象。

3 海洋貝類的免疫反應(yīng)

3.1 抗氧化反應(yīng)

海洋貝類在受到鹽度脅迫時，其自身免疫水平會發(fā)生顯著改變[73-75]。其中能量代謝水平和方式的改變，會加速細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS) 的積累[76-77]。過量的ROS 會氧化細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸，對細(xì)胞造成不可逆的損害[78]。由于海洋貝類缺乏特異性免疫細(xì)胞和抗體，其免疫反應(yīng)主要依賴于血清中的非特異性酶和效應(yīng)因子等[79]。其中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD) 、過氧化氫酶(catalase，CAT) 和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx) 等，能夠參與清除活性氧，維持細(xì)胞正常的生理功能[80]。研究發(fā)現(xiàn)，在急性低鹽脅迫下(鹽度20) ，大珠母貝 (P.maxima) 血淋巴中的SOD、GSH 的活性顯著升高，急性高鹽脅迫下(鹽度40) ，SOD、GSH 活性先升高，在48 h 后降低至對照組水平[81]?？O蟶鰓組織中SOD、CAT 和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP) 的活性在急性高鹽脅迫下(鹽度30、35)，6～12 h 顯著增加?？寡趸竿ㄟ^將活性氧轉(zhuǎn)變?yōu)樗脱鯕猓詼p小活性氧對細(xì)胞造成的損害，在鹽度脅迫下維持著細(xì)胞正常的生理功能[82]。除抗氧化酶外，一些抗氧化物質(zhì)也能夠參與其體內(nèi)的抗氧化反應(yīng)。例如，類胡蘿卜素(carotenoids，CAR) 能夠作為抗氧化劑保護(hù)華貴櫛孔扇貝 (Mimachlamys nobilis) 細(xì)胞和組織免受活性氧的損害，在低鹽脅迫下其血淋巴中CAR 含量顯著升高，CAR 能夠參與調(diào)節(jié)絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor, SPI) 基因的表達(dá)，在免疫應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[83]。因此，與抗氧化反應(yīng)相關(guān)酶和物質(zhì)的活性及含量通常是評估海洋貝類對鹽度脅迫適應(yīng)能力的重要免疫指標(biāo)，是在鹽度脅迫下維持海洋貝類細(xì)胞正常生理功能不可或缺的免疫效應(yīng)物。

3.2 細(xì)胞抗凋亡反應(yīng)

細(xì)胞凋亡是維持生物體內(nèi)細(xì)胞增殖與死亡動態(tài)平衡的重要生理過程，可分為內(nèi)源性細(xì)胞凋亡和外源性細(xì)胞凋亡[84]。半胱氨酸蛋白酶(caspase)是細(xì)胞凋亡反應(yīng)中的主要效應(yīng)物，能夠通過蛋白質(zhì)水解的方式分解大部分的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，包括細(xì)胞骨架、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和細(xì)胞核等[85]。研究發(fā)現(xiàn)，長時間的低鹽脅迫會導(dǎo)致長牡蠣血細(xì)胞的死亡率顯著增加[86]。高鹽脅迫(鹽度55) 下海灣扇貝 (Argopecten irradians) 各個組織中細(xì)胞凋亡的發(fā)生顯著增加[87]。因此海洋貝類在適應(yīng)鹽度脅迫時，與細(xì)胞抗凋亡相關(guān)的抑制因子(IAP、BCL-2和Bl-1) 會大量表達(dá)，進(jìn)而抑制Caspase的表達(dá)，同時IAP還能夠參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程，抑制細(xì)胞凋亡，為細(xì)胞修復(fù)留出時間[88-89]。在抗凋亡系統(tǒng)激活的同時，細(xì)胞內(nèi)的修復(fù)蛋白大量合成，其中熱休克蛋白(HSPs) 是合成量最高的環(huán)境脅迫響應(yīng)蛋白。根據(jù)其分子質(zhì)量和序列的同源性可以將熱休克蛋白基因分為許多家族，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HSP20、HSP40 以及HSP70 家族基因在海洋貝類受到鹽度脅迫時顯著表達(dá)[90-92]。HSPs能夠幫助細(xì)胞內(nèi)新生蛋白和異常蛋白的折疊修復(fù)[93-94]，參與細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞骨架修復(fù)、氧化還原穩(wěn)態(tài)等生物學(xué)過程，維持著細(xì)胞正常的生理功能，是海洋貝類適應(yīng)鹽度脅迫重要的胞內(nèi)修復(fù)蛋白[95-96]。

4 組學(xué)在海洋貝類適應(yīng)鹽度脅迫機(jī)制研究中的應(yīng)用

4.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在海洋貝類適應(yīng)鹽度脅迫機(jī)制研究中的應(yīng)用

轉(zhuǎn)錄組是指細(xì)胞、組織或生物體產(chǎn)生的一整套mRNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于挖掘基因功能和揭示相關(guān)生物學(xué)通路的研究中[97]。通過轉(zhuǎn)錄組分析，可以確定參與海洋貝類適應(yīng)鹽度脅迫的關(guān)鍵基因，揭示海洋貝類在鹽度脅迫下基因的表達(dá)模式和調(diào)控關(guān)系，為進(jìn)一步探究海洋貝類適應(yīng)鹽度脅迫的分子機(jī)制提供了一種有效手段。

生物體的轉(zhuǎn)錄表達(dá)具有可塑性，可塑性即單個基因在不同條件下產(chǎn)生不同的表達(dá)類型，通過基因表達(dá)的調(diào)節(jié)來適應(yīng)環(huán)境的變化[98-99]。牡蠣等海洋貝類在受到鹽度脅迫時，其轉(zhuǎn)錄組可塑性的增加可以提高對鹽度脅迫的適應(yīng)能力[100-102]。不同種類牡蠣的進(jìn)化比較分析中發(fā)現(xiàn)，耐鹽性更強的牡蠣與適應(yīng)鹽度脅迫相關(guān)的基因具有更高的進(jìn)化率及轉(zhuǎn)錄可塑性[103]。因此，較強的轉(zhuǎn)錄可塑性能夠增強海洋貝類對于鹽度脅迫的耐受能力[104]。

在海洋貝類適應(yīng)鹽度脅迫相關(guān)通路的研究中，Meng 等[66]首次利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，對長牡蠣在鹽度脅迫下的離子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)和氨基酸代謝通路進(jìn)行了總結(jié)分析，闡明了牡蠣適應(yīng)鹽度脅迫的分子途徑。Zhao 等[105]采用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(weighted gene co-expression network,WGCNA) 構(gòu)建了長牡蠣在不同鹽度脅迫時的差異基因模塊，進(jìn)一步篩選了與牡蠣適應(yīng)鹽度脅迫相關(guān)的基因，并探討了基因之間的相互作用關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，在鹽度脅迫下，與離子通道、水通道蛋白以及控制各種游離氨基酸(包括?；撬?、甘氨酸、脯氨酸和精氨酸) 代謝通路中關(guān)鍵基因的高度表達(dá)是牡蠣適應(yīng)鹽度脅迫的重要機(jī)制。但不同種類的海洋貝類對鹽度脅迫適應(yīng)的分子機(jī)制具有一定的差異(表1)。菲律賓蛤仔在受到鹽度脅迫時，顯著上調(diào)的基因主要集中在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝、物質(zhì)運輸和免疫反應(yīng)等相關(guān)通路中。在低鹽脅迫下，與糖酵解、氧化磷酸化以及精氨酸和脯氨酸代謝相關(guān)通路中的基因表達(dá)水平顯著升高[106]。

馬氏珠母貝在高鹽脅迫下，其差異表達(dá)的基因往往與糖酵解/糖異生、AMPK、β-丙氨酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等代謝通路有關(guān)[65]。奧林匹亞牡蠣 (Ostrea lurida) 在受到低鹽脅迫后，其體內(nèi)調(diào)節(jié)外套膜腔內(nèi)纖毛活動通路中的基因顯著上調(diào)，這可能會促進(jìn)鰓和外套膜中氣體與外界環(huán)境的交換，增強有氧代謝，使其能夠較長時間地抵御低鹽脅迫[110]?？O蟶在受到低鹽和高鹽脅迫時差異表達(dá)的基因集中在能量代謝、游離氨基酸的合成代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架重塑和細(xì)胞凋亡等相關(guān)通路中[49,57]。綜上，海洋貝類在適應(yīng)鹽度脅迫時的關(guān)鍵通路主要涉及離子轉(zhuǎn)運、氨基酸合成代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝以及免疫反應(yīng)，這些通路中關(guān)鍵基因的高度分化和特異性表達(dá)是海洋貝類適應(yīng)鹽度脅迫重要的分子機(jī)制。

近年來，越來越多的研究表明，非編碼RNA(ncRNA) 能夠參與水生動物適應(yīng)環(huán)境脅迫時的基因表達(dá)調(diào)控[111]。非編碼RNA 包括小RNA (miRNA) 、長鏈非編碼RNA (lncRNA) 和環(huán)狀RNA (circRNA) 。其中每個miRNA 具有對多個靶基因進(jìn)行調(diào)控的能力，同時一個基因也可能對應(yīng)著多個miRNA，miRNA 和mRNA 之間構(gòu)成了一個復(fù)雜且精細(xì)的網(wǎng)絡(luò)，能夠精準(zhǔn)地實現(xiàn)對某個基因或蛋白的調(diào)控[112]。因此，通過研究miRNA 和mRNA 之間的調(diào)控關(guān)系可以更深入地解析海洋貝類適應(yīng)鹽度脅迫機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 能夠廣泛地參與膜運輸、免疫調(diào)節(jié)、能量代謝以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程中相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[113]。長牡蠣在受到環(huán)境脅迫時miR-365 表達(dá)的顯著上調(diào)可以促進(jìn)HSP90 的表達(dá)[114]。低鹽脅迫下，長牡蠣中的miR-1984、miR-92-3p 的表達(dá)顯著上調(diào)，miR-2353、miR-183 和miR-184-3p的表達(dá)顯著下調(diào)，香港巨牡蠣 (Magallana hongkongensis) 中miR-3205 表達(dá) 顯 著 上 調(diào)，miR-2353 表達(dá)顯著下調(diào)，這些miRNA 的表達(dá)變化對牡蠣適應(yīng)鹽度脅迫中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[115]。

4.2 基因組學(xué)在海洋貝類適應(yīng)鹽度脅迫機(jī)制研究中的應(yīng)用

基因組學(xué)的研究對象是生物體內(nèi)的全部基因，通過基因組學(xué)技術(shù)可以從整體水平去研究生物體的生命系統(tǒng)及活動規(guī)律，是探究生命本質(zhì)的根本研究方法[116]?；蚪M學(xué)可以分為以全基因組測序為目標(biāo)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)和以基因功能鑒定為目標(biāo)的功能基因組學(xué)，是其他組學(xué)的基礎(chǔ)，對生命科學(xué)研究的方方面面都具有影響。

長期鹽度脅迫會導(dǎo)致海洋貝類產(chǎn)生適應(yīng)性變異，這些變異往往是基因結(jié)構(gòu)上的變異，其中基因家族的擴(kuò)張是提高海洋貝類對環(huán)境適應(yīng)能力的重要方式[117]。長期生活在潮間帶地區(qū)的牡蠣基因組中存在著與細(xì)胞修復(fù)相關(guān)的熱休克蛋白和抗凋亡蛋白等基因家族顯著擴(kuò)增的現(xiàn)象，長牡蠣基因組具有48 個IAP 家族基因，與人類基因組中的8 個相比存在顯著擴(kuò)增現(xiàn)象[118]。硬殼蛤基因組中具有159 個IAP 家族基因，且不同IAP 基因的表達(dá)方式具有明顯的分化，是目前在所有已知的后生動物基因組中IAP 家族基因擴(kuò)張最為顯著的[119]。在近江牡蠣基因組研究中發(fā)現(xiàn)，與滲透壓調(diào)節(jié)有關(guān)的溶質(zhì)載體(SLCs) 、短鏈脫氫酶(SDR) 、半胱氨酸雙加氧酶等基因家族均具有顯著擴(kuò)增的現(xiàn)象[107-108]。在夸加貽貝 (Quagga mussel) 基因組研究中發(fā)現(xiàn)，水通道蛋白基因家族的顯著擴(kuò)增能夠使其在胚胎發(fā)育時期構(gòu)成 “卵裂腔” 排出細(xì)胞內(nèi)多余的水分，這種改變可能是其從海洋環(huán)境轉(zhuǎn)向淡水環(huán)境適應(yīng)性進(jìn)化的關(guān)鍵方式[120]。在對低鹽和高鹽適應(yīng)性分化牡蠣群體的研究中發(fā)現(xiàn)，與低鹽耐受相關(guān)的氯通道蛋白(CLCN7) 、凋亡抑制因子等基因會受到環(huán)境較強的選擇作用，其基因上下游存在較大等位基因頻率差異的SNP 位點[109]?？梢?，基因家族擴(kuò)張、位點變異等基因結(jié)構(gòu)和功能上的變異，是海洋貝類適應(yīng)鹽度脅迫重要的分子基礎(chǔ)。

5 總結(jié)與展望

鹽堿水是分布于陸地區(qū)域的非海洋性咸水資源，具有高pH、高碳酸鹽堿度、離子比例失衡等特點。我國具有大量的鹽堿水資源，廣泛分布于內(nèi)陸地區(qū)，利用鹽堿水進(jìn)行水產(chǎn)養(yǎng)殖，對緩解水資源危機(jī)，改良鹽堿水環(huán)境具有重要的意義。海洋貝類通過濾食作用攝取水體中的藻類和有機(jī)碎屑，在一定程度上防治養(yǎng)殖過程中的水質(zhì)和底質(zhì)惡化等問題，并且其生物礦化對于改善鹽堿水環(huán)境中的離子比例失衡具有重要的作用。因此，開發(fā)適宜鹽堿水養(yǎng)殖的海洋貝類可以凈化水質(zhì)，提高資源利用效率，符合綠色養(yǎng)殖理念。

海洋貝類的生長、發(fā)育、繁殖以及對環(huán)境的適應(yīng)都與基因表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。隨著基因組、轉(zhuǎn)錄組等組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，使用這些技術(shù)可以更全面深入地了解海洋貝類適應(yīng)鹽度脅迫的分子機(jī)制，挖掘與適應(yīng)鹽度脅迫相關(guān)的基因、蛋白、通路以及代謝產(chǎn)物等。然而，海洋貝類適應(yīng)鹽度脅迫是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，目前的研究主要集中在生理變化以及相關(guān)基因的功能上，并未對海洋貝類的耐鹽性機(jī)制進(jìn)行深入解析，未能構(gòu)建出海洋貝類在適應(yīng)鹽度脅迫時的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因此，未來對于海洋貝類適應(yīng)鹽度脅迫的研究：一是可以重點圍繞環(huán)境耐受性較強、濾食性較強的廣鹽性貝類進(jìn)行，通過組學(xué)等技術(shù)手段進(jìn)一步挖掘功能基因家族，關(guān)鍵調(diào)控通路及關(guān)鍵調(diào)控基因，以闡明適應(yīng)性機(jī)制的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。二是采用新的研究技術(shù)和方法，例如單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組等技術(shù)在海洋貝類中的運用，以及利用CRISPR/Cas9 等基因編輯技術(shù)對關(guān)鍵基因進(jìn)行定向編輯，培育抗逆性更強的貝類品種。同時對于非編碼RNA 在海洋貝類適應(yīng)鹽度脅迫中的研究還有待深入。相信隨著技術(shù)和研究的不斷發(fā)展深入，未來將更加清晰地揭示出海洋貝類在適應(yīng)鹽度脅迫時的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，闡明貝類在鹽堿水等極端環(huán)境中的耐受性機(jī)制，為開發(fā)抗逆性較強的貝類新品種提供理論參考，對促進(jìn)鹽堿地水產(chǎn)養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的意義。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）